猪细小病毒1型河南流行毒株的遗传进化分析

【目的】监测河南省猪细小病毒1型(porcine parvovirus 1,PPV1)的变异情况。【方法】采集自河南省鹤壁市和安阳市初产母猪的流产胎儿阳性样品，利用PCR方法鉴定获得2株PPV1流行毒株，经过全基因组测序，分别命名为CH/HN-H/2021和CH/HN-3/2021。通过分析同源性和构建遗传进化树分析PPV1全基因组、NS1基因、VP2基因的变异情况，并且比对分析NS1蛋白和VP2蛋白的氨基酸变异情况及非编码区基因缺失情况。【结果】2条序列的核苷酸相似性为99.9%;与46株国内外PPV1流行毒株全基因组的核苷酸同源性为93.5%～99.9%;NS1基因核苷酸同源性为98.6%～99.9%,NS1蛋白氨基酸同源性为98.2%～99.9%;VP2基因核苷酸同源性为98.4%～99.9%,VP2蛋白氨基酸同源性为98.3%～99.9%,说明本研究鉴定的毒株呈现遗传进化稳定性。本研究鉴定株与湖南及吉林毒株亲缘关系最近，而与河南原有毒株亲缘关系较远。在对NS1蛋白与VP2蛋白的氨基酸变异分析中发现，NS1蛋白发生6处突变，VP2蛋白发生7处突变，均在经典突变位点范围内，符合PP...     

猪圆环病毒3型河北株全基因组序列特征和遗传进化分析

【目的】扩增猪圆环病毒3型(PCV3)全基因组序列,对其进行序列特征及遗传进化分析.【方法】以PCV3阳性样品为模板,利用两对引物扩增全基因组片段并测序,通过DNA Star和MEGA-X软件进行遗传进化分析.【结果】发现1株新PCV3毒株(GenBank登录号:MK105924),PCV3 Cap蛋白为3b亚型,与河北省9株PCV3 Cap蛋白的同源性在97.8%～99.8%;所获得的PCV3与PCV1和PCV2全基因组序列的同源性均小于50%,遗传进化树分析3种PCV处于不同的分支,表明其属于不同的基因型;与国内外其他43株PCV3全基因组序列的同源性在98.7%～99.3%,其中与俄罗斯PCV3毒株(GenBank登录号:MG679916)的同源性最高,为99.3%,表明不同PCV3毒株之间的全基因组序列的同源性很高,尚未发现明显的变异;与GenBank上已发表的全部国内外174株PCV3的全基因组序列进行遗传进化树分析,发现全球PCV3及其亚型的分布有地域的差异.【结论】获得1株新PCV3毒株,其与PCV1、PCV2属于不同的基因型;不同PCV3毒株之间存在着较高的同源性;全球PCV3及其亚型的分布与地域有一定的关系.     

京津冀地区猪圆环病毒3型的全基因组克隆与分析

【目的】监测近期在京津冀地区流行的猪圆环病毒3型毒株及其基因变异情况。【方法】以近期京津冀地区猪圆环病毒3型阳性临床样品为模板，用PCR技术扩增猪圆环病毒3型全基因组片段，随后进行基因克隆、序列测定和序列分析。【结果】PCR扩增、序列测定和BLAST比对结果显示获得4株大小都为2 000个核苷酸的猪圆环病毒3型全基因组序列。基于全基因组核苷酸分析结果显示，这4株猪圆环病毒3型与选取的国内外15株猪圆环病毒3型的同源性均达98.4%以上，系统发育树显示上述PCV3毒株所处的分支虽有所不同但却都非常近，表明不同猪圆环病毒3型毒株之间的全基因组核苷酸有非常高的同源性和保守性。基于开放阅读框2基因核苷酸的系统发育树显示上述猪圆环病毒3型毒株被分成3个分支，所得4株猪圆环病毒3型分别归属于基因型a与c,并呈现出一定的地域差异。【结论】获得了京津冀地区4株猪圆环病毒3型全基因组序列，虽然它们具有很高的全基因组核苷酸同源性与保守性，但却分属于2种基因型，并呈现出一定的地域差异。     

