石蒜属植物SCoT-PCR反应体系构建及优化

建立并优化了石蒜属Lycoris植物的目标起始密码子多态性-聚合酶链式反应（SCoT-PCR）反应体系,为研究石蒜属种质资源的遗传多样性、亲缘关系及遗传改良提供新的思路。采用L25（56）正交试验和单因素试验2种方法优化石蒜属植物SCoT-PCR体系。得出石蒜属植物SCoT-PCR 最佳反应体系:DNA 模板2.0 mgL－1,引物0.125 molL－1,三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs ）0.2 mmolL－1,镁离子（Mg2+） 3.0 mmolL－1,Taq DNA聚合酶1.016.67 nkat。对优化的反应体系进行通用性、稳定性及可靠性检测,结果均能获得丰富、稳定、清晰的DNA谱带。最后可知SCoT 新型标记在石蒜属植物中应用效果良好,可为石蒜属植物以后的研究提供基础条件。图7表6参25     

菜心ISSR-PCR反应体系的优化

以菜心(Brassica campestris L. ssp. Chinensis Var. utilis Tssen. et Lee.)为材料, 对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如Mg2 、 Taq DNA聚合酶、 dNTPs、 Primer、模版DNA的浓度及引物退火温度、延伸时间和循环次数进行了探讨, 确立了适合菜心ISSR-PCR分析的最佳反应体系和PCR扩增参数 在25 μL反应体系中含10×buffer 2.5μL, 2.0 mmol/L Mg2 , 0.5 U Taq DNA聚合酶, 0.2 mmol/L dNTPs, 0.5 μmol/L引物, 30 ng模板DNA. PCR扩增程序 94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性1 min, 49.7～56 ℃退火(退火温度随引物不同而定)1 min, 72 ℃延伸45 s, 40个循环; 72 ℃延伸5 min.     

果梅ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以果梅品种桃梅为试材, 通过单因子试验分别研究了DNA模板浓度、引物浓度、 Mg2 浓度、 dNTPs浓度、退火温度及循环数等对果梅ISSR-PCR反应的影响. 建立了果梅ISSR-PCR 的最佳反应体系 20 μL反应体系中含10× buffer 2 μL, 2.5 mmol/L MgCl2, 0.2 mmol/L dNTPs, 0.32 μmol/L引物, 20～80 ng模板DNA, 1 U Taq DNA聚合酶. 利用优化的反应体系, 对19个果梅品种进行体系稳定性检测, 结果表明该反应体系的重复性和稳定性良好.     

濒危树种格氏栲ISSR-PCR反应体系的建立

以濒危珍稀树种格氏栲为材料,对ISSR反应体系中的各个主要影响因子进行优化筛选.首次建立可用于格氏栲ISSR-PCR分析的反应体系:20μL PCR反应体系中包括1ng·μL-1模板DNA,0.10 mmo1·L-1dNTP,2.0μL 10×PCR buffer (缓冲液),0.2μmol·L-1引物,0.037 5...     

迎红杜鹃ISSR-PCR反应体系建立

利用正交设计L16(45)方法对迎红杜鹃(Rhododendron mucronulatum Turcz.)ISSR-PCR(Inter-simple sequence repeat-Polymerase chain reaction products)反应体系的5因素(TaqDNA聚合酶、Mg2+、DNA模板、dNTP、引物)在4个水平上进行了优化试验。结果表明,ISSR-PCR反应体系各因素在设定的不同水平对PCR反应结果都有影响,其中引物浓度的影响最大;筛选出了各反应因素的最佳水平,建立的迎红杜鹃ISSR-PCR反应最佳体系(25μL)为2.0μL10×Buffer、0.3μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)、2μLDNA模板(20ng/μL),2.5μL dNTPs(2.5mmol/L)、2μL引物(10μmol/L)。     

越桔 ISSR-PCR 反应体系建立与优化

以改良CTAB法提取越桔(Vaccinium Linn.)品种薄雾DNA为材料,采用正交设计L16(45)表探讨了Tag酶;Mg~(2+);DNA;dntps及引物浓度5个主要因素对越桔ISSR-PCR扩增反应的影响,通过直观分析和方差分析结合,建立了越桔ISSR-PCR(20μL)最佳反应体系,各组分的浓度为:Tag酶0.75 U,Mg~(2+)1.875 mmol/L,DNA 0.8mmol/L,dntp 0.1mmol/L,引物0.2μmol/L.在此基础上探讨了引物UBC835的最佳退火温度、循环次数和延伸时间,结果分别为54.2℃、35次、60s.选用两个引物对21份越桔资源进行ISSR扩增,结果显示优化的体系稳定性较高.     

