稻曲病菌致病力丧失突变菌株B-1015的T-DNA标记基因的克隆

【目的】研究稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）致病力丧失突变菌株B-1015,克隆和分析T-DNA插入位点的侧翼序列,为稻曲病菌的致病机制研究提供参考。【方法】分析稻曲病菌T-DNA插入突变体B-1015菌株的生长速率、产孢量、孢子萌发率以及致病力等生物学表型。用PCR检测T-DNA在B-1015基因组中插入的稳定性,用Southern杂交检测T-DNA插入的拷贝数,用hiTail-PCR扩增T-DNA侧翼序列,用RACE PCR克隆T-DNA标记基因,半定量RT-PCR分析所克隆基因的表达情况。【结果】与野生菌株P1相比,突变菌株B-1015的生长速率和产孢量都有较明显的降低,孢子萌发率无明显差异,致病力丧失。分子检测结果表明T-DNA在B-1015基因组中为稳定的单拷贝插入。hiTail-PCR得到的T-DNA两端侧翼序列在野生型菌株基因组上不相连,RACE PCR在两边的侧翼序列上分别克隆得到Uvt-1015R和Uvt-1015L。预测分析表明Uvt-1015R包含一个长度为948 bp的开放阅读框（open reading frame finder,ORF）,可编码295个氨基酸,5′端非编码区（5′-untranslated regions,5′-UTR）长度为 341 bp,3′端非编码区（3′-untranslated regions,3′-UTR）长度为271 bp。Uvt-1015L包含一个长度为351 bp的ORF,可编码116个氨基酸,5′-UTR为31 bp,3′-UTR长度为174 bp。在已知功能的蛋白中检索,没有发现与Uvt-1015R和Uvt-1015L基因同源的蛋白。序列分析发现T-DNA插入在两个基因序列中间,RT-PCR结果显示,在突变菌株B-1015中,Uvt-1015R表达量下降,Uvt-1015L不表达。【结论】 稻曲病菌突变菌株B-1015致病力等重要生物学表型发生改变,可能是由于T-DNA的插入导致了B-1015基因组重排和Uvt-1015R、Uvt-1015L基因结构的破坏。     

稻曲病菌T-DNA插入突变菌株B1241侧翼基因克隆

【目的】分析稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)致病力减弱的T-DNA插入突变菌株B1241的生物学性状和致病力,并结合分子生物学手段研究其T-DNA插入位点的侧翼基因,以解析突变基因在稻曲病菌生长和致病过程中的作用,从而为阐明稻曲病菌致病机制提供理论基础。【方法】以野生菌株P1作为对照,观察并检测突变菌株B1241的菌落形态、生长速率、孢子形态、产孢量等生物学性状;采用注射接种的方法将菌丝和孢子的混合液接种于水稻穗苞中,统计每穗发病的病粒数,分析B1241的致病性变化;突变菌株B1241在不含有潮霉素的PSA平板上转接5代之后,PCR检测T-DNA插入的稳定性并通过Southern杂交分析B1241中T-DNA插入的拷贝数;利用Hi Tail-PCR获得T-DNA插入位点的侧翼序列,经NCBI比对得到侧翼基因;运用RACE-PCR克隆插入位点侧翼基因全长;q RT-PCR分析侧翼基因的表达情况。【结果】经生物学特性观察及田间接种发现,与野生菌株P1相比,突变菌株B1241在固体培养基MM、PSA和TB3上的菌落和孢子形态以及生长速率无显著差异,其致病力、产孢能力均呈极显著下降。B1241在不含潮霉素的PSA平板上转接5代之后,仍能扩增到GFP和HPH基因,说明T-DNA已经稳定地插入到其基因组中。Southern杂交结果显示T-DNA在该突变菌株中以单拷贝的形式插入。经扩增并比对侧翼序列,T-DNA的插入位点处少了28 bp的稻曲序列,有37 bp在T-DNA及稻曲病菌基因组中都没有比对到。NCBI比对发现,侧翼基因Uvt-1241与UV-8b菌株的UV8b-7878基因同源,开放阅读框长2 317 bp,包含81和106 bp的2个内含子,编码709个氨基酸。经RACE-PCR获得基因全长2 650 bp,5'非编码区长度为14 bp,3'非编码区长度为319 bp。T-DNA插入在基因Uvt-1241的启动子区域,位于起始密码子之前516 bp处。q RT-PCR分析结果表明,Uvt-1241在该突变体中表达量下降。该基因编码一个糖基水解酶18家族的蛋白,同时含有一个保守结构域D××D×D×E。【结论】稻曲病菌突变菌株B1241中,T-DNA插入到基因Uvt-1241的启动子区域,从而导致该启动子功能部分缺失,基因表达量下降,使得突变菌株的生长、产孢等生物学特性及致病力发生改变,由此推测该基因可能在稻曲病菌生长及致病过程中起着重要的作用。     