吉林地区高致病性PRRSV JL-04/12株的 分离鉴定与全基因组测序

【目的】确定吉林省某疑似高致病性PRRS猪场的病原,研究其基因特性。【方法】采集疑似感染高致病性PRRSV病猪的脏器组织,处理后接种MARC-145细胞,观察细胞病变,分离PRRSV;应用RT-PCR方法检测和确定分离毒株的基因型,采用间接免疫荧光、电镜观察和全基因组测序检测分离的病毒。【结果】分离毒株为北美洲型PRRSV,命名为JL-04/12,其基因组全长为15 320bp(不包括PolyA),可使MARC-145细胞产生典型的细胞病变。序列比对结果表明:JL-04/12株与经典毒株VR-2332和CH-1a的核苷酸同源性分别为89.5%和94.9%;与高致病性毒株JXA1、HUN4的核苷酸同源性为99.1%。分离毒株JL-04/12编码的2个非结构蛋白和GP2～GP4的氨基酸序列与HUN4株同源性较高,在97.2%～99.3%,而JL-04/12编码的GP5的氨基酸序列与JXA1株同源性较高,为98.5%;JL-04/12编码的GP6和N蛋白的氨基酸序列与高致病性PRRSV毒株JXA1和HUN4的同源性均为100%。PRRSV JL-04/12株的Nsp2不连续缺失30个氨基酸,与高致病性PRRSV毒株JXA1和HUN4的同源性最高,均为97.8%,判定该分离株为变异的高致病性PRRSV。【结论】从吉林省分离到1株高致病性PRRSV,说明高致病性PRRS变异病毒在吉林省仍然存在。     

我国华东某省HP-PRRSV的分离鉴定及全基因组序列分析

【目的】从我国华东地区某省3个不同市县的疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场送检的病料中分离PRRSV毒株,并对其全基因组进行测序,进而对当前PRRSV流行毒株的分子特征和近几年我国PRRSV毒株的演化特点进行分析。【方法】采集养殖场病死猪的淋巴结和肺脏病料,处理后进行PRRSV的RT-PCR检测。对PRRSV检测呈阳性的病料进行病原分离和免疫荧光试验(IFA)鉴定,测定IFA鉴定呈阳性的PRRSV分离株的TCID50。参照NCBI基因数据库已提交的PRRSVVR-2332、CH-1a、HB-2及JXA1等毒株序列设计6对引物,对所得分离毒株分别进行全基因组序列扩增、测序,并将测序结果与LV、VR-2332、JXA1等国内外16个PRRSV毒株进行序列同源性和进化分析。【结果】试验共分离鉴定获得3株PRRSV毒株,分别命名为SDCXA/2008、SDWF、SDLY。全基因组Blast比对结果表明,这3个分离株均为北美洲型毒株。序列分析发现,3个分离株的全基因组序列与欧洲株的同源性极低(61.6%～61.8%),与2006年前分离的美洲型毒株的同源性较低(86.6%～97.1%),与2006后分离的美洲型毒株同源性较高(98.3%～99.7%)。Nsp2基因在3个易变区中变异最大,ORF5次之,ORF3相对最小;推导氨基酸序列中变异最大的亦为Nsp2。3株PRRSV毒株Nsp2基因推导氨基酸的第481和532～560位处共存在30个氨基酸缺失,与以HUN4、JXA1等为代表的国内高致病性分离株序列的同源性较高,结合进化分析将其均划为与JXA1类似的高致病性猪蓝耳病毒株(HP-PRRSV)。【结论】分离到3株HP-PRRSV毒株,其遗传特征相对稳定,但同时也发生了一定的变异,说明PRRSV还在不断地变异和演化。PRRSV的分布无明显地域性。     

