南瓜SRAP扩增体系与扩增程序的优化

利用L45正交设计对影响南瓜SRAP反应体系的MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq酶含量、引物浓度及模板DNA浓度等5个因素进行了筛选,快速得到稳定性和重复性好的南瓜SRAP扩增体系。对复性温度、PCR循环次数等影响南瓜SRAP扩增结果的重要因素进行了优化。最终优化的南瓜SRAP反应体系为25μL反应液中:10×buffer2.5μL,0.2 mmol/L dNTPs,引物0.2μmol/L,1.5 mmol/LMgCl2,DNA模板6 ng/μL,Taq酶1.5 U。本研究最终确立的PCR反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性40 s,35℃退火40 s,72℃延伸90 s,进行5个循环,94℃变性40 s,50℃退火40 s,72℃延伸90 s,进行32个循环,最后72℃延伸5 min。在此条件下得到的SRAP标记可为南瓜遗传多样性、分子标记及辅助育种等研究提供稳定有效的手段。     

春兰ISSR-PCR反应体系的优化

以春兰为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如模板DNA、dNTPs、MgCl2、primer、TaqDNA聚合酶的浓度及引物退火温度、反应循环数进行了探讨,确立了适合春兰ISSR-PCR分析的最佳反应体系和PCR扩增参数:在15μL反应体系中含1×buffer,0.2 mmol/L dNTPs,2.0 mmol/L MgCl2,0.2μmol/L引物,0.3 UTaqDNA聚合酶,20 ng模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性2.5 min;94℃变性45 s,48~58℃退火(退火温度随引物不同而定)45 s,72℃延伸2 min,35个循环;72℃延伸5 min。     

大蒜SSR体系的建立与优化

为建立适宜大蒜(Allium sativum L.)的SSR反应体系和扩增程序,应用L16(45)正交设计对影响SSR-PCR的主要参数进行优化。结果表明,适宜大蒜的SSR反应体系总体积为20μL,其中含TaqDNA聚合酶0.02 U/μL、引物为0.2μmol/L、Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 0.2 mmol/L、DNA 30 mg/L;PCR适宜扩增程序为:94℃预变性3 min,94℃变性30 s,55℃45 s,72℃延伸90 s,35次循环,94℃变性30 s,53℃45 s,72℃延伸1 min,10次循环的最后一个循环延伸增加为10 min。并优化引物最适合退火温度为53.5~58.5℃。利用此反应体系对40份大蒜品种进行SSR扩增并电泳检测,扩增谱带清晰且多态性较好,证明此体系稳定可靠。在此基础上,利用优化的SSR反应体系对100对大葱SSR引物进行筛选,从中筛选出1对扩增谱带清晰稳定性好的SSR引物,并对40份大蒜品种进行遗传多样性分析。这一对SSR引物共检测出3个多态性条带可将供试材料聚为2大类,大部分品种(系)都按照其地理来源和遗传背景进行聚类。     

金银花ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以金银花叶片基因组DNA为模板,通过单因素试验,研究了退火温度、Taq DNA聚合酶的用量及模板DNA、引物、dNZPs、Mg2 浓度等6种因素对ISSR-PCR扩增的影响,建立了适合于金银花IS-SR-PCR反应体系和扩增程序,即在20μ1反应体系中,内合1×PCR反应缓冲液(Mg2 free)、1.5U TaqDNA聚合酶、0.15mmol/L dNTPs、0.41xmo1/L 引物、1.5mmo1/L MgC12、60ng模板DNA.确定了适宜的退火温度为49.9℃.扩增程序为94℃预变性5min;35个循环为94℃变性30s,49.9℃退火30s,72℃延伸1.5min;最后72℃延伸7min,4℃保存.利用优化反应体系,从100务ISSR引物中筛选出10条稳定性和重复性高的引物;以这1O条引物对22个金银花品种基因组DNA扩增,共扩增出108条带,其中多态性条带96条.多态性条带比率为88.9%.金银花ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行金银花品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定了良好基础.     

