家蚕溶茧酶基因的克隆、序列分析及原核表达

 【目的】获得家蚕溶茧酶基因的全长序列，实现溶茧酶基因在大肠杆菌中的融合表达。【方法】利用cDNA末端扩增技术（RLM-RACE）克隆了家蚕溶茧酶基因cDNA序列（GenBank 登录号：EF428980）。【结果】家蚕溶茧酶基因cDNA序列全长1 047 bp，其中780 bp的蛋白质编码区可编码260个氨基酸，预测蛋白质分子量为27.6 kD，等电点（pI）为8.89。家蚕溶茧酶基因包含4个内含子。用Signal P 3.0 Server程序分析家蚕溶茧酶基因，预测其从第1～22位为信号肽序列。SMART分析结果预测其第34～254位氨基酸序列具有类胰蛋白的丝氨酸蛋白酶活性。重组质粒pET-32a-Cocoonase 转化E.coli BL21进行原核表达，SDS-PAGE分析结果表明,家蚕溶茧酶基因以融合蛋白形式表达，相对分子量为48 kD。【结论】本研究成功地克隆、表达了家蚕溶茧酶基因，分析和预测了它的结构和功能，为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。     

扩展莫尼茨绦虫蛋白激酶C相互作用蛋白(PICK1)基因的克隆及序列分析

【目的】分离和鉴定扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)新基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础。【方法】构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;采用生物信息学等分析技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较及蛋白质二级结构的初步预测。【结果】获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因蛋白激酶C相互作用蛋白,全长1 527 bp,编码447个氨基酸,CDS预测存在明显的BAR,PDZ结构域。编码蛋白的理论分子质量为50.173 3 ku,等电点为5.22。【结论】获得了扩展莫尼茨绦虫蛋白激酶C相互作用蛋白的全长cDNA序列,为该基因功能的试验性鉴定工作奠定基础。     

猪FAM213B基因mRNA和启动子的克隆及序列分析

【目的】获得猪FAM213B基因完整mRNA和启动子序列,研究猪FAM213B基因表达,为探讨母猪妊娠的建立和胚胎发育调控机制奠定基础。【方法】通过5'RACE和3'RACE技术,获得基因完整mRNA序列,分析不同物种该基因氨基酸序列相似性;通过PCR克隆启动子区,并通过双荧光素酶报告基因载体系统转染猪子宫内膜细胞,研究其转录活性。【结果】猪FAM213B基因mRNA全长808 bp,其中5'UTR、CDS区和3'UTR长度分别为67、609(含终止密码子)和132 bp(不含poly A序列),在17~106位氨基酸之间存在硫氧还蛋白折叠结构域;与猪FAM213B基因其他2个潜在转录本相比,三者都包含硫氧还蛋白折叠结构域,但蛋白三级结构存在较大差异;猪FAM213B氨基酸序列与山羊、牛和绵羊高度相似,相似性分别为94.03%、93.03%和91.54%。克隆获得2 261 bp(-2 231/+30)的基因启动子序列,将其连接至双荧光素酶报告基因载体,转染猪子宫内膜细胞,发现获得的启动子片段能够启动下游报告基因的转录,在启动子区存在潜在的典型NFκB等转录因子结合位点。【结论】本研究获得猪FAM213B基因转录本长度为808 bp,其蛋白存在硫氧还蛋白折叠功能结构域,其启动子序列(-2 231/+30)在猪子宫内膜细胞中具有较强的转录活性。     

