变异猪流行性腹泻病毒M和N双基因融合真核表达及其活性鉴定

[目的]体外表达变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M-N双基因融合蛋白并明确其生物活性,为开展PEDV新型疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白.[方法]将变异PEDV的M基因克隆至pEASY-Blunt M2(pM2)真核表达载体构建pM2-M真核质粒,通过同源重组将N基因克隆至M2-M基因片段构建pM2-M-N双基因融合重组质粒,然后转染293T细胞表达出M-N双基因融合蛋白.通过Western blotting、ELISA及免疫BLAB/c小鼠试验鉴定表达融合蛋白的生物学活性.[结果]扩增获得的M基因、N基因片段大小分别为678和1359 bp,且与原序列的相似性均达100.0%.将M基因和N基因并连接至pM2真核表达载体成功构建获得pM2-M-N双基因融合重组质粒,M-N双基因片段大小为2004 bp,且与原序列的相似性为99.3%.以pM2-M-N双基因融合重组质粒转染239T细胞,表达出大小约75 kD且具有免疫活性的M-N双基因融合蛋白,纯化的M-N双基因融合蛋白能与PEDV阳性血清反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒均无交叉反应;以其免疫BLAB/c小鼠能诱导产生特异性抗体.[结论]通过pM2真核表达载体能构建获得变异PEDV毒株的pM2-M-N融合双基因重组质粒,转染293T细胞后可表达出具有良好免疫活性的M-N双基因融合蛋白,为后期开展变异PEDV基因工程疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白.     

猪瘟病毒E2基因的克隆及原核表达

利用RT-PCR技术扩增出不含信号肽的猪瘟病毒石门株的E2基因,将其克隆到PGEX-T-Easy 载体上,用BamH Ⅰ和HindⅢ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因克隆到表达载体质粒pPROEX-HTb中,获得 重组质粒PPRO,EXE2,用pPROEXE2转化大肠杆菌,诱导含重组质粒PPROEXE2的大肠杆菌BL21表达E2基因蛋 白,研究E2蛋白与猪瘟阳性血清反应的特异性。结果表明,受体菌诱导后能表达E2基因蛋白,所表达的E2蛋白能 与猪瘟阳性血清发生特异性很强的反应。     

猪瘟流行毒株E2基因主要抗原区的原核高效表达

【目的】构建猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)E2基因主要抗原区原核表达质粒载体,高效表达E2蛋白,为进一步研究E2亚单位疫苗提供物质基础。【方法】用RT-nested PCR技术扩增CSFV流行毒株SX-YL株E2基因主要抗原区,克隆于表达载体pET32a中,成功构建表达质粒pET32a-E2,将pET32a-E2转入BL21(DE3)受体菌并用IPTG诱导表达E2蛋白,对E2蛋白进行SDS-PAGE电泳、Western-blot分析和可溶性鉴定。【结果】CSFVE2基因得到了高效表达,表达蛋白量占菌体蛋白量的33.2%,表达蛋白E2主要以包涵体形式存在;免疫印迹分析结果表明,表达蛋白E2能识别天然猪瘟多克隆抗体。【结论】E2蛋白表达量高并具有生物学活性。     

猪瘟病毒E2基因乳腺特异表达载体的构建

为进一步研究基因疫苗的免疫机制与免疫效果,探讨外源基因在乳腺中的定位表达,应用重组PCR方法,将猪瘟病毒(CSFV)E2基因与牛β-乳球蛋白(BLG)5′部分调控序列连接起来,并插入到真核表达载体pEGFP-C1上,构建了含有CSFVE2基因的乳腺特异表达载体。     

猪瘟单克隆抗体制备实验

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种急性或慢性、热性和高度接触性传染病。研究应用猪瘟病毒E2基因构建真核表达质粒,制备成DNA疫苗,以Lipofectamine TM 2000 Reagent介导免疫Balb/c小鼠,免疫5次后,用SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾细胞融合,用重组的E2为检测抗原,间接ELISA筛选,有限稀释法克隆,筛选出17株抗猪瘟病毒E2的杂交瘤细胞株,为CSFV的检测和猪瘟病毒试剂研究提供物质基础。     

