一个烟草糖基转移酶启动子在转基因烟草植株中的表达分析（摘要）

[目的]研究从烟草中克隆的1个受水杨酸和茉莉酸甲酯诱导表达的新的糖基转移酶基因（sm-Ngt）启动子部分缺失片段在烟草中的表达。[方法]以转sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子与Gus基因融合植物表达载体的T1代转基因植株为材料,用茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）处理16h后分别进行GUS组织化学染色和荧光定量法测定GUS酶活性,分析水杨酸和茉莉酸甲酯对sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子表达的影响。[结果]在5个不同缺失片段启动子的转基因T1代生长30d的植株中,转-220～0bp片段的GUS染色最少,转-524～0bp及-468～0bp片段的染色最深。在没有MeJA和SA诱导处理时,-524～0bp和-468～0bp2个启动子片段启动的GUS活性最高,远高于-1150～0、-800～0、-220～0bp片段的活性,并且不是由于基因拷贝数而引起的（Southern杂交结果）;-800～0bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA和SA双重诱导,-1150～0bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA的诱导。[结论]在sm-Ngt启动子的-524～-220bp存在提高启动子活性调控元件,-1150～-524bp存在抑制启动子活性的序列,并且存在MeJA和SA双重诱导启动子活性调控元件。     

烟草糖基转移酶基因启动子片段B的克隆与诱导表达

利用从烟草中克隆的一个新糖基转移酶(Glucosyitransferase,GTs)基因启动子中具有茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)双重诱导的片段,与GUS(β-glucuronidase)报告基因连接,构建部分启动子片段缺失载体.利用农杆菌介导的叶盘转化法,获得了转基因植株,不同片段载体转基因植株的阳性率为50%～71%.对阳性转基因烟草植株GUS诱导活性的定量分析结果表明,在构建的4个表达载体中,启动子片段BA的基础表达水平非常低,并且不同转基因植株中都存在SA和MeJA双重诱导特征:片段BB和BC基础表达水平较高,不同转基因植株对SA和MeJA的反应不同:对于启动子片段BD,基础表达高于BA片段而低于BB和BC,不同转基因植株GUS活性均受SA诱导.推测在-756～-703之间(BA)存在MeJA和SA双重诱导元件,在-643～-606存在SA的诱导元件.对这些诱导元件的确定,有助于水杨酸和茉莉酸甲酯诱导机理的研究.     

水稻启动子OsN1p的克隆与功能分析

将OsN1基因上游881 bp启动子(OsN1p)序列取代pBI121中gus基因上游的35S启动子,构建植物表达载体pBIN1p,经农杆菌介导转化水稻品种‘日本晴’,获得转基因植株。GUS组织化学染色结果表明,由该启动子驱动的gus基因能在愈伤组织中较低水平地表达;稻瘟病菌接种转基因植株24 h后,GUS活性为未接种前的4.2倍;5 mmol.L-1水杨酸(SA)和0.5 mmol.L-1茉莉酸甲酯(MeJA)分别喷施转基因植株叶面6 h后,GUS活性分别为处理前的5.9和2.4倍。表明,OsN1p启动子具有启动活性,同时明显具有受稻瘟病菌、SA和MeJA诱导表达的特性。     

1个烟草糖基转移酶启动子在拟南芥中的表达

从烟草中克隆到1个受甲基茉莉酸和水杨酸双重诱导的糖基转移酶基因GT-MS,将其翻译起始位点5'上游800+1启动子序列取代pCAMBIAl301质粒的35S启动子,构建GT-MS启动子与Gus基因融合的植物表达载体,采用花序浸染法转化拟南芥,得到阳性植株.对转基因植株进行组织化学染色,结果表明,GT-MS启动子在拟南芥不同生长发育时期及不同器官均有表达,但主要是在维管组织表达,且韧皮部的表达高于木质部.MeJA和SA诱导后GUS活性增强,Gus基因RNA表达量成倍增加.表明GT-MS启动子与在烟草中相似,在拟南芥中也受MeJA和SA诱导.     