口蹄疫病毒基因组3'末端序列扩增及分析

【目的】扩增口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)O/Akesu/58 CE39A株基因组3'末端序列,并对其核苷酸序列进行分析,为FMDV反向遗传学研究奠定基础。【方法】采用普通PCR法和3'RACE法扩增FMDV基因组3'末端序列,利用分子生物学软件对该序列进行分析。【结果】扩增了口蹄疫病毒基因组3'末端序列,3'UTR长98 nt,Poly(A)长度不同(19、23、24、25、27、29、43)。3'UTR序列二级结构含有2个茎环结构,分别位于8 101～8 140和8 146～8 190 nt。O/Akesu/58 CE39A株3'UTR序列与参考毒株O/MAY/3/2014(GenBank登录号:KY322672)和O/IND26(54)/2014(GenBank登录号:KJ825807)的核苷酸序列同源性最高,均为89.8%。【结论】普通PCR法和3'RACE法均可扩增出3'末端序列。同一毒株的亚克隆,其Poly(A)长度与基因扩增时所用方法有关。不同毒株的Poly(A)长度不同,可能是毒株本身属性,也有可能是由扩增方法不同造成。Poly(A)要么扩增成功后其长度不同,要么扩增失败。失败的原因可能是3'末端结构复杂,难于扩增。     

陕西省猪流行性腹泻病毒S基因克隆与生物学信息分析

【目的】分析2014-2021年陕西省猪群猪流行性腹泻病毒（PEDV）主要毒力基因的生物学信息特征，揭示陕西省PEDV流行毒株基因变异情况，为防控猪流行性腹泻提供理论参考。【方法】参考PEDV全基因序列设计4对引物，采用RT-PCR方法分段扩增10株陕西省PEDV流行毒株S基因。利用生物信息分析软件，将获得的PEDV流行毒株S基因与GenBank中公开的57株PEDV序列进行比对分析。【结果】获得了10株陕西省PEDV流行毒株S基因全序列，长度为4 149～4 167 bp。将序列上传GenBank，获得相应的登录号为OL855978～OL855987。系统进化树分析显示，67个PEDV毒株分为G1a、G1b、G2a和G2b 4个亚群，10株PEDV流行毒株均属于G2b亚群，且遗传距离较近，与我国多个省区近年流行毒株亲缘关系较近。同源性分析结果表明，10株流行毒株之间S基因核苷酸序列同源性为95.4%～98.3%，氨基酸同源性为91.0%～98.1%；10株流行毒株与疫苗毒株S基因核苷酸序列同源性为91.7%～98.5%，氨基酸同源性为87.8%～98.5%。与G1a亚群的SD-M、CV777疫苗毒株核苷酸、氨基酸相比同源性均较低，而与G2b亚群的AJ1102、LNCT2、LW/L、XJ-DB2疫苗毒株核苷酸、氨基酸相比同源性均较高。与CV777 S蛋白相比较，共有88个氨基酸位点出现变异，变异位点占总位点数的6.36%（88/1 383），其中在59～62位氨基酸有7株毒株出现了QGVN插入，在140位氨基酸有8株毒株出现N插入，在160～161位氨基酸有7株毒株出现DG缺失。S蛋白主要的中和表位、抗原表位和单抗识别表位出现多个变异位点。二级结构预测发现，与CV777相比较，多数流行毒株S蛋白的α螺旋、无规则卷曲占比稍有增加，β转角、延伸占比有所下降。S蛋白糖基化位点预测结果表明，与CV777株相比，流行毒株有多个引入或缺失的糖基化位点。【结论】陕西省PEDV流行毒株S蛋白抗原性发生了较大变化，推测疫苗免疫保护效果下降与此密切相关。     

