BMP4在牦牛和犏牛睾丸组织及支持细胞中的差异表达分析

【目的】从牦牛和犏牛睾丸组织中分离培养支持细胞，检测骨形态发生蛋白4基因（BMP4）及其受体基因在牦牛、犏牛睾丸组织及支持细胞中的表达情况，为深入研究BMP4对犏牛精子发生过程的作用提供理论基础。【方法】采集12月龄牦牛和犏牛睾丸组织，使用Trizol法提取各睾丸组织总RNA，利用RT-PCR技术检测BMP4及其受体基因（骨形态发生蛋白受体1B型(ALK6)、骨形态发生蛋白受体2型(BMPR2)、激活素A受体2A型(ACVR2A)、激活素A受体2B型(ACVR2B)）的mRNA表达水平。通过两步酶法消化睾丸组织制备细胞悬液，经差速贴壁、饥饿处理和胰酶消化分离纯化牦牛和犏牛睾丸支持细胞。采用HE染色、油红O染色、碱性磷酸酶（ALP）染色、免疫荧光染色鉴定支持细胞，用Trizol法提取细胞总RNA，RT-PCR检测支持细胞、生精细胞、间质细胞、类肌细胞标志基因和BMP4及其受体基因的mRNA表达水平。采用实时荧光定量PCR检测BMP4及其受体基因在牦牛和犏牛睾丸支持细胞中的差异表达情况。【结果】HE染色结果显示，第3代（F₃）支持细胞呈长条形或梭形。油红O染色结果显示，体外培养的细胞胞质中有明显脂滴积累，且在细胞核内可观察到支持细胞特有的双极小体结构。ALP染色结果显示，细胞不着色。免疫荧光染色结果显示，支持细胞标志蛋白GATA 结合蛋白4(GATA4）呈阳性表达。RT-PCR检测结果显示，支持细胞标志基因BMP4、SRY-box转录因子9基因（SOX9）、波形蛋白基因(Vimentin)、Wilm肿瘤抑制基因(WT1)、FAS细胞表面死亡受体基因(FAS）和胶质细胞源性神经营养因子基因(GDNF)存在明显表达，而生精细胞标志基因出局区解旋酶4(DDX4)和类肌细胞标志基因半胱氨酸的血管生成诱导剂61(CYR61)无明显表达，间质细胞标志基因细胞色素P450家族11亚家族A成员1(CYP11A1)则有少量表达。BMP4在牦牛和犏牛睾丸支持细胞中都有表达，且在牦牛支持细胞中的表达量显著高于犏牛支持细胞，而其受体基因ALK6、BMPR2、ACVR2A和ACVR2B在牦牛支持细胞中的表达量显著或极显著低于犏牛支持细胞。【结论】从牦牛和犏牛睾丸组织中分离获得支持细胞，BMP4在牦牛支持细胞中表达量较高，暗示BMP4对犏牛精子发生具有潜在调控作用。     

H9N2禽流感病毒河南分离株NS基因序列测定及进化生物信息分析

为明确河南地区鸡群中H9N2亚型AIV中非结构蛋白基因(NS)系统进化情况,对H9N2禽流感病毒河南分离毒株非结构蛋白基因(NS)进行扩增,并克隆到pGEM T载体中测序,获得NS蛋白的完整编码序列。将NS核甘酸序列与GenBank已有的参考序列作比对,结果表明,河南分离毒株的NS基因与上海F98处于同一分支;在AIV NS基因系统发育进化树中,对测得的序列进行种系发育关系研究,确定H9N2禽流感病毒河南分离毒株的进化关系。     

抑制TGF-β/Smads通路对Hyp促进浅色黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白沉积的影响

