毛竹香豆酸-3-羟基化酶基因的克隆与表达研究

香豆酸-3-羟基化酶（C3H）是木质素单体合成中的一个关键酶。采用文库筛选的方法从毛竹萌发种子全长cDNA文库中克隆了1个C3H基因,命名为PheC3H.PheC3H基因全长1 842 bp,包括1个完整的开放阅读框,编码1个由513个氨基酸残基组成的蛋白（PheC3H）,C端具有1个细胞色素P450蛋白（CYP450）特异的保守结构域。相似性比对显示, PheC3H与其他植物的C3H有着较高的相似性,其中与小麦的CYP98A蛋白相似性最高,达91.2%;聚类分析表明,PheC3H属于CYP98A亚家族蛋白;实时定量PCR结果表明,PheC3H在一年生实生毛竹叶鞘中表达量最高,其次是在根中,在叶片和茎中表达量相对较低。     

山楂中木质素合成调控转录因子MYB46的克隆及功能鉴定

模式植物拟南芥AtMYB46在次生壁形成过程中充当纤维素、木质素和木聚糖生物合成基因的转录调节因子,其表达受植物特异性转录因子NAC家族成员的调控。然而,果树次生壁生物合成的调节机制在很大程度上尚不清楚。从山楂(Crataegus pinnatifida)中分离克隆得到与拟南芥和苹果中MYB46具有高度保守R2R3 MYB DNA结合结构域的MYB46编码基因,并将其命名为CpMYB46。通过农杆菌介导的转化方法分别在拟南芥、烟草和苹果中异位表达CpMYB46基因。异位表达CpMYB46基因的拟南芥和烟草的次生壁过量沉积而导致生长受到限制,表现出株型矮小和叶片上卷的表型。定量RT-PCR数据表明,CpMYB46基因可以调控转基因植株次生细胞壁生物合成中下游基因的表达,茎切片观察表明异位表达CpMYB46明显增加了转基因拟南芥、烟草和苹果木质部中次生壁厚度。EMSA实验结果表明其上游NAC家族成员CpSND1可以直接结合CpMYB46基因的启动子。研究揭示了CpMYB46在DNA结合结构域与拟南芥和苹果中的MYB46具有高度保守性,而且在植物次生壁合成调控中也存在功能保守性。研究为揭示山楂内种皮中木质素的合成提供了分子依据,也为山楂的分子育种奠定了基础。     

植物木质部次生细胞壁加厚调控的研究进展

木质部是维管植物运输土壤水分和可溶性物质的复合组织,由管状分子、木薄壁细胞以及木纤维3部分组成,其中管状分子和木纤维细胞均能发生次生细胞壁加厚,为植物生长发育提供必要的支撑。对木质部次生细胞壁加厚转录因子的共同调控网络的研究进展进行综述,其中以NAC-MYB为核心的转录调控网络在该过程中扮演着关键性的作用;NAC转录因子家族可根据其调控部位分为VND基因家族、NST1/NST3转录因子和NST1/NST2转录因子,并直接调控下游MYB转录因子家族的表达,影响次生细胞壁的加厚。并以拟南芥、水稻、杨树等模式植物为例梳理调控机制,以便能更好的加深对植物木质部次生细胞壁加厚过程中转录调控的理解。     