稻曲病菌T-DNA插入突变体5062的插入位点分析

【目的】研究稻曲病菌致病力增强的ATMT突变菌株5062,为稻曲病菌致病机制解析、致病相关基因克隆提供方法基础。【方法】测定和观察5062的菌落直径、菌落形态、产孢能力等生物学特性,进一步利用TAIL-PCR和RACE技术克隆5062基因组的T-DNA侧翼基因,并比对分析基因的信息,最后利用RT-PCR检测突变基因的表达量。【结果】与野生型菌株相比,突变菌株5062田间接种表现为致病力增强,在MM和水琼脂培养基上生长速率减慢,产生大量分生孢子,而在PSA和TB3培养基上,其菌落形态、色素等方面与野生型无明显差异。TAIL-PCR扩增得到的紧邻T-DNA两侧的侧翼序列在野生型中不相邻。TAIL-PCR结合RACE技术克隆了5062基因组的T-DNA侧翼基因,RT-PCR表明T-DNA插入位点右侧1个基因在突变体中上调表达。【结论】突变菌株5062的致病力增强,在营养贫乏条件下产孢能力增强,其表型的变化可能是染色体重排和T-DNA插入共同影响的结果。     

稻曲病菌分生孢子高产突变体A2588的T-DNA 插入位点侧翼基因分析

【目的】克隆稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）分生孢子高产突变菌株A2588的T-DNA插入突变基因,解析该基因在稻曲病菌分生孢子形成中的功能,为进一步揭示稻曲病菌的分生孢子形成机制提供理论基础。【方法】测定A2588的产分生孢子能力、孢子萌发率、菌丝直线生长能力和热敏感性等生物学特性,利用hiTAIL-PCR、RACE和半定量PCR等方法克隆T-DNA插入突变基因,并结合生物信息学方法分析T-DNA插入导致分生孢子产量提高的分子机理。【结果】与稻曲病菌野生型菌株70-22相比,突变菌株A2588在PS培养液中产生数量为10倍以上的分生孢子,在MM培养液中产生数量约20倍的分生孢子,其在PS培养液中培养的菌球较为致密;在PSA和MM固体培养基上A2588产孢周期较短,孢子萌发率较低,虽然菌丝生长速度无明显差异,但热处理后菌丝不能恢复正常生长速率。hiTAIL-PCR和RACE法克隆了A2588中T-DNA侧翼基因,并利用RT-PCR检测侧翼基因表达水平,结果表明T-DNA侧翼基因spo76表达水平下降,进一步分析发现T-DNA可能插入至spo76的启动子区域,从而破坏了该基因启动子的部分功能。【结论】稻曲病菌突变菌株A2588中,T-DNA插入导致spo76启动子功能部分缺失,spo76表达水平下降,可能使A2588产孢周期缩短,并产生更多分生孢子。     

灰葡萄孢菌核形成缺陷突变体的遗传分析

本研究通过筛选灰葡萄孢的ATMT突变体库,获得了1株不形成菌核,孢子产量明显减少,对番茄叶片的致病力明显增强的菌株BCt41。通过对该菌株进行PCR、Southern杂交鉴定,证明该菌株为遗传稳定的单拷贝T-DNA插入突变体。通过TAIL-PCR技术获得了T-DNA插入位点的侧翼序列,与灰葡萄孢数据库比对表明:T-DNA插入位点位于基因BC1G_02176.1的外显子2中。该基因编码区长1 206bp,含1个54bp内含子,编码383个氨基酸,基因功能未知。本研究结果为进一步研究该基因在灰葡萄孢分生孢子发育、菌核形成及致病过程中的作用奠定了基础。     