【目的】探讨Hyp对浅色黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白沉积的影响及其作用机制，为优质鱼胶的生产提供营养调控策略。【方法】将300尾浅色黄姑鱼（体质量（11.621±0.154） g/尾）随机分为Hyp空白组、Hyp添加组、SIS3干扰组、氧化苦参碱干扰组，每组3个重复，每重复25尾鱼，Hyp空白组饲喂日粮中不添加Hyp，其他3组均饲喂添加9.70 g/kg（前期试验确定的最佳添加量）L-羟脯氨酸的日粮，进行为期8周的饲养试验，SIS3、氧化苦参碱干扰组试验鱼在1月后分别腹腔注射转化生长因子(TGF-β)/Smads通路抑制剂SIS3和氧化苦参碱注射液100 μL/尾（SIS3和氧化苦参碱的计量分别为2和10 mg/kg）进行干扰试验，每周注射1次，直至试验结束。试验结束后，测定各处理组中浅色黄姑鱼生长指标（特定生长率、饲料系数、鳔体比、存活率、肥满度）、鱼鳔胶原蛋白含量，以及胶原蛋白代谢相关基因（COL1A1、COL1A2、P4Hα(Ⅰ)、P4Hα(Ⅱ)、P4Hα(Ⅲ)）和GF-β/Smads通路关键基因（TGF-β、TGF-βRT、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7）的表达，分析鱼鳔中胶原蛋白差异化沉积是否受TGF-β/Smads通路的调控。【结果】Hyp能显著促进浅色黄姑鱼生长及鱼鳔中胶原蛋白沉积，能显著上调COL1A1、COL1A1基因的表达，显著下调P4Hα(Ⅲ)的表达；SIS3显著降低了鱼鳔胶原蛋白沉积；SIS3和氧化苦参碱对胶原蛋白代谢相关基因及TGF-β/Smads信号通路关键基因表达无显著影响。【结论】TGF-β/Smads信号通路可能不是调控Hyp促进鱼鳔胶原蛋白沉积的主要途径。Hyp作为胶原蛋白分解产物，其促进胶原蛋白沉积可能与其抑制胶原蛋白降解有关。     

草鱼芳香烃受体ahr1a基因克隆、表达及进化分析

芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor,AhR)作为配体激活的转录因子在T细胞、单核细胞和树突状细胞(Dendritic cells,DCs)的功能调节方面扮演重要角色,炎症相关细胞因子的产生与AhR信号通路也密切相关。为阐明草鱼(Ctenopharyngodon idella)ahr1a基因在炎症发生过程中的作用,本研究克隆获得了草鱼ahr1a基因cDNA序列,全长2 893 bp,其编码区共2 544 bp,编码847个氨基酸。结构域预测发现草鱼AhR1a蛋白含有螺旋-环-螺旋(Helix-loop-helix,HLH)超家族中bHLH-PAS(Period-aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator single minded,Pre-Arnt-Sim)亚家族的典型结构域。氨基酸序列分析表明,草鱼AhR1a与黄河鲤(Cyprinus carpio)的相似性与一致性最高。系统进化树结果发现草鱼ahr1a基因与金鱼(Carassius auratus)、黄河鲤和斑马鱼(Danio rerio)的同源基因聚在一支。草鱼ahr1a基因在多个组织(肠、鳃、肾、肝、头肾、胸腺、脾、皮肤、脑)中均有表达,其中肠和鳃表达量最高。草鱼感染柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)后,ahr1a在脾(24、48 h)和头肾(12、24 h)中的表达水平显著下降。腹腔注射草鱼呼肠孤病毒(Reovirus of grass carp,GCRV)后,脾和头肾中ahr1a表达水平无明显变化。体外实验结果显示,脂多糖(Lipopolysaccride,LPS)和IL-1β重组蛋白下调草鱼原代头肾白细胞中ahr1a的表达。综上所述,本研究克隆分析了草鱼ahr1a基因并初步证实其参与炎症反应的调控。     