毛竹早期光诱导蛋白基因克隆及功能分析

  目的  探究早期光诱导蛋白(ELIP)基因在竹子光保护中的作用,为进一步阐述竹子光保护机制提供参考依据。  方法  以毛竹Phyllostachys edulis实生苗为材料,在前期研究的基础上克隆毛竹ELIP基因,利用qRT-PCR技术研究其在不同光照诱导下的表达谱,同时通过在拟南芥Arabidopsis thaliana中异位表达对1个基因的功能进行初步鉴定。  结果  克隆获得了3个毛竹ELIP基因(PeELIP1、PeELIP2和PeELIP3),分别编码165、179和182个氨基酸。蛋白结构分析表明:3个PeELIPs蛋白均具有典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域,含3个α-螺旋跨膜结构,属于叶绿素a/b结合蛋白超家族。序列比对及进化分析表明:PeELIPs与水稻Oryza sativa、玉米Zea mays等单子叶植物的ELIPs相似性较高,同源性达72%以上,聚类在同一分支。qRT-PCR分析表明:3个PeELIPs基因在毛竹黄化苗中仅检测到微弱表达,光照处理使3个基因的表达量均显著上调;同时在正常毛竹实生苗叶片中,随着光照强度的增强和强光胁迫处理时间的延长,3个PeELIPs基因的表达量都显著上调。过表达PeELIP3可减缓转基因拟南芥在强光下F_v/F_m的下降幅度,但未影响转基因植株的非光化学猝灭系数。  结论  毛竹中至少存在3个PeELIPs,且其表达均受光照的诱导。过量表达PeELIP3能够减缓转基因拟南芥受光抑制的程度,具有一定的光保护作用。图8表1参40     

过量表达小麦TaCYP78A5增加花器官的大小

【目的】利用表达模式分析、转基因过表达和细胞学观察等策略,解析TaCYP78A5调控花器官大小的功能和机制,为作物遗传改良提供基因资源和理论基础。【方法】根据EnsemblPlants基因组数据库中不同物种CYP78A家族成员的序列信息,对小麦TaCYP78A5和其他物种中的同源基因进行序列比对和进化分析;利用生物信息学分析小麦TaCYP78A5的基因和蛋白结构,以及不同器官的表达模式;通过在拟南芥中组成型过表达和生殖器官局部特异性过表达TaCYP78A5的策略,明确TaCYP78A5具有调控花器官大小的功能;利用显微镜观察不同转基因拟南芥花器官的细胞学特征,解析TaCYP78A5调控花器官大小的细胞学机制;利用小麦转基因过表达策略,明确TaCYP78A5调控小麦穗部大小等其他穗部性状的功能;利用323份小麦品种的单倍型数据与穗部表型数据进行关联分析,探析不同小麦品种TaCYP78A5表达量的高低对穗部大小等其他穗部性状的影响。【结果】小麦TaCYP78A5与拟南芥AtCYP78A5的基因和蛋白序列相似性较低,但基因和蛋白结构相似性较高。小麦TaCYP78A5和拟南芥AtCYP78A5...     

菊科植物青蒿细胞色素P450基因家族分析

菊科植物青蒿由于体内含有青蒿素-目前世界公认的抗疟疾首选药物,而倍受科学家的关注.本研究从NCBI中下载到青蒿P450全部全长序列,经过一致性鉴定,共获得41个P450单加氧酶基因.根据P450标准命名规则,这41个基因分布在3个基因簇的11个家族中.与水稻、拟南芥P450比对发现,拟南芥中所特有的CYP82、CYP83和CYP716中有3个家族在青蒿中出现,而水稻特有的CYP92家族在双子叶植物青蒿中也存在.对青蒿P450蛋白的理化性质和结构特性进行了分析,次级结构分析表明,青蒿P450蛋白二级结构极其相似,其高级结构以α-螺旋为主.     

菊科植物青蒿细胞色素P450基因家族分析（英文）

菊科植物青蒿由于体内含有青蒿素-目前世界公认的抗疟疾首选药物,而倍受科学家的关注。本研究从NCBI中下载到青蒿P450全部全长序列,经过一致性鉴定,共获得41个P450单加氧酶基因。根据P450标准命名规则,这41个基因分布在3个基因簇的11个家族中。与水稻、拟南芥P450比对发现,拟南芥中所特有的CYP82、CYP83和CYP716中有3个家族在青蒿中出现,而水稻特有的CYP92家族在双子叶植物青蒿中也存在。对青蒿P450蛋白的理化性质和结构特性进行了分析,次级结构分析表明,青蒿P450蛋白二级结构极其相似,其高级结构以α-螺旋为主。     

