首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
相似文献
 共查询到20条相似文献,搜索用时 125 毫秒
1.
[目的]为研究转生长相关基因对猪的作用。[方法]采用RT-PCR方法,从13/17罗伯逊易位杂合子猪小肠组织中提取总RNA,将其纯化后作为PCR扩增模板,参考GenBank公布的猪Ghrelin的mRNA序列设计合成具有Nhe I和Hind III双酶切位点引物,扩增获得Ghrelin基因cD-NA全长序列。将准确的Ghrelin基因片段克隆于 pMD19-T simple Vector后进行序列分析,获得猪Ghrelin基因cDNA全长基因片段。经Nhe I和Hind III双酶切,将 Ghrelin基因cDNA片段连接到真核表达载体pEGFP-N1,获得真核表达载体的重组质粒pEGFP-Ghrelin。重组质粒转染猪成纤维细胞,观察标记基因荧光蛋白的表达。[结果]13/17罗伯逊易位杂合子猪的Ghrelin基因与已发表的序列相同,并成功获得具备猪Ghrelin基因全长cDNA序列的真核表达载体pEGFP-Ghrelin。[结论]构建的真核表达载体可以用于转基因猪的进一步试验,同时也为研究Ghrelin的调节机制奠定基础。  相似文献   

2.
猪流产衣原体CP/12株omp-1基因的克隆与表达   总被引:4,自引:2,他引:2  
为观察重组MOMP蛋白的免疫活性,揭示omp-1基因(编码MOMP蛋白)在猪流产衣原体诊断和防治中的作用,用PCR法扩增猪流产衣原体omp-1基因,将特异性扩增片段克隆入pMD18-T载体,测序比较分析序列后确认为目的基因,与GenBank中4株流产衣原体omp-1基因和氮基酸序列的相似性均达99%,与其他各型衣原体代表株的相似性为71%~88%,氨基酸序列也有较大差异。将omp-1基因亚克隆到pET-32a表达载体上,再对重组表达载体转化BL21(DE3)表达宿主菌,以IPTG诱导该重组菌,结果显示该重组菌表达了融合蛋白;用猪流产衣原体多克隆抗体对表达的重组MOMP蛋白进行Western blot试验,结果显示该重组MOMP蛋白具有结合特异性抗体的活性。  相似文献   

3.
参照GenBank上已发表的鸡白细胞介素2序列设计引物,运用RT-PCR技术,从经ConA诱导的 20~35日龄固始鸡脾细胞总RNA中扩增出目的片段,IL-2基因,将其插入到pGEM-T载体上,构建了克隆质粒 pGEM-T-chIL-2。测序结果表明,本试验克隆的固始鸡白细胞介素2基因与GenBank上已发表的序列相比,存在2 个核苷酸变异。重新设计表达引物,以克隆质粒pGEM-T—chIL一2为模板PCR扩增表达片段,对表达片段进行 Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切,连接到作同样双酶切的pET28a表达载体上,鉴定后转化大肠杆菌BL21并进行IPTG 诱导表达,然后对表达产物进行SDS-PAGE电泳鉴定,结果表明,表达蛋白主要以包涵体的形式存在,表达蛋白分子质量约为18 ku;目的蛋白表达量占总量的18%。体外活性检测表明,重组蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性。  相似文献   

4.
猪IL-12p40竞争定量RT-PCR检测方法的建立   总被引:1,自引:0,他引:1       下载免费PDF全文
根据GenBank中猪IL-12p40的序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增377 bp的部分基因片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含IL-12p40部分基因片段的重组质粒. 利用反向PCR技术构建与扩增377 bp片段共用同一对引物但扩增255 bp片段的竞争重组子. 通过重组质粒与竞争重组子竞争定量PCR方法(qc-PCR),建立了猪IL-12p40的标准竞争曲线和直线回归方程.  相似文献   

5.
根据GenBank上已发表的Hoxc9基因序列和本实验室前期构建绒山羊cDNA文库中Hoxc9基因部分序列设计引物。利用PCR技术从内蒙古绒山羊血液基因组DNA中扩增了Hoxc9基因,目的基因片段纯化后连接到PMD19-T载体,将鉴定的重组质粒进行测序,测序结果通过与GenBank中序列比对分析,确定扩增序列为Hoxc9基因,将该基因DNA序列提交至GenBank,登录号为DQ873298,DNA序列长为3308bp,cDNA序列长783bp,编码260个氨基酸。在此基础上利用生物信息软件对该序列结构特征进行分析。  相似文献   