鳗鲡属6种鱼类线粒体COⅠ和COⅡ基因序列分析和分类的有效性

对鳗鲡属（Anguilla）的美洲鳗鲡（A. rostrata）、欧洲鳗鲡(A. anguilla)、太平洋双色鳗鲡(A. bicolor pacifica) 、花鳗鲡(A.marmorata)、澳洲鳗鲡(A. australis )、日本鳗鲡（A.japonica）6种鱼类54个体COⅠ和COⅡ基因片段中1 179 bp和633 bp的序列特征、分子分类的有效性、以及构建的系统关系进行了比较分析,结果表明：（1）COⅠ和COⅡ基因可变位点、简约信息的百分比分别为17.98%、16.45%和12.16%、10.11%,COⅠ较COⅡ基因的变异率高;（2）两种基因序列均表现出明显的反G偏倚(在COⅠ和COⅡ中G的百分含量分别为18.45%,16.67%);（3）基于COⅠ基因种间遗传距离均高于COⅡ基因,且均大于2%（欧洲鳗鲡和美洲鳗鲡基于COⅡ基因序列的种间遗传距离为1.8%除外）,种内遗传距离都小于1%;（4）以两序列构建的系统树,各物种所有个体均形成独立、高支持率单系,但两序列构建的系统关系并不完全一致。由此说明,COⅠ和COⅡ都能对鳗鲡属鱼类进行有效的物种分子鉴定,但在探讨鳗鲡属鱼类系统进化关系上还需要联合其它基因。     

冬瓜首雌花节位遗传分析与基因定位

【目的】对冬瓜首雌花节位基因（FFFN）进行遗传分析和定位，为FFFN基因的克隆奠定基础。【方法】以首雌花节位差异显著的冬瓜高代自交系材料B214 (P₁)和B227 (P₂)及以P₁为母本和P₂为父本构建的F₁（P₁×P₂）、F₂、B₁（F₁×P₁）和B₂（F₁×P₂）遗传群体为材料，采用6世代混合模型分析方法对FFFN进行遗传分析，并利用已构建的高密度SNP遗传图谱进行数量性状位点(QTL)分析。【结果】冬瓜FFFN遗传符合E模型，主要受2对主基因的加性效应及2对主基因的加性互作效应控制，同时受环境影响较大；结合已构建的高密度分子遗传图谱，仅检测到1个与FFFN相关的QTL位点（FFFN2.1），其对数优势比阈值（LOD）为11.7，贡献率为32.1%，位于2号染色体上的Marker 61668-Marker 39179，物理距离为7.64 Mb。通过标记加密将FFFN2.1定位在InDel2和SSR91之间的1.38 Mb范围。候选区间内有28个候选基因（Bhi02M001022～Bhi02M001049），其中11个基因没有功能注释，其他17个注释的功能基因包括生长素反应蛋白（ARF）、逆转录酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、三角状五肽重复蛋白等。【结论】冬瓜FFFN是多基因控制的数量性状，主效位点FFFN2.1定位在InDel2和SSR91之间，结合功能注释推测Bhi02M001033为候选基因。     

基于全基因组重测序分析藏猪骨骼肌发育相关基因

为从全基因组水平探索影响藏猪骨骼肌发育的遗传变异，本研究对5头迪庆藏猪进行全基因组重测序，并合并NCBI数据库中来自3个省的藏猪、与藏猪同样小体型及生长慢的巴马香猪、及体型大且生长快速的杜洛克和大白猪共70个猪只的全基因组重测序数据进行整合分析，获得全基因组SNP后结合选择信号检测与等位基因频率(AF)分析鉴定藏猪-香猪与杜洛克-大白猪的遗传差异；利用GO和KEGG功能富集分析藏猪骨骼肌转录组与蛋白组相关基因。结果发现:1)2 211个基因在藏猪-香猪与杜洛克-大白猪2个比较组中存在遗传差异，138个基因富集到骨骼肌发育相关的GO功能集及KEGG通路；2)9个基因(UCHL3、POSTN、COL12A1、PGK1、JPH1、GPT2、RBFOX1、FLNB和DCX)已报道参与藏猪60 d胚胎背最长肌发育调控，1个(CKM)参与6月龄藏猪背最长肌发育调控；3)10个基因共包含936个SNP，其中655个SNP位于基因间区，255个是内含子变异，少量SNP是外显子及调控区变异。本研究从全基因组水平鉴定了与藏猪骨骼肌发育相关基因及其遗传变异，为以后持续深入解析藏猪骨骼肌发育的遗传机制提供参考。     