毛竹GRF基因家族全基因组鉴定与表达分析

  目的  探究毛竹Phyllostachys edulis GRF基因家族的性质、结构特点以及在不同组织中的表达水平,为进一步研究GRF在毛竹生长发育中的分子作用机制奠定基础。  方法  采用生物信息学方法,对毛竹全基因组和转录组信息进行分析,筛选出13个毛竹GRF基因家族成员,并对GRF基因家族的理化性质、进化、基因结构、保守结构域、启动子、基因家族表达模式及三级结构进行分析。  结果  毛竹GRF基因家族成员按照其在scaffold上分布的位置,分别被命名为PeGRF01~PeGRF13;将含有3个内含子的PeGRF04和PeGRF12归为非ε组,其余为ε组。毛竹各GRF基因家族成员理化性质存在一定的差异,但是其结构域相对保守,均含有14/3/3结构域。毛竹GRF家族启动子区含有大量与光响应、低温响应、激素调控等相关的顺式作用元件。毛竹GRF存在基因复制扩增的现象,与水稻Oryza sativa的共线性关系明显高于拟南芥Arabidopsis thaliana。毛竹GRF在不同组织器官中均有表达,各家族成员的表达量存在差异;在毛竹花和根组织中的表达量略高于叶和鞭,同时家族成员间的表达量也存在一定差异。GRF蛋白质由2个单体构成,每个单体由9个α-螺旋构成,整体结构呈“W”型。  结论  毛竹GRF基因家族具有典型的14/3/3结构域,可能参与根、鞭、叶、花序及笋芽的生长发育过程。图6表1参39     

拟南芥转录因子CBF1基因的克隆与原核表达

CBF1转录激活因子与植物的抗逆密切相关,根据GenBank中拟南芥（Arabidopsis thaliana）CBF1（C-repeat/dre binding factor 1）基因的编码区设计1对特异引物,通过RT-PCR扩增出拟南芥CBF1基因,随后亚克隆到pMD18-T载体,测序、序列分析表明与拟南芥CBF1对应区域相似性为100%。将该片段亚克隆到原核表达载体pET22b（＋）中构建原核表达质粒,转化大肠杆菌ER2566,在IPTG诱导下产生CBF1蛋白,SDS-PAGE结果表明表达的蛋白约24ku,与预期一致。     

橡胶树乳管HbPMP1基因的克隆与表达分析

过氧化物酶体膜蛋白PMP是ABC转运蛋白ABCD亚家族蛋白之一．存在于过氧化物酶体膜上。研究表明．拟南芥中的ABCD亚家族ABC转运蛋白AtABCD1主要通过参与部分物质运输进入过氧化物酶体．其中包括茉莉酸合成的前体OPDA。本研究通过RACE技术克隆了一个ABCD亚家族ABC转运蛋白基因HbPMP1．并进行表达分析。结果表明：HbPMP1全长4011bp．编码1337个氨基酸残基,其表达产物与拟南芥AtABCDl有较高的相似性（氨基酸一致性为78％）：该基因在伤害及外源茉莉酸诱导下呈上调表达．推测其可能参与内源茉莉酸合成相关物质时的运输．     

紫贻贝野生群体与养殖群体线粒体COI基因的遗传比较分析

[目的]比较紫贻贝野生群体与养殖群体线粒体COⅠ基因的遗传多样性,为其种质资源筛选提供理论依据。[方法]采集山东省乳山市野生紫贻贝(Mytilus edulis Linnaeus)和养殖紫贻贝各12个样本;通过设计特异性引物,采用PCR技术对24个个体的mtDNA COⅠ序列进行了扩增,测序得到的序列总碱基数为706 bp;采用MEGA(Version 4.0)和DnaSP(Version 4.0)软件对序列进行了分析。[结果]24条序列中T、C、A和G碱基平均含量分别为34.6%、16.7%、25.9%和22.8%,其中A+T的含量(60.5%)显著高于G+C含量(39.5%),表现了明显的碱基偏倚。24个个体表现为18种单倍型,包括568个多态位点,单倍型间平均遗传距离为0.683,单倍型多态性(h)为0.953,核苷酸多态性(π)值为0.317 69。[结论]紫贻贝的遗传多样性水平较高,且乳山养殖群体和野生群体无遗传分化。     