6.
根据GenBankTM中发表的牛IL-15基因序列设计并合成了特异性引物,以经LPS和ConA刺激的牛外周血单个核细胞提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出长度约500 bp的目的基因片段,并将该基因克隆到pMD18-T载体上.酶切、PCR及序列测定结果表明,获得了牛IL-15全长基因的克隆.进一步通过PCR方法得到缺失其N端48个氨基酸的信号肽序列的牛IL-15成熟蛋白基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a上,构建重组表达质粒pET-IL-15,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,该菌表达以包涵体形式存在的相对分子质量约为33 000的融合蛋白.用Ni螯合层析方法纯化表达的蛋白.Western-blot试验显示表达的重组融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应,同时也能与鼠抗猪IL-15的多克隆抗体发生明显交叉反应.  相似文献   

7.
根据GenBank中公布的牛BMAP-28基因mRNA序列设计引物,利用RT-PCR技术从牛骨髓总RNA中扩增出BMAP-28基因片段,将其克隆到pMD-18载体上,通过PCR、酶切和测序分析鉴定,获得重组克隆载体pMD18-T-BMAP28.以重组质粒为模板,扩增BMAP-28基因的去信号肽片段,转入原核表达载体PE...  相似文献   

8.
参考GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列,用Oligo6.0软件设计一对特异性引物,从患犬瘟热的犬全血样品中提取总RNA,经RT—PCR扩增得到1572bp的基因片段,将其插入pMD18-T克隆载体中构建了pMD18-CDVN重组质粒,将其转入到大肠杆菌DH5a中,进行鉴定、测序。将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-2连接构建了pGEX-4T-2-CDVN重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,进行鉴定、测序、IPTG诱导表达。序列分析表明克隆的CDVN蛋白基因从起始密码子ATG开始到终止密码子TAA结束全长为1572个核苷酸,与GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列相比同源率达到93.9%~99.1%。Western-blotting分析显示表达产物为84kDa的融合蛋白,可被犬瘟热抗血清所识别,具有良好的抗原性。  相似文献   

9.
根据GenBank发表的PCV2序列设计一对特异性引物,采用PCR方法,扩增PCV2 ORF2基因,将ORF2基因插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移载体pPI-2.EGFP-ORF2与伪狂犬病毒SA215株基因组共转染真核ST细胞,通过空斑纯化得到了表达猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因和绿色荧光蛋白基因的重组伪狂犬病毒SA215(C)。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的ORF2基因蛋白和绿色荧光蛋白。并且重组病毒及亲本株在同一细胞上的增殖滴度基本相同,表明EGFP和PCV2 ORF2基因的插入不影响PRV SA215的增殖。该重组病毒可作为猪Ⅱ型圆环病毒和伪狂犬病毒候选疫苗毒株。  相似文献   

10.
对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对SARS病毒N蛋白基因进行了RT—PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM—T连接得到重组质粒pGEM—N,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp,编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比,核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100%。将pGEM—N双酶切.回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pE328a中,构建了重组质粒pET—N;将其转化表达菌BI21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS—PAGE结果表明:重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Westem—blotting证实,重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43%。  相似文献   

11.
根据Gen Bank中山羊IL-2基因序列(登录号:NM_001287567)设计一对特异性引物,采用RT-PCR技术从贵州黑山羊外周血淋巴细胞中扩增IL-2基因,并将其克隆到p MD19-T载体上,构建IL-2基因克隆质粒,通过质粒PCR、双酶切和序列测定进行鉴定,对其核苷酸、氨基酸进行了比对分析并绘制系统进化树。结果表明,贵州黑山羊IL-2基因大小为468 bp,编码155个氨基酸。该基因与山羊、绵羊、藏羚羊、蓝牛羚、林麝、猪、牛、猫、大熊猫、犬、人、鼠、鸡等动物的核苷酸一致性在39.6%~100%,氨基酸一致性在26.7%~100%,遗传进化树表明,贵州黑山羊IL-2基因与鸡亲缘关系最远。  相似文献   