条锈菌诱导的小麦病程相关蛋白TaPR10基因的克隆及特征分析

 【目的】克隆条锈菌诱导的小麦病程相关蛋白PR10基因，研究其在小麦成株抗条锈病防御反应中的作用。【方法】采用电子克隆、RT-PCR技术，从条锈菌侵染的小麦兴资9104中，分离病程相关蛋白10基因;采用生物信息学技术预测分析该基因的DNA序列结构及其编码蛋白的保守域及基本特性;利用实时荧光定量RT-PCR技术，分析该基因在小麦成株期和苗期受条锈菌CYR32侵染后的表达情况。【结果】分离到病程相关蛋白10基因，命名为TaPR10，ORF长483 bp，编码由160个氨基酸组成的蛋白质TaPR10;TaPR10不含跨膜区、无信号肽、定位在胞内，除具有典型的病程相关蛋白Bet_v_I家族保守结构域外，还有其它4类功能保守域;与小麦、高粱、玉米和水稻等4种植物PR10蛋白的氨基酸序列相似性在80%左右;TaPR10 DNA序列内部存在188至271位84 bp的内含子序列，其拼接位点序列具有GT-AG双核苷酸序列;TaPR10基因表达分析的结果表明，TaPR10基因在成株期和苗期反应中表达量均上调，成株期表达高于苗期。【结论】首次分离到一个条锈菌CYR32诱导的小麦TaPR10基因，该基因可能参与了小麦成株抗条锈病防御反应。     

番茄匍柄霉SlCmr1基因克隆及其敲除载体的构建

【目的】克隆番茄匍柄霉（Stemphylium lycopersici）SlCmr1基因,并构建SlCmr1基因敲除载体,为研究该基因功能打下基础。【方法】根据NCBI数据库提供的番茄匍柄霉基因组信息设计引物,PCR扩增得到SlCmr1基因的DNA全长和CDS序列,并对SlCmr1基因编码的蛋白进行生物信息学分析。利用SlCmr1基因上、下游1100 bp左右的序列设计引物,分别PCR扩增SlCmr1基因的上、下游片段,通过酶切连接的方法将SlCmr1基因的上、下游序列分别插入载体pCX62,构建SlCmr1基因敲除载体。【结果】SlCmr1基因的DNA全长为3275 bp,CDS长度为3018 bp,有3个内含子,编码蛋白序列全长1005 aa,分子式为C₄₈₈₂H₇₆₄₂N₁₄₀₄O₁₄₉₉S₆₁,分子量为111.94 kD,理论等电点为（pI）6.64,半衰期30 h,不稳定指数58.72,亲/疏水性平均值为-0.424,预测亚细胞定位于细胞核,存在2个相邻的ZnF_C2H2结构域和1个GAL4结构域,推测SlCMR1为不含跨膜区域的非分泌、不稳定可溶性蛋白。分别将SlCmr1基因上、下游序列插入pCX62载体,成功构建了基因敲除载体pCX62-SlCmr1。【结论】SlCmr1可能是真菌调控色素合成的关键基因,在真菌的次级代谢产物合成中发挥重要作用。     

绵羊YAP1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

【目的】克隆绵羊YAP1基因cDNA并分析其序列及其蛋白的遗传特性及其在不同组织中不同程度的表达情况。【方法】以湖羊为研究对象,利用RT-PCR和RACE技术获得绵羊YAP1序列,并结合生物信息学方法对绵羊YAP1的序列进行深入分析。【结果】从湖羊背最长肌中克隆YAP1基因的全长cDNA序列;利用生物信息学技术,对绵羊YAP1基因与其它物种的同源性,蛋白质序列的跨膜区,亚细胞定位,亲水性,潜在信号肽剪切位点,糖基化位点,磷酸化位点,编码产物进行功能预测分析,及其编码蛋白的二级结构,三级结构等进行分析。【结论】克隆获得绵羊YAP1基因序列全长为1 712 bp,包括1 212 bp的编码区序列,编码403个氨基酸。同源性分析发现,绵羊YAP1核苷酸序列与推测氨基酸序列与灰仓鼠的同源性最高,分别达到78.77%和92.51%,而与人、黑猩猩的一致性差异较小。氨基酸序列分析发现该基因编码蛋白为水溶性蛋白,相对分子量为44079.0Da,理论等电点为4.91,无信号肽序列和跨膜区;亚细胞定位主要在细胞核,不属于分泌蛋白;预测含有33个磷酸化位点,7个糖基化位点,具有两个WW结构域,二级结构以无规则卷曲为主,三级结构显示,YAP1结构域区构成弯曲状螺旋结构。预测YAP1蛋白主要在调节功能过程中有着关键作用。以上研究为进一步探讨YAP1基因在肌肉生长过程中的功能研究奠定了遗传信息基础。     