从巨噬细胞极化角度分析不同油脂饮食对小鼠腹股沟皮下脂肪组织沉积的影响

为分析两种脂肪供能条件下3种不同油脂饮食对小鼠腹股沟皮下脂肪沉积及其巨噬细胞分型的影响，90只C57BL/6 J小鼠被随机分为6组，分别饲喂低脂猪油(Lar-10%)、低脂菜籽油(Rap-10%)、低脂橄榄油(Oli-10%)、高脂猪油(Lar-30%)、高脂菜籽油(Rap-30%)和高脂橄榄油(Oli-30%)，16周后解剖取腹股沟皮下脂肪组织，并对其进行苏木精-伊红染色，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)含量检测，M1、M2型巨噬细胞标记物(CD11c和CD206)荧光双染，并通过ELISA检测其含量。结果表明:1)在低脂饮食条件下，三种油脂对小鼠腹股沟皮下脂肪组织重量、脂肪细胞横截面积、腹股沟皮下脂肪ROS含量均无显著影响(P>0.05)；2)随着脂肪供能水平的提高，小鼠腹股沟皮下脂肪沉积显著增加(P<0.05)，在高脂饮食条件下，Lar-30%组的小鼠腹股沟皮下脂肪组织重量显著高于Rap-30%和Oli-30%组(P<0.05)，并且相对于其他两组，Oli-30%组小鼠腹股沟皮下脂肪组织中ROS含量极显著降低(P<0.01)；3)高脂饮食会增加脂肪组织中巨噬细胞标记物CD11c和CD206的含量，但摄入橄榄油的小鼠CD206/CD11c比值显著高于摄入猪油和菜籽油的小鼠(P<0.05)。综上，降低脂肪供能水平能有效减少脂肪沉积，且与摄入猪油和菜籽油相比，摄入橄榄油可能通过增加CD206/CD11c比值，抑制巨噬细胞向M1型转化，减少脂肪组织中ROS的产生，降低炎症，从而减少脂肪沉积。     

鸡IHH基因生物信息学及组织特异性表达分析

为分析鸡印度刺猬因子(Indian hedgehog，IHH)基因生物信息学及IHH基因在不同组织中特异性表达规律，选取体重相近、健康强健的6只鸡，借助生物信息学手段，对IHH基因结构、启动子和CpG岛进行分析，并通过实时荧光定量PCR检测IHH基因在鸡心、肝、脾、肺、肾、软骨、下丘脑、胸肌、十二指肠和胸腺组织中的特异性表达规律，同时对IHH蛋白进行相似性比较，并利用生物信息学分析IHH蛋白的理化和结构特性。结果表明，1)鸡IHH基因开放阅读框长度为1 227 bp，可编码408个氨基酸，具有3个外显子、4个核心启动子区和1个CpG岛。2)成功扩增IHH基因，IHH基因在鸡各组织中均有不同水平的mRNA表达，在软骨组织中相对表达量最高，在心、脾和胸腺组织中的表达量相对较低。3)鸡IHH蛋白在禽类中保守性较高，IHH蛋白大小为44.829 36 ku，属于偏碱性蛋白，具有1个跨膜端和1个信号肽；IHH蛋白二级结构中无规则卷曲的比例最高(44.12%)，只含有1个 HH-Signal功能域，内含大部分丝氨酸磷酸化位点，该蛋白还有14个苏氨酸磷酸化位点和5个酪氨酸磷酸化位点，鸡IHH蛋白存在1处N型糖基化位点和6处O型糖基化位点。综上，鸡IHH基因有3个外显子，有多个启动子区，在软骨组织中极显著高表达，鸡IHH蛋白是具有偏碱性、强热稳性和低亲水性的分泌型蛋白，IHH氨基酸序列在物种进化过程中比较保守，本研究为深入研究鸡IHH基因对软骨发育的调控作用提供依据。     

脂肪组织分泌产物及其对脂肪形成的调控

脂肪组织产生和分泌一系列以自/旁分泌或内分泌方式起作用的细胞因子,参与脂肪组织局部及整个机体能量代谢,并和与肥胖相关的多种代谢综合征有关.阐明脂肪组织分泌因子的生理学作用,有助于更好的理解脂肪形成的机制.本文主要阐述了脂肪组织分泌因子白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、纤溶酶原激活物抑制因子-1、血管紧张素Ⅱ和抵抗素的功能特性及其对脂肪形成的影响.     

