几丁质酶基因转化番茄的研究

以金丰一号亲本JM、JF为转化材料，建立了以子叶为外植体的离体再生体系，其芽分化培养基为MS ZT 2．0mg/L IAA0．2mg／L，生根培养基为MS。借助植物双元表达载体pROK，用农杆菌(LBA4404)与番茄子叶外植体共培养，把几丁质酶基因和抗除草剂BAR基因转化到番茄上。经过卡那霉紊和Basta的筛选和再生培养，获得转化再生植株。采用浓度为1000mg/L的Basta除草剂溶液涂抹再生植株后代叶片，表现明显抗性。对转化再生植株进行了PCR检测、Southern检测，表明上述基因已整合进番茄基因组中。     

根癌农杆菌介导观赏羽衣甘蓝遗传转化体系优化

为建立稳定的羽衣甘蓝遗传转化体系,以羽衣甘蓝自交系'Mark 10','W02-7'和'Curly 6'为试材,通过单因子试验,比较羽衣甘蓝子叶、子叶柄、子叶片、下胚轴4种外植体的再生能力,筛选培养基中的适宜激素浓度,优化了羽衣甘蓝不同外植体的再生体系。将播种后6d的子叶于最适再生培养基上进行黑暗预培养,以根瘤农杆菌为介导侵染子叶后,于黑暗条件下进行农杆菌与植物材料的共培养。随后转入含有头孢霉素的抑菌培养基中进行抑菌培养,再将子叶移入含有卡那霉素浓度的筛选培养基中进行抗性芽选择,并提取植物基因组DNA进行目的基因的PCR验证,从而建立高效的羽衣甘蓝遗传转化体系。结果表明:最佳的外植体是羽衣甘蓝的子叶,在培养基MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1上,不定芽分化率可达100%;子叶经2～3d预培养,将OD600值为0.3～0.5的携带DFR基因表达载体的农杆菌菌液离心,以50mL MS重悬液重悬,侵染外植体5min,共培养2d;采用头孢霉素300mg·L-1,抑菌培养3d后,采用10mg·L-1卡那霉素进行抗性芽选择。在播种后30～40d共获得了24个抗性芽,以抗性芽的基因组DNA为模板进行PCR扩增,9株呈DFR阳性,显示外源基因已经成功整合到羽衣甘蓝基因组中,平均转化率为37.5%。本研究结果可以为羽衣甘蓝重要性状基因的遗传转化提供依据。     

农杆菌介导菜豆几丁质酶基因转化洋桔梗

通过农杆菌介导法将抗真菌的几丁质酶基因转入洋桔梗,以提高其对真菌病害的抗性。结果表明,成功克隆了抗真菌活性较强的菜豆几丁质酶基因,构建了植物表达载体,并对洋桔梗Double Mariachi Pink叶块进行转化,获得了卡那霉素抗性植株,对抗性植株进行了2次PCR检测(nptⅡ基因),第1次PCR检测获得了13个阳性株系,培养60 d后再进行第2次PCR检测,获得11个阳性株系,再对生长良好的5个转基因株系进行RT-PCR检测,获得了3个阳性株系。3个阳性株系的几丁质酶平均活性(0.215 U、0.225 U和0.286 U)均显著高于未转化植株(0.133 U),转基因株系几丁质酶粗提液对大豆链霉菌5A、5E和灰葡萄孢菌3种指示真菌的抑菌圈直径均显著大于未转化植株,其中抑菌效果最好的株系对上述3种指示真菌的抑菌圈直径与对照相比,分别增大了106.00%、90.91%和71.53%。     

农杆菌介导的菜心遗传转化体系的建立

以建立的菜心高频再生体系为基础,利用GU S染色组织分析法研究了根癌农杆菌菌株、乙酰丁香酮(A S)、预培养时间、浸染时间和共培养时间等因素对菜心((B rassica camp estris L.var.p arach inesis)子叶遗传转化的影响,探讨了适宜菜心转化的卡那霉素与抑菌抗生素使用浓度。结果表明,农杆菌菌株AGL 0对菜心的浸染能力最强,添加100μm o l/L的乙酰丁香酮有利于菜心转化;子叶外植体预培养2 d后浸染(菌液浓度OD600值为0.8)15m in,共培养2 d,然后转移到含15 m g/L卡那霉素和100 m g/L T icarc illin的筛选培养基上,进行转化植株的再生,植株再生率及外植体GU S阳性率均较高,是较优的转化条件;本试验共获得8株转化植株,转化率达2.44%,经PCR分析和Sou thern杂交检测表明,GU S基因已整合进入菜心基因组。     