绿尾虹雉(Lophophorus lhuysii)Toll样受体5基因的克隆和适应性进化分析

【目的】获得绿尾虹雉(Lophophorus lhuysii)Toll样受体5基因(TLR5)编码区序列,并对其编码区蛋白的特征及适应性进化进行分析。【方法】以绿尾虹雉基因组DNA为模板,采用PCR扩增克隆获得TLR5基因编码区序列。使用MEGA、PAML等软件对其序列特征及选择压力进行分析。【结果】绿尾虹雉TLR5基因编码区序列全长2 583 bp,共编码860个氨基酸,以亮氨酸含量最高(133/860),色氨酸含量最低(11/860)。编码蛋白为典型的Ⅰ型跨膜结构,包括富含LRRs结构域的胞外区、跨膜区和胞内TIR结构域。绿尾虹雉TLR5基因极其保守,与雉鸡(P. colchicus)的同源性最高(97.75%),与小白鹭(E. garzetta)同源性最低(85.17%)。采用位点-特异模型在胞外区共检测到3个正选择氨基酸位点(263F, 280K和645I)。【结论】绿尾虹雉TLR5基因编码区受到较强的纯净化压力,胞外区LRRs结构域可能为识别病原微生物的区域。     

不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的克隆及其在拟南芥中的转化

 【目的】克隆不结球白菜硝酸还原酶基因（BcNR ），并转化拟南芥做初步的功能鉴定。【方法】采用分段RT-PCR及3′RACE和5′RACE技术克隆了BcNR基因的全长cDNA,利用生物信息学方法进行序列分析和蛋白结构分析。构建pCAM-BcNR植物过量表达载体，通过农杆菌介导的真空渗透法将其转入野生拟南芥中，经抗性筛选及PCR验证获得T0代转基因植株，用Real-time PCR方法对30 mmol?L-1 KNO3溶液处理的转基因拟南芥的硝酸还原酶基因表达进行检测，并测定转基因植株的硝酸还原酶活性。【结果】获得了编码不结球白菜硝酸还原酶基因(BcNR )的cDNA全序列3 049 bp，包含有2 733 bp的开放阅读框，编码910个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、烟草、甘蓝型油菜、马铃薯等编码的氨基酸序列具有较高同源性。蛋白质结构域分析表明，所推导的氨基酸序列具有完整的硝酸还原酶结构，同时证明从不结球白菜中克隆的这条基因属于NADH-NR型。GenBank登录号为EU662272。转基因拟南芥T0代植株进行GUS基因PCR检测，证明重组质粒已整合到转基因植株基因组中。硝酸盐处理后的转基因植株硝酸还原酶基因的表达比野生型显著提高，且硝酸还原酶活性有不同程度的提高。【结论】本研究首次从不结球白菜中克隆获得BcNR基因的全长cDNA序列，揭示了其序列特征并对其进行了初步的功能鉴定，为进一步利用该基因开展蔬菜硝酸盐含量的基因调控研究奠定了基础。     

