圆白鲳消化道菌群PCR-DGGE基因指纹图谱构建

采取免培养的16S rDNA梯度凝胶电泳(DGGE)技术对集约化海水网箱养殖圆白鲳Ephippus orbis(体重17.7±3.0 g)包括胃壁、胃内容物、肠壁及肠内容物在内的消化道菌群结构进行了初步分析.DGGE指纹图谱显示圆白鲳胃内容物、胃壁及肠壁有7条明显条带,肠内容物有6条明显条带,提示圆白鲳消化道可能存在着较丰富细菌群落;针对指纹图谱的聚类分析表明胃内容物及肠内容物细菌组成相似度最高达90.0%,而胃壁与肠壁的相似度相对较差达80%.半定量分析表明圆白鲳消化道菌群相对丰度的变异系数均大于47.4%,暗示圆白鲳消化道趋向于以一种或极少数种细菌占统治地位.     

3种DNA提取方法对养殖池塘不同生境菌群PCR-DGGE分析的影响

比较3种DNA提取方法(溶菌酶法、CTAB法及珠磨法)对养殖池塘几种生境(底泥、饲料、草鱼肠道内容物及肠道壁)菌群PCR-DGGE分析的影响。结果表明,以3种提取方法获得的DNA为模板均能进行16S rDNA V3区特异性片段扩增；但不同DNA提取方法对池塘不同生境菌群DGGE指纹图谱存在显著影响。DGGE指纹图谱显示草鱼肠道内容物菌群(溶菌酶法)与肠道壁菌群(溶菌酶法)存在较高一致性,底泥菌群(CTAB法)及饲料菌群(溶菌酶法)与鱼体肠道菌群(包括内容物菌群和肠道壁菌群)则存在明显差异,但肠道菌群与底泥菌群的相似度相对更高。研究提示采用微生物分子生态学工具对养殖池塘不同生境进行菌群结构分析时,需提前优化DNA提取方法；在以投饲为主的养殖鱼塘中,草鱼肠道菌群更多源自于池塘底泥。     

基于PCR-DGGE技术的冷藏牡蛎鳃部菌群分析

应用PCR-DGGE技术研究4℃冷藏期间牡蛎鳃部菌群的动态变化及腐败菌群.直接从牡蛎鳃部中提取细菌总DNA,对细菌的16S rDNA的V3区进行PCR扩增,扩增产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),分析DGGE微生物指纹图谱.DGGE指纹图谱结果表明,新鲜牡蛎鳃部菌群复杂,随冷藏期的变化菌条带变化明显;整个冷藏期间Lactococcus raffinolactis和Enterobacter sp.为牡蛎鳃部的优势菌,牡蛎冷藏后期腐败的主要菌群为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、气单胞菌属(Aeromonas spp.)、乳球菌属(Lactococcus spp.)、肠杆菌属(Enterobacter spp.)、Weissella confusa和Lactobacillus sakei.     

虾夷马粪海胆不同肠道中菌群组成及其PCR-DGGE图谱分析

利用细菌16S rDNA PCR-DGGE指纹图谱技术,对虾夷马粪海胆不同肠道的微生物菌群组成进行分析,结果表明:海胆小肠与大肠样品分别得到14条与13条条带,其中,共有条带为10条,优势条带分别为7条与5条,特异性条带分别为4条与3条;经后续条带比较分析和DGGE图谱割胶测序后发现,小肠与大肠样品中微生物主要来源于外界海水环境,其菌群构成存在差异与虾夷马粪海胆消化巨藻存在不同有关。     

双齿围沙蚕消化道共栖微生物菌群多样性的PCR-DGGE分析

将采自青岛市沿海潮间带的双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis(体质量为4～5 g)置于无菌海水中暂养24 h后,分别从5条双齿围沙蚕消化道中提取微生物基因组总DNA,应用细菌16S rDNA通用引物341f/534r进行细菌16S rDNA基因V3高变异区的PCR扩增,再将PCR产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),从而获得样品消化道共栖微生物群落特征的DNA指纹图谱。通过对指纹图谱半定量分析发现,采集的双齿围沙蚕消化道共栖微生物菌群多样性丰富,优势条带明显,不同个体间既存在共同的微生物种属,也有各自特异的种属。其中存在一条共同的优势条带,但优势条带含量存在个体间差异。分别对DGGE指纹图谱中公共条带序列进行测序比对,结果表明,产丙酸菌属Propionigenium分别为5个样品中的优势菌群,假交替单胞菌属Pseudoalteromonas广泛分布于双齿围沙蚕消化道中。研究表明,基于16S rDNA的PCRDGGE图谱技术是分析双齿围沙蚕及其他海洋沉积食性无脊椎动物消化道微生物菌群结构较为有效的手段。     