ICR小鼠肥胖模型的建立以及肥胖指标和脂肪组织形态学比较

[目的]建立ICR小鼠肥胖模型,并比较肥胖型小鼠与对照组小鼠脂肪组织形态学的差异。[方法]以ICR小鼠为研究对象,饲喂高脂日粮构建肥胖模型,测定其体重、脂肪组织湿重和脂肪系数,并进行比较。[结果]雌性和雄性小鼠肥胖造模的成功率分别为16.67%和66.67%。用高脂日粮饲喂60 d后肥胖小鼠脂肪细胞体积明显增大,肥胖型小鼠体重、脂肪组织湿重和脂肪系数与对照组相比均存在极显著差异﹙P0.01﹚。[结论]该研究为ICR小鼠肥胖模型的建立以及脂肪组织的形态学研究提供依据。     

大鲵脂肪组织分布及其理化特性

从大鲵的尾部开始,每隔1 cm切取大鲵肉块,观察其脂肪组织分布;通过石蜡切片、HE染色后观察脂肪细胞;通过流变仪测定大鲵脂肪粘度;通过气相色谱/质谱联用技术分析大鲵脂肪的脂肪酸组成。结果表明,大鲵脂肪主要集中于尾部2/3处至尾尖,尾部2/3处至尾鳍部脂肪含量显著减少,尾鳍部只存在极少量的皮下脂肪;脂肪细胞有较强的流动性,易变形、易碎;脂肪具牛顿流体特性,粘度为0.0289Paos;大鲵脂肪主要含13种脂肪酸(C18:124.2%,C16:015.4%,C16:113.7%,C18:28.2%,C20:56.7%,C18:34.5%,C22:64.3%,C14:13.0%,C18:02.8%,C22:52.6%,C20:42.2%,C17:02.0%,C17:11.9%)。     

猪前体脂肪细胞的培养方法及生物学特征研究

[目的]研究大白猪前体脂肪细胞培养方法[方法]选用出生3d的仔猪脂肪组织,采用原代消化细胞法进行分离,培养后,研究猪脂肪组织增生的生物学特征[结果]结果表明,培养的原代细胞经传代后成分均一、生长旺盛充脂率高,培养细胞含有可被油红O染色的脂滴,具有前脂肪细胞的典型特征。[结论]试验建立的培养方法适用于脂肪细胞的培养和纯化,脂肪细胞特征典型。     

黄酮类调节脂肪平衡与降低心血管疾病发生机制的研究进展

对黄酮类对调节脂肪平衡、降低心血管疾病发生的机制进行阐述。     

延边黄牛和延黄牛脂肪组织FASN基因mRNA表达水平与肉质的关系

为了探讨不同品种牛不同脂肪沉积部位FASN基因mRNA表达水平与肉质的关系,采用荧光定量PCR技术检测延边黄牛和延黄牛皮下脂肪、腹部脂肪、肾周脂肪与其他器官的FASN基因mRNA表达水平。结果表明,2个牛品种的FASN基因mRNA在不同脂肪组织中表达量均高于背最长肌,而延黄牛皮下脂肪和腹部脂肪中FASN基因mRNA表达量都高于延边黄牛。通过对肺、小肠、肾脏、肝脏和心脏中FASN基因mRNA研究发现,延边黄牛和延黄牛肺中FASN基因mRNA的表达量高于其他脏器。由此可见,FASN是影响脂肪酸合成的关键酶,与肉质相关,其中皮下脂肪和腹部脂肪是脂肪酸合成的主要部位。     

地塞米松对小鼠脂肪组织中孤啡肽及其受体基因表达的影响研究

目的:探讨地塞米松对孤啡肽及其受体mRNA在小鼠附睾脂肪组织中表达的变化。方法:将12只雄性昆明小鼠,随机分为正常组和地塞米松组,分别采集其脂肪组织,用RT-PCR方法检测孤啡肽及其受体mRNA水平的变化。结果:与正常组相比,地塞米松组孤啡肽及其受体的mRNA表达水平明显下降(P<0.05)。结论:地塞米松可能抑制孤啡肽及其受体基因的活性和合成,对孤啡肽及其受体基因的表达可能具有强烈的下调作用。     