淡紫拟青霉T-DNA插入突变体几丁质酶和蛋白酶活性及致病力的变化

【目的】明确食线虫真菌淡紫拟青霉T-DNA插入突变体几丁质酶和蛋白酶活性和致病力的改变。【方法】测定淡紫拟青霉T-DNA插入突变体几丁质酶和蛋白酶活性,及对南方根结线虫的致病力,分析它们与致病力的相关性。【结果】结果表明:14个淡紫拟青霉T-DNA插入突变体几丁质酶活力和蛋白酶活力由于T-DNA的插入均受到了不同程度的影响。对南方根结线虫卵的寄生率与原始菌株也存在分化,筛选获得了1株致病力增强的突变体BN-11和11株致病力明显下降的菌株;通过分析,这14个淡紫拟青霉T-DNA插入突变体几丁质酶和蛋白质酶的活性与寄生率之间不呈正相关性。【结论】获得了淡紫拟青霉T-DNA插入突变体几丁质酶和蛋白质酶的活性与致病力变化的证据,有助于淡紫拟青霉致病机制分析及致病相关基因的克隆。     

中国主要稻区稻曲病菌的生物学特性及群体遗传多样性

【目的】明确采自中国10个水稻主产省份111个稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）菌株的生物学特性、群体遗传多样性与地理区域的关系。【方法】采用生物学方法测定111个稻曲病菌菌株的产孢能力、生长速率和致病力,并采用SPSS 20.0软件对稻曲病菌菌株的产孢能力、菌丝生长速率及致病力进行相关性分析。提取111个稻曲病菌基因组DNA,采用3对特异性引物BOX、REP、ERIC对稻曲病菌菌株的全基因组DNA进行PCR扩增,通过聚类分析对其群体遗传多样性进行研究。【结果】111个稻曲病菌菌株的致病力与产孢量的Pearson相关系数为0.765,显著性概率为0.001;致病力与生长速率的Pearson相关系数为0.035,显著性概率为0.685。采用3对特异性引物BOX、ERIC、REP对稻曲病菌菌株的全基因组DNA进行了PCR扩增,群体遗传多样性值分别为0.73、0.62和0.60。111个稻曲病菌菌株的DNA用BOX引物分别扩增出7—13条不等的带谱,DNA指纹相似性在0.70相似水平上,供试菌株被划分为6种基因类群,其中第1类群为优势类型,有57个菌株,占总数的51.4％;来自安徽、四川、广西、湖北和云南的菌株主要划分在类群1和4,第2类群主要是来自江苏的菌株,有18个菌株,占总数的16.2%;第3类群是来自浙江的菌株,有8个菌株,占总数的7.2%;第5类群是来自黑龙江的菌株,有9个菌株,占总数的8.1%,第6类群是来自辽宁的菌株,有12个菌株,占总数的10.8％。稻曲病菌基因类群与地理区域之间有一定的相关性,与致病力、生长速率和产孢量之间没有相关性。【结论】来自中国10个省份的111个稻曲病菌菌株的致病力与产孢量之间具有显著相关性,相关程度为中等;致病力与菌丝的生长速率没有相关性。根据BOX-PCR扩增的稻曲病菌菌株基因组DNA指纹图谱的多态性进行划分的基因类群与地理区域之间显著相关,推测稻曲病菌属于局域性传播;基因类群与生物学特性之间没有相关性。     

棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体表型特征和侧翼序列分析

【目的】为鉴定棉花黄萎病菌随机插入突变体的表型特征,构建黄萎病菌遗传转化和功能基因研究的技术平台。【方法】采用农杆菌介导的T-DNA插入和高效TAIL-PCR方法。【结果】获得了2628个棉花黄萎病菌VD991的T-DNA随机插入的突变体和15个突变体插入位点的侧翼序列。部分突变体的表型特征和插入位点侧翼序列分析表明,①突变体的菌落形态分为菌丝型、菌核型和中间型3类,菌核型约占7.3%;②在摇瓶培养条件下,突变体产孢高峰在接种后第5—6天,菌核型突变体的产孢能力普遍高于菌丝型;③棉花黄萎病菌VD991可以产生胞外蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶。筛选获得蛋白酶分泌缺失的突变体3个,淀粉酶分泌缺失的突变体1个,果胶酶分泌降低的突变体6个;④菌核型突变体的致病力普遍高于野生型。获得了6个致病力减弱的突变体;⑤突变体侧翼序列与同种的大丽轮枝菌菌株VDLs.17基因组的序列一致性在95%—100%之间,与不同种的黑白轮枝菌VaMs.102序列的一致性为87%—94%。【结论】农杆菌介导的T-DNA随机插入可用于棉花黄萎病菌突变体的构建,突变体微菌核的产生与其产孢能力、致病性存在相关关系。美国大丽轮枝菌菌株VDLs.17基因组可用作黄萎病菌VD991功能基因研究的参考序列。     