甜瓜SRAP-PCR程序和反应体系的优化

以甜瓜品种炮台红和皇后为试验材料,对影响甜瓜SRAP-PCR反应体系的各因子进行了梯度试验,并对退火温度进行了探索,得到扩增多态性高、重复性好、带型清晰的SRAP-PCR反应程序和体系。反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸1 min,共5个循环;94℃变性1 min,51℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃延伸10 min;4℃保存。反应体系(共25μL):DNA 45 ng,Mg~2+2.0mmol/L,dNTPs0.15 mmoL/L,primer 0.24/μmol/L,Taq polymerase 1.5 U。结果表明,该程序和体系能够较好的满足甜瓜基因组SRAP扩增的要求。     

沙地云杉ISSR-PCR反应体系的初步优化

以沙地云杉叶基因组DNA为材料,采用单因素试验方法对ISSR-PCR体系中的主要成分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度、退火温度进行筛选,建立并优化沙地ISSR-PCR反应体系。结果表明,UBC835是最适引物,适宜退火温度为50℃。沙地云杉ISSR-PCR分析的最适反应体系(20μL PCR反应体系)为:2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、0.25μmol/L引物、50 ng/μL模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性4 min;94℃变性45 s,50℃退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。     

南瓜SRAP反应体系的建立与优化

以‘密本’南瓜作为筛选体系的材料,通过单因素试验对南瓜20μL SRAP-PCR扩增体系的Mg^2＋、dNTP、 Taq酶、引物及DNA浓度和扩增程序的退火温度与循环次数进行优化,筛选出各组分的最佳浓度、最佳的退火温度和最佳循环次数。试验结果确立南瓜最佳的20μL SRAP体系为：0.2 mmol · L ^-1 dNTP ,1.5 U Taq酶,80 ng DNA ,0.16μmol·L^ -1的单条引物,Mg^2＋1.5 mmol·L^ -1,2μL 10＆#215;Buffer ;最佳扩增程序为：94℃预变性5min;94℃1 min ,35℃1 min ,72℃1 min ,5个循环;94℃1 min ,52℃1 min ,72℃1 min 35个循环;最后72℃延伸10 min。选用17个南瓜品种对确立扩增体系及扩增程序进行验证,检测结果表现为扩增产物条带清晰明亮、多态性丰富、特异性强、重复性好,表明本试验所确定的反应体系及反应程序适用于南瓜的SRAP分子标记。     

洋葱(Allium cepa L.)RAPD-PCR反应体系及扩增程序的优化

为建立多态性高、稳定性好的洋葱RAPD-PCR反应体系,采用正交设计,研究了Taq酶、Mg2 、引物和dNTP 4种RAPD-PCR反应组分浓度变化对扩增结果的影响,在此基础上对模板DNA用量、扩增程序中退火温度和反应循环次数进行了筛选。试验结果表明,洋葱20μl RAPD-PCR优化反应体系为1×Buffer、2.0 mmo1/L Mg2 、1.0 UTaqDNA聚合酶、200μmo1/L dNTP、0.6μmo1/L引物、2%甘油和15 ng DNA模板;PCR扩增程序为94℃预变性4 m in;94℃变性30 s,35℃退火40 s,72℃延长1.5 m in,45个循环;72℃保温延伸7 m in。     

剑麻ISSR反应体系的建立及其优化

为利用ISSR分子标记进行剑麻遗传多样性分析和种质资源鉴定,分析了剑麻ISSR反应的主要参数对反应体系的影响。结果表明:25μL的反应体系中含150ng的模板DNA、10μLTaq聚合酶MIX、0.5μmol/L引物。优化的反应程序:94℃预变性5min;94℃变性30s,设定温度(51~60.3℃)退火45s,72℃延伸45s,循环35次;然后72℃延伸10min;筛选到16条适合剑麻扩增的ISSR引物。     

黄芪SRAP反应体系优化

以黄芪为材料,对黄芪SRAP反应体系进行优化.黄芪最佳SRAP反应体系为,在20 μl反应体积中含:模板DNA 15 ng,引物0.2 μmol/L,dNTP 200 μmol/L,MgCl2 2 mmol/L,Taq DNA聚合酶 1 U,1×Buffer;反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,35 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,5个循环;94 ℃变性1 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35个循环;最后72 ℃延伸5 min.