简单重复序列TTC调控AtHip1基因表达初探

拟南芥AtHip1基因启动子含有一个保守的TTC重复位点,序列预测该TTC位点与水杨酸应答元件相似。定量PCR分析表明AtHip1表达受水杨酸诱导,处理4h后表达量达峰值,随后表达水平逐渐降低。构建5′端启动子系列缺失载体并转化拟南芥分析启动子功能。GUS染色和转基因表达分析显示AtHip1启动子-399至-184碱基(base pair,bp)位置的序列片段缺失导致启动子活性降低并丧失水杨酸应答功能。上述结果表明携带有TTC重复位点的启动子区段属AtHip1基因转录调控核心区且具有响应水杨酸信号的功能。     

一个烟草葡糖基转移酶基因启动子的克隆与诱导表达

利用笔者所在的实验室从烟草中克隆的一个葡糖基转移酶基因(GT-like),通过PCR扩增得到该基因开放阅读框5′端-1150~0上游调控区。序列分析表明该启动子序列含有多个基因表达调控元件。将GT-like基因启动子与gus报告基因连接,构建植物表达载体pGT-gus,经根癌农杆菌介导法转化W38型烟草。转基因烟草植株GUS组织化学染色结果表明:该基因上游-1150~0序列具有启动子活性,能启动gus基因在烟草叶片中表达,而在根中的表达受时间和环境影响。GUS诱导活性的定量分析结果表明,该启动子的表达不但受甲基茉莉酸的强烈诱导,而且也受水杨酸的强烈诱导。对这一启动子的诱导表达机理的分析将有助于进一步研究甲基茉莉酸和水杨酸之间拮抗作用的相互关系。     

水稻OsN1基因5’端启动子不同区域序列分析

为了研究水稻OsN1基因启动子(OsN1p)的表达调控机理,用OsN1基因ATG(ATG中的A为0)上游-1 089 bp、-881 bp、-489 bp和-245 bp的启动子序列分别取代pBI121中的35S启动子,构建植物表达载体pBIN1.1p、pBIN0.9p、pBIN0.5p和pBIN0.2p。将这些表达载体经农杆菌介导转化水稻日本晴,获得转基因植株。对启动子的表达特点和启动活性进行了分析,结果表明,由-1 089 bp启动子、-881 bp启动子和-489 bp启动子驱动的gus基因能在愈伤组织中表达,-245 bp启动子不能驱动gus基因在愈伤组织中表达,说明启动子OsN1p具有启动活性的最小启动序列为ATG上游的-489 bp;-489 bp启动子驱动的gus基因在转基因植株根中表达,在根冠不表达;用5 mmol/L水杨酸(SA)喷施转基因植株叶片后,GUS定量分析结果表明转基因植株的GUS活性增高,转-881bp启动子植株的GUS活性比转-1 089 bp启动子植株的活性高。可见,启动子OsN1p具有组织特异性表达和受SA诱导表达的特性。     

橡胶树HbFCA启动子在转基因烟草中的功能缺失分析

利用5′缺失设计一系列引物,扩增HbFCA启动子质粒,获得5个启动子缺失片段,用这些片段分别替换PBI121载体中的CaMV35S启动子,得到5个HbFCA的5′缺失表达载体,即pA、pB、pC、pD和pE。利用农杆菌介导叶盘法进行烟草遗传转化,对组培瓶内生根较好的烟草叶片GUS染色,结果发现,长度为最小片段的276 bp的pE可以较好地实现HbFCA启动子的功能。对橡胶树体细胞胚瞬时表达检测发现,pE片段也能启动表达,有较好的GUS活性,可以实现HbFCA启动子的功能。     

大麦β-1,3-葡聚糖酶基因启动子PGⅢ的激发子诱导元件分析

利用PLACE数据库,对大麦β-1,3-葡聚糖酶同功酶基因PGⅢ启动子的可能顺式作用元件进行分析,并设计特异性引物。通过5′-缺失法获得了不同大小的启动子片段,分别与报告基因gus(β-葡聚糖酸醛苷酶基因)耦联,构建植物表达载体,通过农杆菌介导法转化水稻胚性愈伤组织。GUS组织化学染色结果表明,稻瘟菌来源的激发子可以诱导PGⅢ启动子不同缺失体驱动的gus表达。荧光法结果表明,缺失体P1(-1 107 bp)具有最高的激发子诱导活性,而缺失体P4(-359 bp)驱动的gus表达量迅速降低,缺失体P5的诱导活性最低。这表明转录起始位点上游-1 107 bp序列是保持启动子最高活性所必需的,而-572--359 bp的序列是保持激发子诱导活性所必需的。GCC框和GTAC序列可能是激发子诱导表达的顺式作用元件。     

