旱稻孢囊线虫ISSR反应体系的建立与优化

采用正交设计对旱稻孢囊线虫ISSR–PCR反应体系的4因素(Taq酶、模板DNA、d NTPs、引物)在4个用量水平上进行优化试验。结果表明,旱稻孢囊线虫ISSR–PCR最佳的反应体系为:在25μL反应体系中,含Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.3μL﹑模板DNA 1μL﹑d NTPs(2.5 mmol/L)2μL﹑引物(10μmol/L)1μL﹑10×PCR Buffer(20 mmol/L Mg2+plus)2.5μL。引物UBC887最适退火温度为48℃。优化的旱稻孢囊线虫ISSR–PCR的反应体系和程序有较好的重复性和稳定性。     

蛇莓RAPD与ISSR-PCR反应体系优化

采用单因素试验结合正交试验,对PCR反应体系中的5种主要反应因子Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA浓度进行优化筛选,确立了适合蛇莓基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系,RAPD反应体系(20μL):Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、Taq酶1 U、引物0.2μmol/L、DNA模板60 ng;ISSR反应体系(20μL):Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、Taq酶0.5 U、引物1μmol/L、DNA模板60 ng。利用确立的体系对24份蛇莓种质进行扩增,结果条带清晰明亮,多态性好。     

海南野生荔枝ISSR反应体系优化及应用

为获得最佳野生荔枝ISSR反应体系,用引物(AG)_8YC,采用单因子试验,优化了ISSR反应体系。结果表明,总体系20μL中,含1．0×(1．5 mmol/L Mg~(2 ))Buffer,0．1～0．15mmol/L dNTPs,0．2μmol/L引物,1．0～1．25U Taq酶,70ng DNA模板,不足体积用无菌超纯水补足。并利用该优化后体系对23条ISSR引物进行筛选,对33份野生荔枝样进行ISSR扩增,证实了该体系稳定可靠。     

亮叶蜡梅ISSR反应体系的建立与优化

为了建立和优化亮叶蜡梅(Chimonanthus nitens Oily.)的ISSR反应体系,对模板DNA的浓度、引物浓度、Mg2+浓度等影响因子进行了筛选.结果表明:在25 μL的反应体系中,含有40 ng模板DNA、1 U Taq酶、0.2 mmol/L dNTP、0.3μmol/L引物、1.5 mmol/L Mg2+、2.5μL 10×buffer的扩增效果最好.利用该优化的反应体系,筛选出了12条稳定性强、清晰度高、多态性高的ISSR引物,并对筛选出的12条引物在不同退火温度(51～56℃)下的扩增效果进行了比较,从而确定了每个引物的最佳退火温度.     

麻栗坡兜兰ISSR引物筛选及反应体系的优化

[目的]对麻栗坡兜兰ISSR引物进行筛选,并建立一个稳定性高、重现性好、适合麻栗坡兜兰ISSR反应体系。[方法]以麻栗坡兜兰DNA为模板,分别对Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、DNA等PCR反应成分进行优化,并用优化的体系对25条兰科中报道的ISSR引物进行筛选。[结果]确立了麻栗坡兜兰最适ISSR-PCR反应体系:在25μl反应体系中,Mg2+2 mmol/L、引物0.4 mmol/L、dNTP 0.20 mmol/L、DNA 1.5μl、Taq酶1.4 U。利用该体系,共筛选得到10条ISSR引物用于麻栗坡兜兰分析,并对21份麻栗坡兜兰材料进行扩增,获得了较好的扩增效果。[结论]该体系稳定可靠,为今后ISSR标记在兜兰属植物的种质鉴定、遗传多样性等方面的广泛应用奠定了重要基础。     

毁灭炭疽菌RAPD和ISSR-PCR最佳反应体系的建立

对影响PCR反应的主要因子-Md2+、dNTP、Taq酶、引物浓度进行优化,建立起适合于毁灭炭疽菌基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系.RAPD反应体系(25μL):Mg2+浓度为2.5 mmol/L,dNTP浓度为200 μmol/L,Taq酶用量为1U,引物浓度1μmol/L.ISSR反应体系(25μL)为:Mg2+浓度为2 mmol/L,dNTP浓度为150μmol/L,Taq酶用量为0.5 U,引物浓度为1.25 μmol/L.     

洋桔梗ISSR最佳反应体系的建立与品种遗传多样性检测

利用正交设计,对影响洋桔梗ISSR反应的主要因素进行了优化,建立了洋桔梗ISSR的最佳反应体系。在25μL的PCR反应体系中,含2.5μL 10×PCR buffer、1.5 mmol/L Mg2+、0.3 mmol/L dNTPs、0.2μmol/L引物、30 ng/μL洋桔梗基因组DNA模板及2.0 U的TaqDNA聚合酶。试验结果表明,该反应体系具有良好的稳定性和通用性。8个不同基因型洋桔梗材料遗传多样性检测结果表明,该ISSR分子标记可有效地检测出其中4个不同品种之间、同一品种F1代及F2代之间的遗传多样性,但未能检测出同1个品种F1代2个株系之间或2个转基因株系之间的遗传多样性。     

月季SSR反应体系的优化

以月季品种'月月粉'为试材,利用CTAB法提取DNA,对影响SSR-PCR扩增体系的主要因子设计了多梯度的优化实验,建立了适用于月季的SSR反应体系:总反应体积为25μL,包括模板DNA溶液(20 ng/μL)2μL,10×PCR buffer(Mg2+free)2.5μL,MgCl2(25 mmol/L)2.0μL,dNTPs(10mM)0.5μL,正反引物各(10μmol/L)1μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.3 μL.利用该优化体系对部分月季品种进行PCR扩增和电泳检测,扩增结果清晰且有较高的多态性,表明该体系适合用于分析月季的遗传多样性.     

荷花ISSR引物筛选及反应体系优化

利用加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物,以2个荷花品种的DNA为模板进行PCR扩增。采用单因素试验方法对荷花ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、引物、dNTP、模板DNA、Taq酶)进行浓度优化,确定了荷花ISSR反应的25μL最佳扩增体系为:10×Taq Buffer 2.5μL,Mg2+3.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物1.0μmol/L,Taq酶1.00 U,模板DNA 40 ng。筛选出8条扩增条带较好的ISSR引物,并对其引物进行梯度PCR试验,筛选出各引物对应的最佳退火温度,扩增共计获得61条ISSR条带。     

薄壳山核桃ISSR-PCR反应体系的优化

采用正交试验设计,对薄壳山核桃ISSR - PCR反应体系的主要影响因子(TaqDNA聚合酶、dNTP、引物、Mg2+和模板DNA)进行了优化,并得到了适合薄壳山核桃的ISSR - PCR扩增体系.结果表明,在20μL的ISSR - PCR反应体系中,1.0U的Taq酶、0.4 mmol/L的dNTP、0.2 μmol/L的引物、2.0 mmol/L的Mg2+和40ηg的模板DNA为适合薄壳山核桃的最佳反应条件.