西番莲蔓枯病病原鉴定初报

 从采自云南省潞西县西番莲枯枝上分离到两种分离物,鉴定为胡萝卜链格孢〔Alternariadauci(Kuehn) Groveset.Skolko〕和多隔镰孢(Fusarium decemcelulare Brick).致病性测定证实两种病原菌都能引起西番莲枝蔓枯死,且两者复合接种,枝蔓枯死加重,据此初步认为该病为复合侵染病害,并将该病称为"西番莲蔓枯病".本文描述了西番莲蔓枯病的症状、病原菌形态和致病性测定结果.     

双齿围沙蚕CYP4基因的克隆及序列分析

根据已知的绿沙蚕Nereisvirens细胞色素氧化酶CYP342A1保守区设计引物,采用RACE技术首次从双齿围沙蚕Perinereisaibuhitensis体壁肌肉中克隆出细胞色素氧化酶CYP4基因全长序列。分析结果表明,该序列全长为1857bp,5’端非翻译区为186bp,3’端非翻译区为225bp,阅读框为1446bp,编码为481个氨基酸。第422～431氨基酸序列符合P450所具有的结构保守共有序列FxxGxxxCxG,第319～322氨基酸序列为K螺旋特征基序ExxR区,第282～294氨基酸序列含有CYP4家族特征序列EVDTFMFEGHDTr。经Blast与GenBank中已知物种的氨基酸序列进行同源性比对,CYP4与多毛类绿沙蚕Nereisvirens CYP4BB1、CYP342A1（AY453408）氨基酸同源性为73％、36％,与多毛类小头虫CapiteUacapitataCYP4ATI（AY574044）同源性为39％。据此推断,双齿围沙蚕CYP4基因属于CYP4B亚家族。     

泥鳅和大鳞副泥鳅细胞色素P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)基因的克隆及组织表达分析

采用3'-和5'-RACE法克隆了泥鳅和大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因的cDNA全长序列,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。结果表明,泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 706 bp,开放阅读框(open reading frame, ORF) 1 563 bp,编码520个氨基酸;大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 763 bp,ORF长1 545 bp,编码514个氨基酸。2种鳅CYP17-Ⅰ氨基酸序列都有1个信号肽、1个跨膜区、1个保守的蛋白结构域和3个功能保守区。相似度分析显示,2种鳅之间CYP17-Ⅰ相似度为99%,与其他鱼类的相似度也超过70%。系统进化分析显示,2种鳅之间关系最为接近,其系统发育关系基本符合传统的分类地位。qRT-PCR结果显示,CYP17-Ⅰ在2种鳅的肠、肌肉、心脏、胃、肝脏、精巢、卵巢、脾脏等8个组织均有表达,在精巢和卵巢中表达量相对较高。     