橡胶树HbMVK启动子的克隆与缺失表达分析

为了研究橡胶MVK基因启动子精细结构及功能,笔者利用PCR技术对橡胶树HbMVK基因启动子进行了克隆,并对其进行了生物信息学分析。结果表明,该启动子序列全长1 696 bp,包含CAAT-box,TATAbox,CAT-box,LTR,GARE-motif,TCA-element等元件。此外,根据元件分布,构建橡胶树HbMVK基因启动子系列缺失和全长序列表达载体并转化拟南芥。T2代转基因拟南芥中,报告基因GUS组织化学染色结果表明:HbMVK启动子全长序列和5'端-1 386 bp缺失,HbMVK启动子驱动的GUS基因只在转基因拟南芥实生苗胚轴中有极微弱表达。5'端-1 221 bp和-725 bp缺失,HbMVK启动子驱动GUS基因表达的活性较强,而5'端-325bp缺失,HbMVK启动子则完全失去活性,这表明启动子核心调控元件位于-725 bp到-325 bp之间。     

核桃JrTT1-1启动子不同长度片段响应干旱的活性分析

  目的  TTl是C2H2-ZFP（WIP型锌指结构）类转录因子调控蛋白,核桃JrTT1-1基因启动子含有干旱响应元件,具有调控干旱胁迫的功能。本研究通过分离JrTT1-1基因不同长度启动子片段并对其受干旱胁迫后的表达活性进行分析,探讨JrTT1-1基因响应干旱胁迫的机制。  方法  根据WRKY顺式作用元件的分布,将JrTT1-1基因启动子分为1 002 bp（?1 ~ ?1 002）、720 bp（?1 ~ ?720）、448 bp（?1 ~ ?448）、174 bp（?1 ~ ?174）、149 bp（?1 ~ ?149）5个片段,分别记为S1、S2、S3、S4、S5。用S1、S2、S3、S4、S5分别替换pCAMBIA1301载体的CaMV35S启动子构建重组载体,通过农杆菌介导的蘸花法转化拟南芥,经潮霉素筛选、PCR验证及GUS基因表达分析确定后培养至T3代。对不同生长期不同组织进行GUS酶活性测定,评价不同片段的时空表达活性。将S1、S2、S3、S4、S5转基因植株种子萌发生长30 d进行干旱处理（50 mmol/L甘露醇）,未干旱处理的设为对照（CK）,分析整株、根及地上部分GUS酶活性,评价不同片段响应干旱的差异。  结果  正常生长条件下,S1、S2、S3、S4、S5转基因拟南芥在不同生长时期、不同组织器官中均能检测出GUS酶活性,但不同片段GUS活性具有差异,且随着片段变短,活性降低;但S1和S2之间的差异不显著。比较成熟种子、鲜种子、35 d根、茎、叶、花的GUS活性,发现不同组织之间也有区别,体现了5个片段的组织表达特异性。与CK相比,干旱胁迫下,5个片段整株、根和地上部分的GUS活性均显著提高,其中干旱胁迫后S1、S2、S3、S4、S5全株的GUS活性分别为CK的1.50、1.46、1.47、1.46、2.23倍,根GUS活性分别为CK的1.29、1.29、1.28、1.53、1.36倍,地上部分GUS活性分别为CK的1.62、1.59、1.57、1.59、2.30倍。  结论  JrTT1-1基因启动子片段的表达活性与其长度呈正相关,每个长度启动子片段活性具有根、茎、叶、花、种子等组织特异性;WRKY元件及其数量可能与干旱胁迫调节作用相关,且JrTT1-1启动子在干旱胁迫下的表达也具有组织差异性。      