稻曲病菌产孢能力及致病力测定

 【目的】测定稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）的产孢稳定性、产孢能力与致病力的相关性及在水稻品种上的致病性分化。【方法】采用液体培养和人工接种的方法对采自全国9个省（市）的150个稻曲病菌菌株进行产孢能力及田间致病力测定。【结果】3次产孢试验中产孢量标准偏差小于10.0的菌株有132个,占总数的88.0%。接种于两优培九（感病品种）的平均病情指数为67.7,其中98个菌株病情指数大于50;接种于淮稻5号（中等抗病品种）的平均病情指数为21.8;接种于武育粳3号（抗病品种）的平均病情指数为16.1,其中113个菌株病情指数小于25。稻曲病菌的产孢量与致病性呈正相关,但相关系数偏低,是中度—低度相关;根据150个稻曲病菌菌株在武育粳3号、淮稻5号和两优培九3个不同抗性品种上的致病力,将供试的150个稻曲病菌划分为7个致病类型,其中,第3致病类型（武育粳3号、淮稻5号和两优培九3个水稻品种表现为抗、抗、感）有53个菌株,占总数35.3%,为优势致病类型。【结论】稻曲病菌产孢性能较稳定,稻曲病菌的产孢量与致病力呈正相关。150个稻曲病菌菌株和3个不同抗性的水稻品种之间存在2种互作关系,大多数菌株与水稻品种抗性表现为弱互作关系,少数菌株与水稻品种抗性表现为强互作关系。     

枯草芽胞杆菌Bs916突变体库的构建和抑制水稻 细菌性条斑病菌相关基因的克隆

【目的】采用转座子标签技术构建枯草芽胞杆菌Bs916突变体库,从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果发生显著变化的菌株并克隆插入位点的基因,获得生防菌Bs916中与抑制细菌活性可能相关的基因。【方法】携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA通过化学转化方法转化至枯草芽胞杆菌Bs916菌株,构建随机插入突变体库。通过平板抑菌试验从突变体库中筛选对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果得到显著提高和下降的突变体;并采用PCR和Southern Blot验证转座子是否成功插入到Bs916染色体基因组上,利用反向PCR技术克隆转座子插入位点基因、测序并进行生物信息学分析。【结果】成功构建了枯草芽胞杆菌Bs916的转座子随机插入的突变体库;PCR和Southern Blot结果表明转座子成功的插入到染色体基因组上,约85%突变体以单拷贝形式插入;筛选出30株对水稻细菌性条斑病菌抑制效果发生显著变化的菌株,克隆到21个突变体插入位点的基因序列并测序。生物信息学分析结果表明这些基因与感受态形成、生物膜形成和次生产物代谢相关。【结论】成功构建了Bs916突变体库,克隆到该库中对水稻细菌性条斑病菌抑菌效果显著变化菌株的突变位点基因,这些基因推测可能与枯草芽胞杆菌Bs916中的抑制细菌化合物的合成代谢及调控相关。     

一株玉米弯孢叶斑病菌生长缓慢型突变株获得及T-DNA右翼序列分析

本试验采用农杆菌介导的遗传转化方法获得了1个菌落生长缓慢型的突变体,通过抗性基因(hph)的扩增及分子杂交验证了T-DNA以单拷贝的方式插入基因组中.对突变体的一些生物学性状与野生型CX-3比较,结果发现突变体的菌落生长速度是野生型CX-3的42%,其产孢量为野生弄CX-3的18%,但是对离体玉米叶片的致病力与野生型C...     