毛竹林皆伐和剩余物保留对土壤质量的影响

  目的  毛竹Phyllostachys edulis林生态修复是当前中国亚热带地区面临的一个难题。了解毛竹林皆伐和剩余物保留后迹地土壤的自然恢复状况可为毛竹林生态修复提供指导。  方法  在毛竹林皆伐迹地设置了保留采伐剩余物(UR)、清理采伐剩余物(CR)和未采伐毛竹林地作为对照(ck)等3个处理。5 a后,通过土壤调查与测定,分析比较不同处理土壤指标变化,运用模糊判别和主成分分析,定量评价毛竹林皆伐后土壤自然恢复效果。  结果  ①CR、UR处理土壤容重分别比ck降低31%和14% (P＜0.05),土壤总孔隙度、毛管持水量、田间持水量和饱和持水量均高于ck;UR处理土壤的持水力整体优于CR处理。②CR、UR处理土壤有机碳、全氮、全磷、碱解氮和速效钾质量分数均高于ck,各指标增加幅度为117%~123%;有效磷则表现为CR处理极显著(P＜0.01)低于UR和ck;由于保留了毛竹林皆伐后采伐剩余物,UR处理土壤有机碳、全氮、全磷、碱解氮、有效磷显著高于CR处理33%~99% (P＜0.05);③CR、UR处理土壤脲酶、β-葡萄糖苷酶和过氧化物酶活性高于ck;UR处理土壤3种胞外酶活性均高于CR处理46%~98%。④综合评价结果表明:土壤质量得到较好恢复,毛竹林皆伐后恢复迹地土壤综合得分从高到低依次为采伐剩余物保留样区、采伐剩余物清理样区、毛竹林样区。  结论  毛竹林皆伐后的土壤经过5 a自然恢复,与毛竹林林地土壤相比得到较快修复,毛竹林皆伐后保留采伐剩余物更有利于土壤修复。图1表4参23     

转飞蝗CYP408B1和CYP409A1基因果蝇品系对杀虫剂的敏感性

【目的】细胞色素P450（Cytochrome P450）是昆虫体内广泛分布的代谢解毒酶系,飞蝗（Locusta migratoria）是重要农业害虫,揭示其体内P450代谢解毒功能对飞蝗有效治理尤为必要。研究旨在将飞蝗2个P450基因CYP408B1和CYP409A1分别转入果蝇（Drosophila melanogaster）体中,建立转基因果蝇品系,测定果蝇对杀虫剂的敏感性,为进一步探索飞蝗CYP408B1和CYP409A1对杀虫剂的代谢解毒功能提供依据。【方法】采用转基因技术成功构建转飞蝗P450基因CYP408B1和CYP409A1的纯合果蝇品系;分别选择雄性转基因果蝇UAS-CYP408B1、UAS-CYP409A1和亲本果蝇attp40与tub-gal4的处女果蝇杂交,提取子一代启动目的基因CYP408B1和CYP409A1表达的转基因果蝇品系tub＞CYP408B1和tub＞CYP409A1以及对照组果蝇品系tub＞attp40的DNA和总RNA,并将RNA体外反转录为cDNA。分别以DNA和cDNA为模板,PCR方法验证转基因果蝇品系UAS-CYP408B1和UAS-CYP409A1;通过杀虫剂生物学测定,进一步分析转基因果蝇品系tub＞CYP408B1、tub＞CYP409A1以及对照组tub＞attp40、UAS-CYP408B1、UAS-CYP409A1和attp40对溴氰菊酯、马拉硫磷和毒死蜱3种杀虫剂的敏感性;采用荧光法定量测定转基因果蝇品系tub＞CYP408B1、tub＞CYP409A1以及对照组tub＞attp40中细胞色素P450的总酶活性。【结果】PCR扩增结果显示以DNA为模板,启动目的基因表达的转基因果蝇品系tub＞CYP408B1和tub＞CYP409A1中均可以检测到目的条带,大小分别为1 555和1 585 bp;以cDNA为模板进行RT-PCR和RT-qPCR,结果显示在转基因果蝇品系中飞蝗CYP408B1和CYP409A1均得到表达。对3种杀虫剂的生物测定结果显示转基因果蝇品系tub＞CYP408B1和tub＞CYP409A1对溴氰菊酯的抗药性均较对照组高,且与tub＞attp40相比,抗性比分别为1.59和1.83,而对马拉硫磷和毒死蜱的抗性比并未提高。细胞色素P450总酶活性结果显示转基因果蝇品系tub＞CYP408B1和tub＞CYP409A1总酶活性与对照组tub＞attp40相比,均无显著性差异。【结论】利用转基因技术成功构建了转飞蝗P450基因CYP408B1和CYP409A1的果蝇品系UAS-CYP408B1和UAS-CYP409A1;飞蝗CYP408B1和CYP409A1均对溴氰菊酯具有一定的解毒功能。     