受病原细菌诱导表达增强的水稻转录因子基因OsBTF3的分子鉴定

 【目的】分子克隆和定性分析受水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo)诱导的水稻转录因子基因OsBTF3。【方法】用生物信息学和RT-PCR方法鉴定和分离OsBTF3基因全长cDNA序列;用原核表达和亚细胞定位方法分析产物表达及其定位;用RT-Q-PCR方法分析基因的组织表达特性和对Xoo侵染的的应答表达。【结果】从水稻品种日本晴cDNA中克隆了OsBTF3全长序列，它编码具有175个氨基酸的蛋白质，具有核定位信号和NAC保守结构域;OsBTF3与其它植物BTF3序列同源性可达79%～88%;在大肠杆菌中表达产生一个与预测分子量大小一致的27 kD蛋白质;OsBTF3::GFP融合蛋白主要在细胞核和细胞膜出现;OsBTF3基因在水稻不同发育期和组织中均有表达，但显著地受Xoo侵染的诱导而增强。【结论】成功分离了一个受Xoo诱导表达增强的水稻转录因子基因OsBTF3;OsBTF3主要定位于细胞核和细胞膜，可能在水稻感病性表达中起调控作用。     

盐芥GRP7基因的克隆和逆境表达分析

【目的】从抗逆植物盐芥中分离GRP7(glycine-rich RNA-binding protein7,GRP7)基因,为进一步揭示GRPs基因在盐芥逆境应答中的作用机制及生物学功能奠定基础。【方法】利用盐芥GRP7基因的EST序列设计特异引物,克隆GRP7基因的全长序列,对其保守结构域和系统进化树进行分析,并对TsGRP7基因的启动子区进行预测;利用qRT-PCR技术,检测GRP7基因在不同逆境胁迫、不同组织中的表达情况。【结果】TsGRP7基因编码区全长522bp,编码173个氨基酸;TsGRP7蛋白的N端第9~82位氨基酸之间有1个RNA识别基序(RRM),RRM中含有保守的RNP-1和RNP-2亚结构域;多重序列比对和系统进化树分析表明,盐芥和拟南芥亲缘关系较近;启动子序列分析表明,盐芥GRP7启动子区含有HSE热激响应元件、LTR低温应答元件等多个逆境相关的顺式作用元件,表明盐芥GRP7基因参与逆境响应。qRT-PCR分析表明,盐芥GRP7基因在不同逆境胁迫条件及不同组织中表达不同。【结论】盐芥GRP7基因参与低温、高盐、PEG等逆境响应。     

甘蓝型油菜乙酰辅酶A羧化酶3个亚基基因的克隆及其表达

[目的]为构建乙酰辅酶A羧化酶的叶绿体表达载体奠定基础。[方法]以从甘蓝型油菜叶片中提取的叶绿体基因组DNA为模板进行PCR扩增,克隆羧基转移酶β亚基基因。以从开花20~29 d后油菜幼胚中提取的总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆生物素羧化酶和生物素羧基载体蛋白的cDNA序列。最后,乙酰辅酶A羧化酶的3个亚基基因被克隆到大肠杆菌表达载体中。[结果]SDS-PAGE分析结果表明乙酰辅酶A羧化酶的3个亚基基因分别被克隆到大肠杆菌表达载体中。乙酰辅酶A羧化酶的3个亚基基因在大肠杆菌中的表达产物分别为76.6、44.0和81.5 kD,其融合蛋白分别占总菌体蛋白的12%、10%和6%。[结论]不同品种的甘蓝型油菜生物素羧基载体蛋白cDNA序列存在较大差异。     

乙酰辅酶A羧化酶的结构·功能及基因的研究进展

乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase,ACCase）属于生物素包含酶类型Ⅰ,在生物体内催化乙酰辅酶A形成丙二酰辅酶A。在植物中乙酰辅酶A羧化酶主要有异质型和同质型2种;在动物中乙酰辅酶A羧化酶属同质型,分为ACC1和ACC2 2种类型。主要介绍了分布于双子叶植物以及非禾本科单子叶植物的质体中的异质型ACCase的亚基组成、结构、功能及其编码基因。ACCase由生物素羧化酶（Biotincarboxylase,BC）亚基、生物素羧基载体蛋白亚基（Biotincarboxyl Camer Protein,BCCP）、羧基转移酶的α-CT亚基和β-CT亚基4种亚基构成,有3个功能结构域,即BC功能结构域、BCCP功能结构域以及CT功能结构域。除β-CT亚基由质体基因编码外,其他亚基由核基因编码,在细胞质中合成后转运到质体中组成功能蛋白,参与脂肪酸的合成。     