12.
实验应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,在国内首次从ConA诱导培养的中国大耳白肉兔外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到IFN-γ、IL-2和IL-4基因,并将其克隆到PGEM-T载体中,经菌落PCR鉴定、序列测定及序列分析,结果表明:①经克隆得到的IFN-γ基因(序列号:DQ852341),与Genbank中已登录的欧洲兔IFN-γ基因(序列号:AB010386)的核苷酸序列和推知氨基酸序列的同源性均为100%;与其他哺乳动物如犬、猫、人、猪、牛、羊、马、大熊猫和鼠等的核苷酸同源性在63.0%(鼠)~77.6%(人)之间;编码氨基酸同源性在41.7%(鼠)~65.7%(人)之间;②扩增得到的IL-2基因(序列号:DQ852342),与Genbank中已登录的欧洲兔IL-2基因(序列号:AF068057)的核苷酸序列和推知氨基酸序列的同源性分别为99.6%和100%;与其他哺乳动物如犬、猫、人、猪、牛、羊、马、大熊猫和鼠等的核苷酸同源性在64.8%(鼠)~86.0%(人)之间;编码氨基酸同源性在55.7%(鼠)~80.1%(人)之间;③扩增得到的IL-4基因(序列号:DQ852343),与Genbank中已登录的欧洲兔IL-4基因(序列号:AF169169)的核苷酸序列和推知氨基酸序列同源性均为100%;与其他哺乳动物如犬、猫、人、猪、牛、羊、马、大熊猫和鼠等的核苷酸同源性在57.0%(大熊猫)~69.8%(人)之间;编码氨基酸同源性在43.0%(鼠)~53.6%(人)之间。用这3个基因分别构建的进化树结果都表明,兔与人的亲缘关系相对较近,与鼠的亲缘关系最远,这与传统的分类地位基本吻合,即兔与鼠应分别归为兔形目和啮齿目动物。  相似文献   

13.
根据GenBank上发表的牛IL-2(M13204)基因序列,应用Primer Premier5引物设计软件自行设计一对引物,以ConA刺激培养24 h的奶牛外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出奶牛IL-2基因,然后测序.结果表明克隆的奶牛IL-2基因大小477 bp,编码158个氨基酸,与GenBank上发表的牛IL-2基因序列比较,其核苷酸的同源性99.4%,与马、猪、猫、狗、山羊、绵羊的核苷酸的同源性分别为31.8%,32.0%,31.6%,30.3%,30.8%,31.0%.  相似文献   

14.
三元杂交猪IL-18全基因的序列测定及分析   总被引:1,自引:0,他引:1  
白细胞介素-18(IL-18)又称γ干扰素诱导因子(IGIF),研究表明IL-18是一种重要的新型免疫佐剂分子。为探讨猪IL-18的免疫佐剂作用,该研究根据已发表的猪IL-18基因序列,设计并合成1对特异性引物,从猪脾脏中直接扩增得到猪IL-18全基因,并进行克隆和序列测定、分析。  相似文献   

15.
猪β防御素-2基因在HEK293T细胞中的表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致。表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达。  相似文献   

16.
猪IgG H链基因CH2-CH3的克隆和分析   总被引:1,自引:0,他引:1  
根据已发表的猪IgG H链序列,设计了1对通用引物,从猪外周血淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增IgG H链基因CH2-CH3序列,并克隆入pMD18-T Simple载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经SalI和XbaI双酶切鉴定,筛选出阳性克隆。核酸序列测定分析表明,IgG H链基因CH2-CH3序列全长为669 bp,编码CH2-CH3的221个氨基酸和J区的1个脯氨酸。利用DNASTAR软件将其与猪IgG H链各CH2-CH3序列进行比较,发现其与U03778-1、U03779-2a、U03780-2b、U03781-3、U03782-4的核苷酸序列同源率分别为92.1%、98.4%、98.5%、93.0%和97.2%,推导的氨基酸序列同源率分别为86.5%、96.4%、96.5%、87.0%和94.2%。经进化树分析提示,该序列可能为一个新的亚型。  相似文献   