玉米大斑病菌腺苷酸环化酶基因的克隆与功能分析

【目的】获得玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）cAMP信号转导途径中腺苷酸环化酶基因（StAC）,利用基因敲除技术明确其在病菌致病过程中的功能。【方法】应用简并引物PCR和Genome Walking技术克隆玉米大斑病菌腺苷酸环化酶基因（StAC）DNA全长序列,并对该基因进行生物信息学分析;利用Southern blotting验证基因拷贝数;通过基因敲除技术创制StAC的缺失突变体,研究玉米大斑病菌cAMP信号转导途径中StAC的功能。【结果】StAC的DNA全长为6 816 bp,由5个外显子和4个内含子组成;ORF为6 018 bp,编码2 005个氨基酸,同源序列比对发现StAC与小麦黄斑叶枯病菌（Pyrenophora tritici-repentis）的AC基因有96%的同源性;Southern blotting证明StAC在玉米大斑病菌基因组中以单拷贝形式存在;基因功能分析表明,StAC缺失突变菌株Δstac气生菌丝灰白色,不产生分生孢子,毒素活性明显减弱,致病力下降,且在渗透胁迫条件下,菌株的抗逆能力增强,色素合成发生了改变。【结论】StAC主要调控玉米大斑病菌的产孢、致病性、高渗胁迫反应、毒素活性及色素的合成代谢。     

烟草靶斑病菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因endoPGs的克隆及表达特征分析

【目的】内切多聚半乳糖醛酸酶（endo polygalacturonases,endoPGs）是重要的致病因子之一。论文从烟草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）强致病力菌株YC-9和弱致病菌株LF-2中克隆该致病基因,分析比较该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在与烟草互作过程的致病作用。【方法】通过比较GenBank中不同植物病原真菌的endoPGs序列设计简并引物,首先获得菌株YC-9及LF-2的endoPGs基因片段,再采用RACE技术克隆获得其cDNA全长序列;生物信息学分析比较其保守结构域及序列特征;采用MEGA 4.0软件构建endoPGs的系统进化树;通过real-time RT-PCR技术对强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的endoPGs与烟草K326互作的表达特性进行研究。【结果】克隆获得了烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9和弱致病力菌株LF-2的endoPGs的cDNA全长序列,分别命名为endoPG1和endoPG2,开放阅读框（ORF）长度均为1 086 bp,编码361个氨基酸;比较分析表明endoPG1和endoPG2的推测蛋白均具有PLNO3003基因家族保守结构域,其跨膜结构间存在差异;成功构建了该基因系统进化树,结果表明来自烟草靶斑病菌的endoPGs构成独立分支,且烟草靶斑病菌endoPG1及endoPG2同源关系最近;real-time RT-PCR表达特性分析结果显示,靶斑病菌endoPG1和endoPG2与烟草互作（接种）之后该基因的表达与未互作（不接种）的对照样品相比均呈明显上调趋势,同时endoPG1表达迅速且高于endoPG2。【结论】 烟草靶斑病菌强致病力菌株YC-9及弱致病力菌株LF-2的内切多聚半乳糖醛酸酶基因均具有PLNO3003基因家族的保守结构域,其推测蛋白的跨膜结构间存在差异,该推测蛋白与烟草靶斑病菌同源关系最近,且endoPG1和endoPG2的推测蛋白的同源性最高;内切多聚半乳糖醛酸酶基因的表达受与烟草互作的诱导,在不同致病力菌株中存在明显差异。     

成团泛菌对玉米自交系PS056致病性基因yhfK的克隆

 【目的】通过克隆和鉴定成团泛菌(Pantoea agglomerans)的致病相关基因,阐明该种土壤习居细菌在玉米自交系PS056上引起细菌性干茎腐病的原因。【方法】利用转座子Tn5的随机插入突变特点,构建致病性菌株P. agglomerans XJ1突变体库;经对Tn5插入位点的侧翼扩增,确认突变体PA121的致病力相关基因;通过基因互补试验,证明yhfK与致病力的关系。【结果】通过对突变菌株的接种筛选,获得11个致病力丧失的突变体。Southern杂交和PCR扩增结果表明,Tn5在突变体PA121中为单拷贝插入,插入位点为细菌编码内膜蛋白的yhfK(Tn5 插入在yhfK的1 082 bp处)。将yhfK克隆到质粒pBBR1MCS上,并导入突变体PA121中进行互补,生物测定结果显示转化子完全恢复了正常的细菌生理功能,并能够在玉米自交系PS056上恢复致病力。RT-PCR试验证明,yhfK调控hrpA的转录。【结论】 成团泛菌XJ1中yhfK是调控其对植物致病性的基因之一,具有在玉米自交系PS056上引起细菌性干茎腐病的功能。