AP70抗病基因转化番茄的研究

[目的]通过基因工程提高番茄抗病性。[方法]通过冻融法将含萝卜抗真菌蛋白基因的质粒AP70转入农杆菌LBA4404中,再用农杆菌介导法将AP70抗病基因对番茄进行遗传转化,研究预培养、侵染时间等因素对AP70转化番茄的影响。[结果]带柄子叶诱导番茄产生不定芽的效率比子叶块效率高。农杆菌浸染番茄子叶前预培养1 d,不仅能提高子叶存活率,而且可降低共培养时外植体的污染率。农杆菌对番茄子叶的侵染时间最好不超过5 min。外植体筛选培养基中Kam的浓度不宜太高或太低,可获得少量转AP70基因的抗性芽。[结论]农杆菌对番茄子叶侵染前要进行稀释,且侵染时间不宜超过5 min,共培养1 d时转化率较高。     

植物甜蛋白基因Thaumatin Ⅱ转化番茄的初步鉴定

以番茄无菌苗的子叶为外植体,以抗卡那霉素的NPTⅡ作为选择标记基因,通过根癌农杆菌介导法,将甜蛋白Thaumatin Ⅱ基因导入番茄中,共获得10株独立的抗性转化株系。对抗性转化株系进行了PCR和Southern blotting鉴定,PCR检测得到了预期的特异条带,Southern blotting结果表明其中1个转化株系插入了2个拷贝的Thaumatin Ⅱ cDNA。以上试验结果证明Thaumatin Ⅱ基因已经整合到转基因番茄植株的基因组中,为最终获得在蛋白质水平表达Thaumatin Ⅱ的无选择标记的转基因番茄打下了基础。     

含烟草几丁质酶基因的质粒pBG1121的构建及水稻转化

烟草几丁质酶基因已转入番茄、烟草等作物中，并得到了抗病基因植物，为了检验该基因转入水稻后，能否得到抗病的水稻，构建了适于水稻转化的质粒pGB1121。将烟草几丁质酶基因（TchiB）连上CaMV35S启动子和Nos终止区构建成融合基因，再将CaMV35S启动了／TchiB编码区／Nos终止区融合基因插入到双元载体pCAMBIA1301的多克隆酶切位点，得到一个13．9kb具有几丁质酶基因和潮霉素抗性基因的转化质粒pBG1121，进行酶切和PCR检验后，用共器介导法转化水稻，后代植株用潮霉素处理，经PCR检验，初步证实已将目的基因整合到受体植物的基因组中。     

番茄果实ABA合成酶NCED基因的克隆及其RNAi遗传转化体系的建立

以番茄为材料,根据ABA合成关键酶编码基因NCED的保守序列设计引物,通过RT-PCR方法从番茄果实中克隆了2个NCED基因片段,Le NCED1和Le NCED2。通过农杆菌介导法进一步建立了‘嘉宝’番茄Le NCED1基因的RNAi再生和转化体系,并研究影响番茄遗传转化的4个因素外植体类型、预培养时间、激素组合、农杆菌侵染时间。结果表明:番茄子叶预培养2 d,用农杆菌LBA4404侵染5 min后,避光共培养2 d,在加入1mg/L 6-BA+0.05 mg/LIAA+5 mg/L潮霉素的MS培养基上可以诱导出芽,转入添加0.1 mg/LIAA+7 mg/L潮霉素的1/2 MS培养基上可以使芽生根。本实验共获得26株抗性植株。GUS染色证明,有9株抗性植株成功转入含有NCED基因RNAi载体的T-DNA,为深入了解ABA促进番茄果实成熟的机理提供了方法和材料。     

内生细菌EBS05对番茄病程相关蛋白的诱导作用研究

以番茄江蔬14为材料,研究了内生细菌EBS05对番茄病程相关蛋白基因表达的诱导作用,同时,测定了番茄体内β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性变化.结果表明,内生细菌EBS05可诱导番茄体内PR1,PR2和PR3基因持续增量表达,并有效激活PR5基因表达,进而提高番茄对番茄黄化曲叶病毒(TYLCCV)的系统抗性;内生细菌EBS05诱导处理再接种TYLCCV后,番茄体内β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性均明显高于对照,并分别于接种后第7 d和第9 d达到活性峰值.结合TYLCCV侵染番茄的病程分析,β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性的升高与内生细菌EBS05诱导番茄对TYLCCV的系统抗性呈正相关.     

新疆伽师瓜高效再生系统建立及抗真菌病基因转化

成熟子叶切块作为外殖体,经过组织培养获得再生植株。以MS作为基本培养基,取3日龄子叶块外殖体,选用MS 6-BA1.5 mg/L IAA0.3 mg/L诱导丛生芽,最高诱导率可达78%。而且分化再生过程,6-BA的浓度逐渐降低。在生根培养时,用MS 0.3 mg/L NAA诱导生根率较高,根系粗壮。在建立甜瓜高效再生体系的基础上,用根癌农杆菌介导法将几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因导入新疆甜瓜中,经卡那霉素的抗性筛选,获得转化的再生植株。用PCR反应及Southern-blot检测,进一步研究了再生植株的基因整合与表达情况。经PCR扩增反应和Southern-blot检测均得到了与阳性对照一致的特异性带,可初步证明外源基因已整合到了甜瓜基因组中。     

苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

[目的]研究来源于苏云金芽孢杆菌的几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的表达情况。[方法]以苏云金芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增获取几丁质酶基因chiA,将其与枯草芽孢杆菌表达载体pHSG连接,构建重组菌,经IPTG诱导后,检测培养液中的几丁质酶活性。[结果]扩增得到几丁质酶基因chiA大小为2.5 kb。构建的重组菌对底物[4-MU-(GlcNAc)3]显示出一定的水解活性,培养液酶活约为2.8 U/ml,而pHSG空质粒转化子在同样条件下其培养液没有明显酶活。该重组酶的最适pH值为6.5,最适反应温度为50℃,与苏云金芽孢杆菌自身产生的几丁质酶性质一致。[结论]几丁质酶基因chiA能在枯草芽孢杆菌中成功表达,表达产物可成功分泌到细胞外。     

农杆菌介导gag基因和gp120基因转化番茄的初步研究

以4个番茄品种为材料，通过对子叶和茎段培养，建立了番茄组织培养的再生体系，为番茄的遗传转化提供了良好的受体系统；通过农杆菌介导，初步将HIV—l的gag基因、apl20基因和gag-apl20嵌合基因导入番茄，得到了抗性转化再生植株，再生植株PCR检测结果呈阳性，从而建立了良好的番茄遗传转化体系。     

胰岛素样生长因子1转化番茄的研究

 以MS为基本培养基，附加不同浓度BA与IAA激素组合，对番茄子叶和下胚轴进行离体培养，结果子叶芽诱导的效果明显好于下胚轴，最佳分化培养基为MS+BA 3.0mg/L+IAA 0.15mg/L。采用根癌农杆菌介导法，将胰岛素样生长因子1（Insulin-like Growth Factor-1，IGF-1）基因导入番茄中，通过多批次转化及筛选，最终获得15株抗性植株，PCR检测全部呈阳性，初步表明IGF-1基因已整合到番茄基因组中。     

转人α-乳清白蛋白基因番茄的获得

由农杆菌介导、采用叶盘法将人α-乳清白蛋白基因导入番茄外植体,经过筛选培养,获得了18株抗性植株.PCR分析和GUS染色检测结果表明外源基因已经导入到番茄中.这一结果为进行人α-乳清白蛋白生物反应器研究奠定了基础.     

禽流感抗原基因NA导入生菜的研究

以生菜子叶为转化受体材料,利用农杆菌介导的方法将禽流感抗原基因NA导入生菜,通过用特异引物进行PCR检测,获得6株转基因植株。经PT-PCR检测,证明外源基因已整合到了生菜基因组中,且能够正常表达。     

玉米几丁质酶基因导入甘蓝型油菜的研究

以甘蓝型油菜（Brassica napus L.)下胚轴为转化材料,通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)介导将玉米几丁质酶基因（Maize Chitinase gene)导入双低油菜品种D2中,获得了抗卡那霉素（Kanamycin Kan)的再生植株,并对影响遗传转化的一些因素进行了研究。结果表明：适当的预培养对油菜下胚轴的遗传转化是必要的;油菜下胚轴遗传转化过程中的过敏反应可通过一些措施缓解;延迟筛选可提高油菜下胚轴的转化率。对抗性植株进行PCR检测表明：部分抗性植株在多次重复检测中的均显示较强的阳性反应,初步证明外源基因已整合到油菜基因组中。     

酵母SAMDC基因表达载体构建以及农杆菌介导转化番茄的研究

SAMDC(腺苷甲硫氨酸脱羧酶)是参与植物多胺合成的一个关键酶.通过GenBank上已经发表的序列,设计两对引物,分别以酵母基因组DNA和番茄基因组DNA为模板克隆出SAMDC基因和E8启动子.构建了以CaMV35S和E8为启动子的两个SAMDC基因植物表达载体,酶切分子鉴定后,经农杆菌介导以叶盘法转入番茄中,获得了转基因植株.经PCR检测和X-Gluc组织化学染色检测,目的基因已经成功转入番茄中.为研究多胺在番茄中代谢活性以及SAMDC基因对番茄抗逆性和番茄果色的影响提供了研究基础.     

利用转基因番茄表达血管内皮生长因子的研究

【目的】应用基因工程技术,获得表达血管内皮生长因子（VEGF）的转基因番茄植株,为以番茄作为生物反应器生产药用蛋白奠定基础。【方法】利用植物偏好的密码子改造合成VEGF基因全长,构建植物表达载体p1390RVEGF,通过农杆菌菌株EHA105介导将其T-DNA区转入到番茄细胞中,再生后获得转基因番茄植株,对其进行分子和蛋白水平检测。【结果】成功构建了植物整株表达载体p1390R-VEGF,建立了高频的番茄再生培养体系;PCR检测、Southern blot和Western blot检测结果表明,VEGF基因已经转入番茄中,并成功得到了表达。【结论】得到了转基因番茄植株和果实,且VEGF蛋白有良好的抗原性。