腹泻仔猪肠道菌群的ERIC-PCR指纹图谱分析

【目的】分析腹泻仔猪周围环境菌群变化规律,为仔猪腹泻的诊断和治疗提供支持。【方法】采集健康对照和腹泻仔猪粪便、口腔以及产床和母猪乳头等样品,采用ERIC-PCR技术分析其菌群结构特征,并对粪便样品中的细菌进行分离和鉴定。【结果】对照组4类样品细菌ERIC-PCR指纹图谱十分相似,腹泻组各类样品之间电泳条带差异较大,出现了异常亮度的电泳条带,与对照组优势条带位置不同,其中口腔和母猪乳头部位电泳条带数显著低于对照组(P0.05),菌群多样性指数降低,优势度指数升高。从粪便样品中分离出2株可疑菌株b1和b2,细菌染色和生化试验初步证明分离株b1和b2分别符合大肠杆菌和奇异变形杆菌的特征;利用ERIC-PCR技术分析分离株b1和b2的指纹图谱,发现分离优势细菌的ERIC-PCR指纹图谱包含于粪便样品的ERIC-PCR图谱中,证明样品的ERIC-PCR指纹图谱能够反映出优势菌群的特征;测序结果显示,分离株b1与大肠杆菌基因组同源性为99%,分离株b2与奇异变形杆菌基因组同源性为98%。【结论】腹泻仔猪周围环境菌群发生明显变化,ERIC-PCR技术可以快速、准确地监测和诊断菌群结构的变化,有助于细菌性仔猪腹泻的诊断和治疗。     

PCR-DGGE 技术分析不同染料对厌氧污泥中微生物群落结构的影响

为了揭示在生物法处理印染废水过程中废水所含染料种类的变化对厌氧脱色菌群群落结构的影响,采用8 种不同的染料进行浓度梯度驯化从厌氧污泥中富集得到的脱色菌群,测定了驯化后菌群对其驯化染料的脱色率,并将获得的各个菌群基因组DNA 以细菌16S rDNA V3 区通用引物进行PCR 扩增,将扩增产物进行变性梯度凝胶电泳（DGGE）,获得菌群的基因组DNA 特征指纹图谱。脱色试验结果显示,经偶氮染料驯化后的菌群对其驯化染 料的脱色率要高于经蒽醌染料驯化的菌群。DGGE 图谱表明经不同染料驯化后,菌群结构发生了显著变化,其中菌群经活性黑5 和酸性蓝127 驯化后菌种数减少明显。另外,对菌群的12 条优势菌条带进行克隆测序,通过Blast 比对,它们分别属于乳杆菌属（Lactobacillus）、肠球菌属（Enterococcus）、乳球菌属（Lactococcus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）,在菌群对染料的脱色过程中发挥了重要作用。     

不同时期刺参养殖池塘海水菌群结构分析

对辽宁省大连市瓦房店刺参养殖池塘海水菌群结构组成和变化情况进行分析,采集不同时期刺参养殖池塘海水,扩增细菌16S r DNA基因V3可变区序列,进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),分析指纹图谱,并对主要条带进行切胶、回收和测序。结果表明,不同时期海水各样品的多样性指数在1.994 5~2.230 5之间,均匀度差异不大,样品的丰富度在42~48之间。不同时期海水中3月和9月的菌群结构最为相近(80%),6月与其他各时期聚类距离最大。对39个主要条带的测序结果表明,12个条带与未培养细菌相近,1个条带与放线菌纲(Actinobacteridae)的菌株相似,另外26个条带相似菌株分别归类为黄杆菌纲(Flavobacteria)、α-变形菌纲(Alpha proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gamma proteobacteria)。黄杆菌纲、α-变形菌纲和γ-变形菌纲在各时期海水中均有出现,其中黄杆菌纲优势度最高,占23.8%~50.0%。不同时期养殖池塘海水菌群的结构相对稳定,但具体菌种存在差异。     

应用PCR-DGGE指纹技术研究真空包装火腿切片贮藏过程中的微生物动态变化

应用16S rDNA变性梯度凝胶电泳(DGGE)指纹图谱和系统发育分析方法,揭示了火腿切片在真空包装、4 ℃贮藏条件下主要微生物的动态变化.直接从火腿中提取总的细菌DNA,用巢式PCR和降落PCR扩增16S rDNA V3可变区序列,再通过DGGE得到动态变化指纹图谱.DGGE图谱表明,产品在贮藏初期具有丰富的微生物群落,说明污染微生物的多样性,但经过一段时间后,只有少数种类细菌存活并最终成为主导菌群.DGGE优势条带经DNA序列分析表明,代表最相似菌为清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)和弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus),其次是长膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)和非培养的明串珠菌(uncultured Leuconostoc).     

应用PCR-DGGE技术分析福州左海湖的细菌群落组成

应用PCR-DGGE技术对4个月份(2011年12月、2012年2月、4月、6月)的福州左海湖细菌群落组成和优势菌群进行分析,研究结果发现相同月份4个采样点的DGGE图谱差异性不大,细菌群落组成具有较高的相似性;而不同月份4个采样点的DGGE条带的数目和位置表现出明显差异,细菌群落组成差异明显。对20条不同位置的DGGE条带进行切胶回收、扩增和测序后,进行系统进化分析,结果显示这20条带归属于4个细菌类群,即变形菌门Proteobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、放线菌门Actinobacteria、蓝细菌门Cyanobacteria。20条序列中有11条鉴定为变形细菌门Proteobacteria、5条鉴定为拟杆菌门Bacteroidetes、2条鉴定为放线菌门Actinobacteria、其余2条属于蓝细菌门Cyanobacteria。研究结果表明,左海湖细菌群落组成包括了Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Cyanobacteria,其中以Proteobacteria为优势菌群。