肉鸭PLIN基因PCR RFLP多态性与胴体、脂肪性状关联分析

研究PLIN基因外显子2和内含子2多态性与肉鸭部分产肉性状的关系。以361只北京鸭(Z2系、Z4系、Z2×Z4杂交系)和樱桃谷鸭为材料,利用PCR-RFLP方法和测序技术,对PLIN基因外显子2和内含子2进行SNPs位点检测,并对SNPs位点与部分产肉性状进行关联性分析。结果显示,在外显子2检测到C→T突变,分析表明,樱桃谷鸭群体中,胴体质量、全净膛质量和腹脂质量分数在CC和CT型之间差异极显著(P<0.01),腹脂质量和皮脂质量分数在CC和CT型之间差异显著(P<0.05);北京鸭Z4系群体中,全净膛质量在TT型与CC、CT型之间差异显著(P<0.05);北京鸭杂交系群体中,全净膛质量在CC和CT型之间差异显著(P<0.05)。在内含子2检测到C→T突变,分析表明,北京鸭Z4系群体中,全净膛质量在EE和DE型之间差异极显著(P<0.01),EE和DD型之间差异显著(P<0.05);北京鸭杂交系群体中,胸肌质量在DD和DE型之间差异极显著(P<0.01),皮脂质量分数在DD和EE型之间差异显著(P<0.05)。说明PLIN基因单核苷酸多态性对肉鸭胴体、脂肪性状有一定的影响,可作为影响胴体和肉质的候选基因,指导优良肉鸭品种的选育工作。     

烟酸对高脂血症兔瘦素、过氧化体增殖物激活型受体γ和CD36表达的影响

目的探讨烟酸对高脂血症兔血清瘦素及皮下脂肪组织瘦素、过氧化体增殖物激活型受体γ及CD36 mRNA表达的影响。方法12只健康雄性新西兰兔给予高胆固醇饮食饲养8周后,随机分为高脂组和烟酸组:高脂组继续饲以高胆固醇饲料6周;烟酸组在饲以高胆固醇饲料的基础上给予烟酸0.2g/(kg.d),共6周。另选择普通饮食14周兔(n=6)作为对照组。实验结束后,取腹股沟处皮下脂肪组织称重并冻存,用酶联免疫吸附法测定血清及脂肪细胞培养基瘦素水平;半定量逆转录聚合酶链反应测定脂肪组织瘦素、过氧化体增殖物激活型受体γ及CD36mRNA的表达。此外,在体外观察不同浓度的烟酸对高脂兔脂肪细胞瘦素、过氧化体增殖物激活型受体γ及CD36 mRNA的表达。结果高脂组兔血清及脂肪组织瘦素水平明显高于正常对照组,烟酸治疗6周后可降低血清及脂肪组织瘦素水平。逆转录聚合酶链反应表明烟酸组较高脂组瘦素mRNA表达降低,瘦素mRNA与过氧化体增殖物激活型受体γmRNA和CD36 mRNA的表达呈负相关。体外实验亦表明,烟酸呈剂量依赖性地降低脂肪细胞瘦素mRNA表达,并剂量依赖性地上调过氧化体增殖物激活型受体γ及CD36 mRNA的表达。结论烟酸治疗能降低高脂血症兔血清及脂肪分泌瘦素水平,上调过氧化体增殖物激活型受体γ及CD36 mRNA的表达。     

组织工程脂肪的构建

为探索构建组织工程脂肪的新方法,分离出转染GFP基因的小鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs),将细胞、胶原结合碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的复合物注射到裸鼠皮下,6周后取材。试验组ADSCs经过2周成脂诱导,对照组ADSCs未经成脂诱导。组织学结果显示试验组形成典型的"网状"脂肪组织结构,对照组无明显的脂肪结构形成。RT-PCR证实试验组PPARγ2和C/EBPα基因的表达,对照组PPARγ2和C/EBPα基因不表达。ADSCs与bFGF混合,以胶原作为支架构建组织工程脂肪是可行的,为临床脂肪组织缺陷的治疗提供新的思路。