表达猪瘟病毒石门株E0和/或E2基因重组非复制型腺病毒疫苗的免疫保护试验

用已构建好的表达猪瘟病毒石门株E0基因的重组腺病毒pAd-E0、表达猪瘟病毒石门株E2基因的重组腺病毒pAd-E2以及联合表达猪瘟病毒石门株E0-E2基因的重组腺病毒pAd-E0-E2,肌肉和皮下接种免疫商品猪2次(间隔20 d),同时设非重组腺病毒PAD-CMV、常规猪瘟疫苗和空白对照组。二免21 d后进行CSFV石门株强毒超致死量(1 000倍TCID50)攻击,研究表达猪瘟保护性抗原基因重组腺病毒疫苗的免疫效果。结果表明,pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2免疫组猪的死亡率分别为50%,25%和25%,而常规猪瘟兔化弱毒疫苗免疫组的死亡率为40%,pAd-CMV免疫组和空白对照组猪全部死亡;在攻毒前,重组腺病毒免疫组抗体水平普遍较低,商品化疫苗免疫组能100%检测到抗体,而非重组腺病毒和空白对照没有检测到抗体;攻毒后pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2试验组中分别有75%,50%和50%猪体温超过40℃,常规苗试验组80%体温超过40℃,而PAD-CMV组和空白对照组所有试验猪体温均超过40℃,表明重组腺病毒疫苗具有一定的保护效果。表明,仅含有E0基因的重组腺病毒pAd-E0的免疫保护效果和常规疫苗还有距离;含有E2基因和E0-E2基因的重组腺病毒的免疫保护效果不亚于常规疫苗。     

猪瘟病毒E2基因真核表达载体表达效率和免疫效果的比较

比较猪瘟病毒E2基因的真核表达质粒proVAX-E2n和pVP22-E2n体外表达效率以及体内的免疫效果,以从中选出高效的猪瘟病毒核酸疫苗.将上述表达载体转染Hela细胞进行体外表达后,用RT-PCR和间接ELISA法检测Hela细胞体内和体外表达产物;免疫6～8周龄昆明白小鼠, 用间接ELISA法和MTS法检测小鼠血清中CSFV特异性IgG抗体水平以及脾脏中淋巴细胞增殖功能.结果表明2种E2重组质粒均能在Hela细胞中正确表达,且proVAX-E2n的E2蛋白表达量（OD值为0.575 4）明显高于pVP22-E2n（OD值为0.306 05）（P〈0.05）;proVAX-E2n刺激机体产生的抗体水平（最高抗体滴度为1：2 200）显著高于pVP22-E2n免疫组（最高抗体滴度1：1 600）;淋巴细胞增殖结果显示proVAX-E2n（刺激指数4.073）与pVP22-E2n（刺激指数2.205）相比,能诱发小鼠产生更强的CSFV的特异性淋巴细胞增殖反应.本研究表明proVAX真核表达载体对E2基因体外表达效率和小鼠免疫效果均高于pVP22真核表达载体.     

猪瘟病毒DNA疫苗的构建及动物免疫试验

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)C株E2囊膜蛋白全长基因克隆到真核表达载体pcDNA4.0的CMV启动子下游,采用磷酸钙转染法将重组质粒转入293T细胞,流式细胞仪(FACS)检测293T细胞瞬时表达了E2囊膜蛋白。将构建的重组质粒肌肉注射BALB/c小鼠,用流式细胞仪和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测证明成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体,为下一步利用DNA疫苗免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

GM-CSF与猪瘟病毒E2基因共表达载体的构建及其诱导的免疫应答

为探讨粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对猪瘟病毒E2基因核酸疫苗小鼠免疫应答诱导的影响,将CSFVE2基因和GM-CSF片段插入真核表达载体pcDNA3.0内构建pcE2,pcE2-GF及pcGF核酸疫苗.动物试验时,50只雌性供试小鼠随机分为5组,即pcE2,pcE2-GF,pcDNA3.0,pcGF,生理盐水组,每组10只.0,2,4周于小鼠左后肢胫前肌进行肌注免疫,质粒量为每只每次50μg.每次免疫前和末次免疫后2周尾静脉采血收集血清,ELISA检测血清内特异性IgG水平.末次免疫后1周每组随机选3只无菌取脾,MTT法检测淋巴细胞增殖情况.结果表明,与对照组比较,pcE2和pcE2-GF第3次免疫2周后,免疫小鼠IgG抗体水平逐渐增高,淋巴细胞的转化率也明显增高,且pcE2-GF免疫组的IgG抗体水平和淋巴细胞的转化率高于pcE2免疫组.可见,细胞因子GM-CSF可有效提高猪瘟病毒E2基因核酸疫苗的免疫应答.     