1型鸭肝炎病毒R株全基因组分析与检测技术的研究

 【目的】测定1型鸭肝炎病毒（DHV1）毒株R全基因组，建立鸭肝炎病毒1型巢式PCR与实时荧光定量RT-PCR。【方法】设计特异性引物测定DHV1毒株R全基因组，以3D为靶基因序列的引物P1和P2，P3 和P4进行巢式PCR，引物F和R进行实时荧光定量RT-PCR。【结果】序列分析发现该毒株与其它GenBank上发表的DHV1毒株基因组核苷酸序列同源性为94.2%～99.2%，编码聚合蛋白氨基酸序列同源性为98%～98.8%，表明DHV1-R株与其它DHV1毒株之间病毒基因组一级结构有较高的同源性。基因组结构5′UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C- 3A-3B-3C-3D-3′UTR在遗传进化关系上与副肠孤病毒属（Parechovirus）亲缘关系较近。参照鸭肝炎病毒1型基因序列设计特异性引物,分别进行巢式PCR和SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR 方法检测鸭肝炎病毒1型, 结果表明巢式PCR敏感性为6 pg•ml-1。实时荧光定量RT-PCR确定特异性产物的Tm值,同时做普通RT-PCR。试验结果表明,特异性产物的Tm值为85.6℃,最低能检测到含0.015 fg•μl-1 阳性质粒标准品。【结论】建立的巢式PCR与SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR 检测方法显示了较好的特异性、敏感性，为鸭肝炎病毒1型的临床检测和流行情况调查提供了新的技术手段。     

猪圆环病毒2型陕西杨凌株的分离鉴定及全基因组分析

【目的】 分离得到猪圆环病毒2型（PCV-2）陕西杨凌株，测定病毒滴度(TCID₅₀),并进行全基因组序列比对，为研制针对性更强的PCV-2疫苗提供理论依据。【方法】 从经PCR检测为猪圆环病毒2型阳性的病料中，分离病毒并接种PK-15细胞，通过PCR检测、间接免疫荧光试验及电镜观察，对分离病毒进行鉴定；用免疫过氧化物酶细胞单层试验（IPMA），测定分离毒株的TCID₅₀，并对其全基因组序列进行测定与分析。【结果】 分离得到1株猪圆环病毒2型毒株，分离株在PK15细胞上的TCID₅₀为10^-4.75。全基因组序列同源性比对发现，分离株与一加拿大分离株（DQ200735）同源性最高（99.4%）。【结论】 从陕西杨凌分离得到了1个猪圆环病毒2型分离株。     

福建省猪瘟病毒流行毒株EO基因的克隆与序列分析

【目的】对我国福建省流行的猪瘟病毒E0基因进行序列测定及分析。【方法】应用RT-PCR，从我国福建省送检的54份病料中扩增出14份猪瘟病毒E0基因，将其克隆到T载体上并测序。利用DNAstar分析软件，对所测定的14株流行毒株与参考毒株的相应基因片段进行同源性及序列分析。【结果】得到约801bp的猪瘟病毒E0基因片段。序列分析表明，14株福建流行毒株可分为2个基因群，其中FJ216与ALD、Alfortl87、Brescia、CHVRI、GPE、Glentorf、CAP、Shimen和HCI。V等我国主要参考毒株属于基因1群，其他13株流行毒株和我国另一分离株GXWZ02属于基因2群。基因1群的FJ216与HCLV的核苷酸和氨基酸同源性分别为95．0％和94．3％，与Shimen的核苷酸和氨基酸同源性分别为99．4％和99．1％；而另外13株流行毒株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为89．7％～99．9％和93．84％～99．6％，13株流行毒株与HCLV株的核苷酸和氨基酸同源性分别为81．8％～88．1％和86．8％～89．5％，与Shimen株的核苷酸和氨基酸同源性分别为83．4％～90．8％和88．6％～93．9％。得到的14株猪瘟病毒E0基因具有RNase活性的2个区域均高度保守，没有发生变异。【结论】福建省近期流行的猪瘟病毒以基因2群为优势毒株，而且大多数与HCLV、Shimen毒株之间存在较大差异。