青蒿非分泌型腺毛特异TPS7基因启动子的克隆及功能分析

研究运用基因组步移法克隆了长度为1 167bp的青蒿启动子proTPS7,经生物信息学分析发现了proTPS7中的多个顺式调控元件。构建启动子与GUS融合载体,稳定转化青蒿并对转基因植株进行GUS染色实验,结果表明该启动子能驱动报告基因在非分泌型腺毛中的特异表达。对转基因青蒿喷洒甲基茉莉酸和脱落酸,3h后GUS基因表达水平有所上调,说明proTPS7能受到上述2种激素的诱导。     

CaKR1上游启动子分离及其表达分析

运用基因组步移技术分离获得了CaKR1基因上游-1594 bp的启动子序列,命名为CaKR1p,发现其中含有SA、ABA、低温等信号应答原件以及其它诸如W盒等应答逆境胁迫的调控原件。进一步构建CaKR1p与GUS报告基因融合的植物表达载体,获得了烟草转基因植株及其相应的T1代株系,利用T1代转基因株系分析了CaKR1p在几种外源激素处理下的GUS基因的表达,结果表明外源激素SA、JA和ABA的诱导处理均可激活该启动子下游报告基因GUS的表达,说明CaKR1的表达和作用受到SA、ABA以及JA等信号通路调节。     

一个水稻谷胱甘肽-S-转移酶启动子的特性分析

从水稻基因组文库中筛选得到1个水稻谷胱甘肽-S-转移酶基因,命名为OsGSTL1。为了研究OsGSTL1启动子在植物体内的表达特性,将OsGSTL1起始位点5′-端上游不同长度的调控序列与报告基因GUS融合,并在洋葱表皮瞬间表达和拟南芥中稳定表达。研究表明:在洋葱表皮细胞中,160 bp及更长的上游调控序列均能启动GUS基因的表达;而在转基因拟南芥中,含有2 155 bp的上游序列的PGL2.1::GUS具有时空表达的特性,在转基因的早期幼苗中GUS基因在子叶中特异性表达,但在根中没有表达;而在幼苗生长的后期,根、茎、叶中都有少量的表达。但包含1 224 bp的上游序列的PGL1.2::GUS却表现为组成型表达的特性。由此推测,OsGSTL1启动子启动的基因表达可能与幼苗的营养代谢相关;而OsGSTL1启动子的时空表达相关元件可能位于GST起始位点5′-端上游-2 155 bp~-1 224 bp范围内。     

盐穗木转录因子HcSCL13基因的时空表达和胁迫响应特性

【目的】研究盐生植物盐穗木HcSCL13基因的时空表达和胁迫响应特性。【方法】将该基因全长启动子(2 230 bp)及截短序列与GUS报告基因融合,检测遗传转化后植物的GUS组织化学染色及酶活力。【结果】在稳定整合HcSCL13启动子的转基因拟南芥中,从种子萌发到种苗形成的过程中,地上和地下部位均表现出较强的启动子活性;随着植物的生长发育,启动子活性表现出一定的组织特异性;HcSCL13基因启动子对光、盐及机械损伤等胁迫积极响应。启动子上游-1 124-1 450 bp是影响其活性的区域,而上游-1 730-2 230 bp为盐响应区域。【结论】盐穗木HcSCL13基因的表达具有时空特异性及对光、盐和机械损伤等因素的响应特性。     

毛果杨PtAREB1基因启动子的克隆及功能

为了研究杨树ABF2同源基因的表达规律,从毛果杨基因组DNA中克隆出Pt AREB1基因上游一段1 800 bp序列。序列分析结果表明,该序列含有逆境胁迫响应元件TC-rich repeats、ABA应答元件ABRE和茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,Me JA)应答元件TGACG-motif等胁迫相关元件。在序列分析的基础上,构建了Pt AREB1基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体,利用农杆菌介导的花粉管通道法获得转基因拟南芥。结果表明Pt AREB1启动子可以在干旱、ABA、盐、Me JA和SA胁迫下,驱动GUS基因在转基因拟南芥的根、茎和叶中表达。说明Pt AREB1基因可能与干旱、高盐等胁迫应答紧密相关。