低磷胁迫对毛竹幼苗生长和养分生理的影响

  目的  探究低磷胁迫对不同生长时期根际土壤养分环境、毛竹Phyllostachys edulis幼苗生长和养分生理的影响及其持续效应,分析毛竹幼苗对低磷胁迫的适应机制。  方法  通过盆栽播种育苗方式,研究了4种不同土壤有效磷水平:2.5 mg·kg?1(极低磷,P₁)、5.0 mg·kg?1(低磷,P₂)、10.0 mg·kg?1(中磷,P₃)、20.0 mg·kg?1(适磷,P₄)对当年生长季末(T₁)和翌年快速生长期(T₂)根际土壤养分环境、毛竹幼苗生物量及其分配、毛竹幼苗养分吸收利用和分配的影响。  结果  低磷处理组(P₁, P₂)显著降低T₁根际土壤pH (P＜0.05),并维持了根际土壤高氮质量分数;这种低磷效应趋势持续至T₂,且此时P₁和P₂的根际土壤有机质质量分数较P₄显著增加了10.70% (P＜0.05)。低磷处理组均显著降低了2个时期毛竹幼苗生物量及氮、磷、钾养分积累量(P＜0.05),且T₂时的降幅比T₁更高。T₁时,低磷处理组显著降低了毛竹幼苗根冠比(P＜0.05),也相对降低根系养分的分配比例;但T₂时,低磷处理组的根冠比分别较P₄显著增加44.30%和37.97% (P＜0.05),且显著增加了氮、钾养分在根系的分配比例(P＜0.05)。低磷处理组显著增加了T₁毛竹幼苗整株磷素利用效率(P＜0.05),随育苗时间推移,其利用效率下降,至T₂时,仅P₁较P₄显著增加了19.05% (P＜0.05)。  结论  低磷胁迫抑制了毛竹幼苗生长和养分积累,但提高了其整体磷素利用效率;随育苗时间延长至翌年快速生长期时,低磷胁迫对植株的抑制作用增强,但毛竹幼苗通过提高根冠比、根系养分分配比例来提高对低磷胁迫的适应性。图2表4参25     

毛竹 bZIP 转录因子的基因结构与进化分析

以毛竹基因组数据库中的107个编码bZIP转录因子的基因为材料，对其进行系统发育分析，筛选得到了A、 D和S亚族的bZIP家族成员，并对其基因结构、适应性进化、与水稻基因对之间的进化分歧时间及蛋白质同源建模等进行生物信息学分析。结果表明，毛竹A、 D和S亚族共有47个bZIP家族成员，其中A亚族18个， D亚族16个， S亚族13个。基因结构分析表明，3个亚族中内含子数量为0－16个，而且D亚族基因的内含子—外显子组成比A亚族和S亚族更为复杂。适应性进化分析表明，3个亚族总体上处于净化选择压力之下； A、 D和S亚族的平均进化分歧时间分别为279．0，265．6和202．9 Mya；47个毛竹bZIP蛋白质主要以α－螺旋为主，且D亚族的三级结构比A和S亚族复杂。     

车筒竹、箣竹和越南巨竹竹材的主要物理性质研究

以传统材用竹毛竹为对照,研究了大型丛生竹种车筒竹、箣竹和越南巨竹竹材的物理性质。结果表明,3种丛生竹竹材的基本密度分别为0.606、0.595g·cm-3和0.741g·cm-3,其中车筒竹和箣竹比毛竹材的密度(0.765g·cm-3)小,而越南巨竹与毛竹差异不大;从竹材干缩性来看,车筒竹、箣竹和越南巨竹的气干体积干缩率分别为7.5%、6.9%和6.5%,均比毛竹的相应值要大。3个竹种竹材的物理性能随竹秆部位不同而有差异,从秆基部到梢部,密度呈现逐渐上升的趋势,而干缩性变化规律不明显。