果梅ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以果梅品种桃梅为试材,通过单因子试验分别研究了DNA模板浓度、引物浓度、Mg^2＋浓度、dNTPs浓度、退火温度及循环数等对果梅ISSR-PCR反应的影响．建立了果梅ISSR-PCR的最佳反应体系：20μL反应体系中含10×buffer2μL,2．5mmol／LMgCl2,0．2mmol／LdNTPs,0．32μmol／L引物,20～80ng模板DNA,1UTaq DNA聚合酶．利用优化的反应体系,对19个果梅品种进行体系稳定性检测,结果表明该反应体系的重复性和稳定性良好．     

泡桐属植物ISSR-PCR反应体系的优化

为建立和优化泡桐属植物高效、稳定的ISSR-PCR反应体系,本试验采用了5因素4水平的正交试验以及单因素梯度优化相结合的方法,筛选出了泡桐属植物最适的ISSR-PCR反应体系,即20μL体系中含buffer 2.5μL,Taq酶2.0U,Mg2+ 3.75 mmol·L-1,0.4 mmol·L-1dNTPs,引物0.35 mmol·L-1,模板40 ng.扩增程序为:94℃预变性5 min,然后94℃变性30 s,55℃复性45 s,72℃延伸90 s,40个循环,72℃延伸7 min,最后4℃保温.     

石蒜属种间杂交种的鉴定和分子身份证构建

【目的】鉴定石蒜属Lycoris种间杂交种F₁的真实性。【方法】利用荧光标记表达序列标签简单序列重复(ESTSSR)方法,构建亲本石蒜L. radiata、中国石蒜L. chinensis、换锦花L. sprengeri和石蒜-中国石蒜、石蒜-换锦花杂交种F₁共78个样品的分子身份证,并分析遗传关系。【结果】15对多态性强的荧光标记EST-SSR引物得到扩增条带92条,每对引物平均扩增6.13条;多态性信息量(PIC)为0.629 2～1.000 0,平均为0.913 7。引物SSR203+SSR115对石蒜-换锦花、石蒜-中国石蒜杂交种F₁代的真实性鉴定率分别为96.30%和96.15%。非加权组平均法(UPGMA)聚类分析表明：石蒜、中国石蒜、换锦花及其种间杂交种的遗传相似系数为0.76～0.98,在相似系数为0.77处25个亲本和53个杂交种聚为Ⅰ和Ⅱ两大类,Ⅰ类包括亲本换锦花、石蒜-换锦花杂交种,Ⅱ类包括石蒜、中国石蒜以及中国石蒜-石蒜杂交种,Ⅱ类又可分为Ⅱa、Ⅱb和Ⅱc等3个亚类。利用荧光标记EST-SSR基因...     

菜心ISSR-PCR反应体系的优化

以菜心（Brassica campestris L．ssp．Chinensis Var．utilis Tssen．et Lee．）为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如Mg^2＋、Taq DNA聚合酶、dNTPs、Primer、模版DNA的浓度及引物退火温度、延伸时间和循环次数进行了探讨,确立了适合菜心ISSR-PCR分析的最佳反应体系和PCR扩增参数：在25pL反应体系中含10×buffer 2．5μL,2．0mmol／LMg^2＋,0．5U Taq DNA聚合酶,0．2mmol／LdNTPs,0．5μmol／L引物,30ng模板DNA．PCR扩增程序：94℃预变性3min;94℃变性1min,49．7～56℃退火（退火温度随引物不同而定）1min,72℃延伸45s,40个循环;72℃延伸5min．     

香榧ISSR-PCR扩增条件的优化和引物筛选

以香榧Torreya grandis ‘Merrillii’基因组DNA为材料,对影响简单序列重复区间扩增?鄄聚合酶链式反应（ISSR-PCR）的Taq酶用量、Mg²⁺浓度、模板DNA用量、磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）浓度和引物浓度等进行了优化试验。优化后的香榧ISSR-PCR扩增体系为：总容积20 μL,包括30 ng模板DNA,16.67 nkat Taq酶,0.350 μmol·L -1引物,1.625 mmol·L^-1 Mg²⁺,0.250 mmol·L^-1 dNTPs,10 × PCR buffer 2 μL。PCR扩增程序：94 ℃变性5.0 min;35个循环：94 ℃变性30 s,退火45 s,退火温度视引物而定,72 ℃延伸1.5 min;最后72 ℃延伸7.0 min,4 ℃保温。在此基础上,从77个ISSR引物中筛选出34个适合香榧ISSR分析的引物,且通过梯度PCR确定了各自最适的退火温度。研究结果为香榧遗传图谱构建打下了基础。图4表1参12     

皱边石杉内生真菌ISSR-PCR反应条件的优化

以从皱边石杉中分离纯化出的99株内生真菌DNA为材料,优选出10条ISSR引物(UBC842、UBC848、UBC850、UBC856、UBC861、UBC864、UBC868、UBC873、UBC880、UBC887)的最适退火温度,并对其进行ISSR–PCR反应体系单因素试验及正交试验优化,建立皱边石杉内生真菌ISSR–PCR的优化反应体系,即25μL反应体系中,10×PCR Buffer(Mg2+浓度为2.0 mmol/L)2.5μL,dNTPs(10 mmol/L)0.6μL,引物(10 pmol/μL)2.0μL,Taq E(1 U/μL)1.5μL,DNA模板(10 ng/μL)3μL,无菌ddH2O 15.4μL。以UBC873引物对99株内生真菌基因组DNA进行PCR扩增,初步获知皱边石杉内生真菌资源的遗传多样性非常丰富。     