猪瘟病毒E2基因的克隆表达

PCR扩增猪瘟病毒(CSFV)定点突变后的E2基因,克隆至原核表达载体质粒pET-28a中,重组质粒pET28a-E2转化BL21(DE3),IPTG诱导,高效表达了E2基因,表达量达菌体总蛋白的25.3%。免疫印迹表明,所表达的蛋白是CSFV特异性的。     

猪瘟病毒E~(rns)和E2基因在昆虫细胞中的表达研究

利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)Erns和E2基因,用于CSFV新型疫苗以及建立相关的血清学诊断方法等研究.从猪瘟病毒石门株血液样品中提取总RNA,对Erns及E2基因进行扩增,将产物回收后分别连接于T载体,酶切及测序分析后,将其亚克隆至真核表达转移载体pFastBac HT经重组筛选后获得杆状病毒重组质粒,重组质粒转染昆虫细胞sf9后连续传3~4代,分别收获细胞上清液及沉淀,用于SDS-PAGE及Western-blotting试验,检测重组Erns,E2基因表达蛋白.用抗组氨酸(His)单克隆抗体在表达细胞中检测到Erns重组的His标签蛋白;应用抗E2蛋白单克隆抗体在表达细胞及培养上清液中检测到E2基因表达蛋白.结果表明在杆状病毒系统中成功表达了CSFV Erns和E2蛋白.     

猪瘟病毒p80基因丝氨酸蛋白酶功能区的原核表达及小鼠免疫试验

根据已发表的猪瘟病毒Alfort株的全基因组序列,设计2对引物以Shimen细胞毒株为材料,一步法提取总RNA,利用RT-PCR和套式PCR,成功扩增出p80全长基因,包括丝氨酸蛋白酶以及NTPase/RNA解旋酶功能区,大小约为2.0kb。将p80基因中的丝氨酸蛋白酶基因克隆到原核表达载体pET-32a中,获得重组质粒pET-p80。将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）中,IPTG诱导表达得到分子量约为43ku的目的蛋白,与理论大小相符。将菌体蛋白经Ni柱纯化,获得纯化重组p80蛋白,Western blot检测表明,表达的目的蛋白能与CSFV阳性血清发生反应。用纯化的p80蛋白免疫Bal b/c小鼠,成功制备了抗p80蛋白的抗血清。     

鸡白细胞介素-2 cDNA克隆

用哺乳动物细胞表达克隆系统克隆了鸡ＩＬ－２ｃＤＮＡ。以ＣｏｎＡ（２０μｇ／ｍＬ）诱导ＳＰＦ鸡脾脏淋巴细胞,第２０小时收集细胞,提取ｍＲＮＡ,以ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍｆｏｒｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ试剂盒合成ｃＤＮＡ,定向连结于穿梭质粒ｐＳＶ·ＳｐｏｒｔⅠ,构建ｃＤＮＡ文库。将文库分组提取重组质粒,转染ＣＯＳ－７细胞,表达ｃＤＮＡｓ。以淋巴细胞增殖试验检测表达产物ＩＬ－２活性。经过３轮筛选,获得１４个具有ＩＬ－２活性的克隆。选择其中４个进行酶切分析,结果显示这４个ｃＤＮＡ大小分别为１．５,１．０,０．８和０．８ｋｂ。     

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及动物免疫试验

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒表达载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFVE2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,用流式细胞仪检测证明,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。为下一步利用细胞免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

人IL-1Ra基因的克隆及原核表达的研究

IL-1Ra是第一个被发现的天然存在的细胞因子拮抗剂,结合于IL-1受体后不引起IL-1效应。文章通过RT-PCR从人的胎盘组织中克隆了人IL-1Ra基因,使其在大肠杆菌DH5α中重组表达。结果表明,克隆到了460bp左右的目的基因,并在大肠杆菌中成功表达了18ku左右的目的蛋白,目的蛋白在大肠杆菌中表达量占总蛋白20%左右,为IL-1Ra的进一步研究及应用奠定了基础。     

靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体的构建与鉴定

利用RNA干扰在线生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列(其结构特征为正链(19nt)-环(9nt)-负链(19nt))。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体中,构建重组载体pGene-NS3-1,pGene-NS3-2和pGene-NS3-3,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对转化产物进行kan+筛选,碱裂解法提取重组质粒,将酶切鉴定为阳性的质粒测序。结果显示,双链干扰片段克隆方向正确,序列中未出现核苷酸的插入,缺失等突变现象。表明靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体构建成功。     

E2蛋白介导猪瘟病毒的细胞吸附与内化

【目的】已有研究显示,猪瘟病毒(CSFV)通过网格蛋白介导的内吞作用侵入宿主细胞,然而参与侵入过程的病毒蛋白尚待阐明。研究旨在明确E2蛋白在CSFV侵入过程中的作用。【方法】通过瞬时转染包装携带E2基因的慢病毒,将慢病毒转导悬浮293细胞构建稳定表达重组E2蛋白的悬浮293细胞系,利用亲和层析的方法纯化重组E2蛋白,同时优化表达时间以增加蛋白产量。利用SDS-PAGE和Western blotting分别鉴定了重组E2蛋白的表达水平及其反应原性。通过感染试验、吸附试验以及内化试验分别探究了E2蛋白对CSFV感染、吸附以及内化的影响。将重组E2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过阻断ELISA检测血清中多克隆抗体的阻断率。利用制备的多克隆抗体与CSFV感作后进行吸附和内化试验,进一步探究了E2蛋白在介导CSFV吸附和内化中的作用。【结果】通过倒置荧光显微镜观察转导慢病毒后的细胞系,与对照细胞相比可见明显的绿色荧光,表明慢病毒成功转导悬浮293细胞。SDS-PAGE结果显示,在还原和非还原条件下均出现与预期大小相符的蛋白条带,经Western blotting验证,上清中表达的重组E2蛋白能够被抗E2蛋白单克隆抗体WH303所识别,表明构建的悬浮293细胞系能够表达重组E2蛋白。通过优化表达条件,悬浮293细胞培养第8天时上清中重组E2蛋白浓度最高可达5.84μg·m L-1。可溶性蛋白阻断试验结果显示,重组E2蛋白具有阻断CSFV感染的活性。利用重组E2蛋白在病毒入侵过程中处理细胞对CSFV的感染同样具有显著抑制作用;阻断ELISA和中和试验结果显示,针对E2蛋白的多克隆抗体能够阻断CSFV感染,且具有良好的中和活性;吸附试验和内化试验证明,重组E2蛋白处理细胞能够显著抑制CSFV的内化,而利用多克隆抗体与CSFV感作后能够显著抑制其吸附。【结论】E2蛋白参与CSFV吸附和内化。     

猪瘟病毒石门株E2基因4个抗原结构域的原核表达

【目的】对猪瘟病毒石门株E2基因进行原核表达，以期获得可溶性表达产物，为检测猪瘟抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。【方法】用PCR技术扩增了重组S21质粒载体上的猪瘟病毒石门株E2基因的4个主要抗原结构域ABCD，A1A2，B和C。分别将4个片段克隆于pMAL－p2X载体中，经PCR、双酶切和测序鉴定，E2基因的4个主要抗原结构域片段的位置、大小和读码框均正确。将4个片段分别转化到表达菌TB1、BL21、BL21－CodonPlus(DE3)-RP和BL21(DE3)中，共得到16株重组表达菌，用IPTG进行诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析。【结果】E2基因的4个主要抗原结构域均可在这4种表达菌中表达，但以BL21－CodonPlus(DE3)-RP的表达效果最好，可表达出可溶性并且产量较高的目的蛋白。免疫印迹结果表明，表达的目的蛋白可以被猪瘟阳性血清和针对E2蛋白的单克隆抗体所识别。【结论】只表达目的基因的抗原结构域，可以缩短表达片段的长度，有利于获得可溶性目的蛋白，并且具有良好的血清学反应的特异性。