油菜脂肪酸延长酶基因fae1片段的克隆与SNP分析

 脂肪酸延长酶基因fae1是调控油菜芥酸合成的关键基因。本研究利用GenBank中的fae1基因序列AF490462为模板设计引物，通过多聚酶链式反应（PCR）从白菜、甘蓝和甘蓝型油菜（包括2个人工合成种）的12个不同品种中扩增出长1 007bp的fae1基因片段。PCR产物经与克隆载体pGEM-T vector连接和序列测定，获得12个品种的fae1基因片段的DNA 序列。对来自12个不同品种的fae1基因序列进行比较分析表明：fae1基因具有高度序列保守性，扩增长度均为1 007 bp，核苷酸序列相似度达98%以上，氨基酸序列的保守性更高。在1007 bp的区间内共发现23个SNP(single nucleotide polymorphism)位点，其中有11个单核苷酸变异导致了编码氨基酸的改变。人工甘蓝型油菜和天然甘蓝型油菜的fae1基因片段未发现明显差异。发现了高芥酸品种与低芥酸品种的fae1基因、以及A基因组与C基因组的fae1基因特有SNP位点。     

Cloning and Molecular Identification of A Fatty Acid Desaturase 2 Gene in a and C Genome of Brassica Species

The fatty acid desaturase 2 (fad2) gene was proven to be a major locus for high oleic acid (C18:1). Brassica napus is an amphidiploid species originating from a spontaneous hybridization of Brassica rapa and Brassica oleracea. B. napus contains multiple copies in genome for most of the genes, including fad2 genes. The research cloned nine fad2 genes from 3 varieties of B. rapa and 3 varieties of B. oleracea, respectively. Alignment of the nine fad2 sequences from B. rapa and B. oleracea detect-ed 6 single nucleotide polymorphic sites, which resulted in 6 amino-acid substitutions. The nucleotide substitutions at position 743 bp in the fad2-A gene and position 947 bp in the fad2-C gene were used as 3’ end of al ele-specific primers. In use of the al-lele-specific primers to amplify fad2 gene, we could identify if the fad2 gene originated from A genome or C genome. Besides, the research found that fad2 genes in C genome are more conserved in evolutionary process than those in A genome. The fad2 expression data reported in this study revealed that fad2-A from B. rapa was not only expressed in siliques same as fad2-C from B. oleracea, but also expressed in a high level in stems. Not even the less, fad2 gene from B. napus was expressed higher in roots and flowers. Al these results provided evidences that fad2, though it was expressed differently in B. rapa and B. oleracea, but it was regulated by the same approach in B. napus.     

二斑叶螨乙酰辅酶A羧化酶基因全长cDNA克隆及其生物信息学分析

【目的】克隆二斑叶螨（Tetranychus urticae）的乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase,ACCase）基因,对其进行生物信息学分析并研究其在二斑叶螨敏感和抗性品系中的表达量。【方法】利用RT-PCR技术克隆ACCase基因的cDNA 全长,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性;利用实时荧光定量 PCR 方法分析ACCase基因在二斑叶螨敏感和抗螺螨酯品系中的表达差异。【结果】ACCase基因（GenBank 登录号：JX424763）的开放阅读框长度为7 068 bp, 编码2 235个氨基酸,分子量约为266.35 kD,理论等电点为6.38,包含典型的生物素羧化酶（biotin carboxylase,BC）、生物素羧基载体蛋白（biotin carboxyl carrier protein,BCCP）和羧基转移酶（carboxyltransferase,CT）3个结构域。结合其它物种ACCase基因构建系统发育树表明,该基因与体虱（Pediculus humanus corporis）ACCase基因具有较高的同源性。实时荧光定量 PCR 结果表明,ACCase基因在抗螺螨酯品系中的相对表达量较高,与明感品系间存在显著差异。【结论】利用RT-PCR技术在二斑叶螨中克隆到ACCase基因,ACCase基因的过量表达可能与二斑叶螨对螺螨酯的抗性形成有关,为二斑叶螨的抗性治理提供了依据。     