银杏ISSR-PCR扩增反应体系的优化

为了对影响银杏戗ngkobiloba简单序列重复区间扩增-聚合酶链式反应（ISSR-PCR）扩增反应体系的因素进行优化,采用[SSR-PCR扩增技术和UVP凝胶电泳成像技术对模扳DNA浓度、Taq酶用量、引物用量、dNTP的用量以及退火温度等因素进行筛选和优化筛选优化后的反应条件：Taq酶0．3μg,2μL10×Buffer（含15mmol·L^-1 MgCl2）,模板DNA40ng,dNTP0．2mmol·L^-1,引物0．5μmol·L^-1,Mg^2＋,5nmol·L^-1。PCR扩增程序：94℃变性5min,然后进行38个循环：94℃变性30S,48～53℃（根据引物而定）退火30s,72℃延伸1min;最后72℃延伸10min,4℃终止反应。上述反应条件可广泛应用于银杏的遗传多样性分析、遗传育种和转基因等方面的研究。图6表1参19     

瓠瓜ISSR—PCR反应体系优化

利用正交设计L9(34),对瓠瓜ISSR-PCR反应体系的4因素(dNTP、引物、Mg2 、Taq酶)在3水平上进行优化试验,建立适合瓠瓜ISSR-PCR反应体系,结果表明,在25μL反应体系中,含1×PCR buffer、200μmol·L-1dNTP、0.5μmol·L-1引物、2.5mmol·L-1 MgCl2、30ng模板DNA、0.75U的Taq酶为最佳处理;通过PCR梯度测验,瓠瓜ISSR扩增适宜的退火温度比Tm值高2~6℃。     

亮叶蜡梅ISSR反应体系的建立与优化

为了建立和优化亮叶蜡梅(Chimonanthus nitens Oily.)的ISSR反应体系,对模板DNA的浓度、引物浓度、Mg2+浓度等影响因子进行了筛选.结果表明:在25 μL的反应体系中,含有40 ng模板DNA、1 U Taq酶、0.2 mmol/L dNTP、0.3μmol/L引物、1.5 mmol/L Mg2+、2.5μL 10×buffer的扩增效果最好.利用该优化的反应体系,筛选出了12条稳定性强、清晰度高、多态性高的ISSR引物,并对筛选出的12条引物在不同退火温度(51～56℃)下的扩增效果进行了比较,从而确定了每个引物的最佳退火温度.     

桃SSR反应体系的优化

以‘新大久保’桃为试材,利用正交设计直观分析法和2因素完全随机试验优化了桃SSR技术中PCR反应体系.试验结果表明,适宜桃遗传分析的SSR技术体系为：在25 μL反应体系中Taq DNA聚合酶和DNA最适用量分别为1 U和50～100 ng;Mg^2＋ 、dNTP和引物最适终浓度分别为1.5～2.0 mmol/L、0.20～0.28 mmol/L和0.2～0.6 μmol/L.利用30个桃品种验证此反应体系,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果显示,扩增产物在100～300 bp,多态性高,且反应体系的稳定性和可重复性好.     

太子参ISSR反应体系的优化

通过单因子试验和正交设计,对影响太子参ISSR-PCR扩增效果的因素,如模板DNA浓度、Taq酶浓度、dNTPs浓度、引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数进行优化。确立了可用于太子参ISSR-PCR分析最适宜的反应体系:20μL反应体系中含80 ng模板DNA,0.5U Taq酶,0.4μmol·L~(-1)引物,0.18 mmol·L~(-1)dNTPs;PCR扩增延伸时间为70 s,循环数为35。稳定性试验表明,该体系能在不同太子参品种中扩增出清晰明亮、稳定性、多态性好的条带。     

香蕉ISSR反应体系的建立

以35份香蕉品种为材料,采用正交设计L25(56)对PCR反应中的DNA质量浓度、TaqDNA聚合酶用量、Mg2+浓度、引物浓度、退火温度及甲酰胺浓度等6个因素在5个水平上进行了优化试验.建立了稳定的、可重复的香蕉ISSR最佳反应体系和PCR扩增参数.确定在25μL的反应体系中,DNA模板质量浓度为0.8 ng/μL,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,dNTPs浓度为0.3 mmol/L,引物浓度为0.2μmol/L,Taq酶为1.25 U,退火温度为52℃.     

连续多重PCR牛胚胎性别鉴定

本实验以BOV97M序列和牛的1．715卫星DNA序列设计引物进行PCR扩增，其中前者为雄性特异扩增，后者为雌雄共同扩增，以进行牛的性别鉴定。PCR扩增共进行43个循环，其中前11个循环为雄性特异扩增，在随后的33个循环中，再加入内标引物，即进行多重PCR扩增，其灵敏度可达到10pg级(约3个细胞)。