17.
采用RT-PCR法从ConA诱导培养的德系安哥拉长毛兔和白色獭兔外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到白细胞介素-2基因(IL-2),经序列测定表明,长毛兔和獭兔IL-2基因大小均为462 bp,两序列碱基组成无差异,该基因编码一个由153个氨基酸组成的多肽,包括20个氨基酸残基的信号肽和133个氨基酸残基的成熟肽。德系安哥拉长毛兔和白色獭兔IL-2基因间同源性为100%,与欧洲野兔及中国白兔的IL-2基因同源性分别为99.4%和98.9%。与GenBank中报道的猿、人、猕猴、狒狒、猫、马、大熊猫、犬、猪、水牛、山羊和鼠的IL-2核苷酸同源性分别为86.9%、86.7%、86.2%、86.1%、84.3%、84.3%、82.8%、82.6%、81.4%、76.9%、76.7%、75.0%。进化树分析发现,兔和猿的IL-2亲缘关系最近。通过脂质体法转染COS-7细胞,获得具有一定生物学活性的IL-2蛋白。  相似文献   

18.
[目的]为进一步研发新型抗病毒制剂和疫苗佐剂、有效控制猪重大传染病奠定基础。[方法]根据GenBank中猪白细胞介素-18基因(IL-18)序列,设计1对特异性引物,应用RT-PCR方法从河南三元杂交猪脾脏淋巴细胞中扩增猪IL-18基因,并进行克隆、序列测定和分析。[结果]猪IL-18基因全长为579 bp,编码192个氨基酸的无活性前体蛋白,但前体蛋白并不含典型的疏水信号肽,在第35位氨基酸残基处有1个潜在的白细胞介素1β转换酶(ICE)剪切位点,剪切后变为具有生物活性的猪IL-18成熟蛋白。序列分析结果表明,该试验获得的猪IL-18基因与已知猪IL-18基因序列同源性很高,均为96%以上,其推导的氨基酸同源性在98%以上。[结论]该研究成功构建了猪IL-18基因的重组真核表达载体并得到了具有生物活性的瞬时表达产物。  相似文献   

19.
[Objective] The study aimed to clone interleukin-2(IL-2) gene from Sichuan white goose. [Method] Based on the IL-2 gene of duck accessed in GenBank, a pair of primers was designed for cloning IL-2 gene from total RNA of peripheral blood lymphocytes of Sichuan white goose stimulated by ConA via RT-PCR technology. The yielded fragment was sequenced for bioinformatics analysis. [Result] The full length of IL-2 gene of Sichuan white goose is 468 bp that contains a 441 bp open reading frame(ORF), encoding 146 amino acid residues. Bioinformatics analysis shows that the amino acid sequence of IL-2 gene of Sichuan white goose contains four phosphorylation sites, a glycosylation site and a signal peptide with 21 amino acid residues. Homologies of IL-2 nucleotide sequence and amino acid sequence between Sichuan white goose and duck, chicken, turkey are 92.7%, 77.5%, 78.2% and 85.8%, 65.5%, 64.1%, respectively. By contrast IL-2 nucleotide sequence and amino acid sequence between Sichuan white goose and mammalian and rodents such as human, monkey, rat, bovine, horse, pig, cat, mouse, rabbit and deer, are all less than 45% and 28%, respectively. [Conclusion] The IL-2 gene of Sichuan white goose has closer genetic relationship with those of chicken and duck.  相似文献   

20.
克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因,并进行序列分析及原核表达。根据GenBank公布的PRRSV ORF5基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV陕西分离株糖基化囊膜蛋白基因ORF5,将其克隆入pGEM-T载体中,进行测序及序列分析。再设计另外1对引物扩增ORF5缺失编码N端31个氨基酸残基的基因片段,将截短的ORF5基因亚克隆入原核表达载体pET-32a中,在大肠杆菌BL21中进行原核表达。结果扩增到603 bp的PRRSV全长ORF5基因,序列分析表明,分离株与北美型代表株VR-2332和欧洲型代表株LV氨基酸同源性分别为87.8%和54.5%。因此推测陕西分离株属于北美型。SDS-PAGE可检测到大小约为38 ku的融合蛋白,主要以可溶性蛋白形式存在。West-ern-blot分析表明,重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。  相似文献   

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号