RACE方法在甘蓝型油菜基因克隆中的应用

将Invirtogen公司开发的一种RACE技术应用于甘蓝型油菜基因家族成员的克隆,克隆了查尔酮异构酶基因家族的全部6个成员和类黄酮3′-羟化酶基因家族的2个成员。应用结果表明:该方法具有低成本、高效率、能克隆全长基因的特点,适合甘蓝型油菜等多倍体物种基因家族成员的克隆。     

甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体构建

[目的]为研究质体定位的乙酰辅酶A羧化酶转化叶绿体奠定基础。[方法]根据GeneBank上的甘蓝型油菜的叶绿体DNA序列设计1对引物,通过PCR扩增获得与甘蓝型油菜叶绿体基因组可发生同源重组的DNA片段,构建甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体,并在大肠杆菌中通过平板定性分析和Western印迹对所构建载体上的表达盒进行功能鉴定。[结果]以甘蓝型油菜的叶片叶绿体基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得4 357 bp的DNA片段,包含2个开放阅读框RbcL和β-CT。成功构建了甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体pHBM720,而且同一多顺反子的3个基因均在大肠杆菌中得到表达。[结论]该叶绿体多顺反子单交换表达载体具有较强的通用性与安全性,比双交换表达载体更具优越性。     

甘蓝SRK底物蛋白基因的克隆与序列分析

采用PCR、3’RACE以及其他分子生物学方法,以甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对SSP基因进行扩增克隆,得到长度分别为778 bp和825 bp的基因片段。序列分析表明,甘蓝SSP基因不包含内含子,SSP核苷酸序列与拟南芥肽酶M28家族蛋白有同源性,序列相似性达到67.4%,两者的氨基酸序列相似性达到62.7%,而且都含有一个TFR_dimer结构域,推测SSP蛋白极有可能与在自交不亲和过程中受ARC1作用而泛素化了的某一未知蛋白的降解相关。     

油菜PEP基因的克隆及PEP反义基因的构建

丙酮酸羧化酶（ Ｐ Ｅ Ｐ）是控制油菜蛋白质／油脂含量比例的一个关键酶⒚本研究用 Ｐ Ｃ Ｒ 法扩增出了 Ｐ Ｅ Ｐ 基因片段,并将其 克隆到 ｐ Ｂ Ｓ Ｓ Ｋ＋ 的 Ｓｍ ａ Ⅰ位点⒚ Ｄ Ｎ Ａ 序列分析表 明克隆片段 的长度为 ５３０ｂｐ,其序列与报道序列相同⒚将该 Ｐ Ｅ Ｐ基因 片段反向插入 ｐ Ｉ Ｇ１２１ 质粒,构建了带 Ｐ Ｅ Ｐ 反义基因的超级双元载体并进行油菜的转化,目前已获得转基因植株⒚     

甘蓝型油菜oleosin基因片段的克隆及序列分析

以油菜(Brassica napus)基因组DNA为模板,通过设计一对特异性引物,利用多聚酶链式反应(PCR)扩增获得oleosin基因片段。将其克隆到E.coli质粒上进行序列分析。结果表明,该基因由878个碱基组成,含一个内含子,编码193个氨基酸。不计附加的18bp凝血酶切割序列,与已报道的序列相比较,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为79.20%和91.21%。推测的氨基酸序列构成的蛋白质具有oleosin的基本结构特点,包含3个结构区域:两性N末端区(anamphipathicN-terminalre鄄gion),中心疏水区(acentralhydrophobicdomain),两性C-末端区(anamphipathicC-terminaldomain)。