冰岛硫化叶菌xpb基因缺失突变体的构建及遗传学分析

为在体内研究古菌核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)机制,利用基因敲除的方法,对泉古菌核苷酸切除修复机制进行研究,构建了冰岛硫化叶菌编码真核生物NER解旋酶XPB同源蛋白的基因xpb1和xpb2单缺失突变体,从而在体内分析xpb1和xpb2基因的功能。结果表明:基因xpb1或xpb2不是冰岛硫化叶菌存活的必需基因。表型分析发现,xpb1和xpb2基因单缺失突变体相较野生型菌株REY15A,对DNA损伤试剂4-NQO 4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline 1-oxide,4-NQO)分别表现出轻微敏感性和不敏感性,暗示NER解旋酶功能在冰岛硫化叶菌体内存在多重冗余。     

特利波契巴尔通体基因敲除体系的建立

本研究旨在建立基于同源重组技术的特利波契巴尔通体基因敲除方法。研究通过扩增并融合Ⅳ型分泌系统VirB4基因的上下游同源片段,将同源片段与pJM05质粒进行体外拼接,并将pJM05-ΔVirB4质粒转化进入S17-1大肠杆菌中;通过双亲接合转移将大肠杆菌S17-1中的pJM05-ΔVirB4质粒转移到特利波契巴尔通体中进行同源臂交换,产生单交换菌株;随后利用质粒中sacB基因表达产物分解蔗糖对自身产生毒性作用,在蔗糖平板中筛选出22个双交换菌株,通过菌落PCR及测序验证,共确定出6个VirB4基因框内缺失菌株;并且测序结果表明这6个菌株在VirB4基因框内缺失了2 136 bp。     

酿酒酵母 ERG6基因缺失突变株的构建

设计含有与ERG6基因两侧序列同源的长引物,以质粒pBlue-Kan为模板进行PCR扩增,构建含有Cre/lox P系统的酿酒酵母ERG6基因敲除组件.将基因敲除组件转化至酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)AD1-8,通过同源重组的方式使目的基因缺失,获得为lox P-Kan-lox P序列组件所替换而产生Kanr的阳性克隆子.然后再将质粒pHis-Cre转入阳性克隆子表达Cre重组酶敲除筛选标记,成功获得酿酒酵母ERG6基因缺失的突变株,并命名为AD1-8-δ.     

双交换同源重组法构建Thermus thermophilus基因无痕敲除突变体

为在噬热栖热菌(Thermusthermophilus)中开収无需筛选标记的基于双交换同源重组的基因无痕敲除手段,以大质粒及染色体上的TTP0042与TTC0340_0341为靶基因,构建含有其两侧同源臂的基因敲除载体幵转化T.thermophilusHB27细胞,将转化混合物涂布于不含筛选物质的培养基上,通过PCR及Southern杂交检验转化子的基因型。结果表明,采用线状的TTP0042基因敲除载体迚行转化,获取表观Δ0042突变体的概率为10–4,而使用闭合环状载体,该概率可达10–3;基因型及表现型分析显示,这些表观Δ0042均为TTP0042无痕敲除型突变体。该敲除手段在染色体上的基因TTC0340_0341中得到验证,从300个单菌落中成功鉴定出了1个Δ0340_0341突变株。     

1株假单胞菌oprD基因缺失和回补载体的构建

[目的]构建假单胞菌毒性基因(oprD)缺失突变株,为进一步探讨其编码的毒力因子功能奠定基础。[方法]利用pEX18Gm质粒作为基因敲除的载体,构建假单胞菌oprD基因重组自杀质粒,通过同源重组并激活自杀基因方式,筛选到目的基因缺失的突变株,再利用pBBR1MCS-2质粒作为目的基因回补的载体,构建回补载体。[结果]同源重组后,经过庆大霉素和氯霉素双抗平板、蔗糖平板筛选和PCR鉴定,成功获得了oprD基因缺失突变株,类似操作获得了回补菌株。[结论]基因缺失突变株的成功构建可为下一步的毒性机理研究奠定基础。     

嗜线虫致病杆菌YL001 cpxR基因敲除突变株的构建及其抑菌活性研究

【目的】通过同源重组技术敲除嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)YL001中cpxR基因,为进一步研究CpxR调节子调控抗菌物质产生的机理奠定基础。【方法】通过融合PCR技术,将cpxR基因的上、下游同源片段及质粒pJCV53上的卡那抗性基因Kmr 3个片段连接,克隆到自杀载体pDM4中,将重组质粒转化到大肠杆菌S17-1λpir中,经接合转移导入嗜线虫致病杆菌内,通过同源重组敲除cpxR基因;采用琼脂扩散法和抑制菌丝生长速率法分别测定突变菌株对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑制作用。【结果】从X.nematophila YL001基因组中成功敲除cpxR基因,得到了ΔcpxR突变菌株;ΔcpxR突变菌株对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑制作用较野生菌株分别提高了1.4和1.7倍。【结论】CpxR负向调控嗜线虫致病杆菌YL001抗菌物质的产生。     

冰岛硫化叶茵β-1,4-内切葡聚糖酶的同源表达、纯化与性质

利用PCR技术从冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)REY15A中分别扩增得到带有和不带有信号肽编码序列的β-1,4-内切葡聚糖酶基因(S.islandicus eng),将其克隆至硫化叶菌表达载体pZC2中,构建重组表达载体pZC2-eng-YS和pZC2-eng-WS,并转化至S.island...     

鮰爱德华菌T6SS eivpP基因缺失突变株的构建

为研究鮰爱德华菌Edwardsiella ictaluriⅥ型分泌系统(T6SS)EivpP与其他分泌蛋白之间的相互作用及其在细菌致病过程中的作用机制,在克隆到eivpP基因上、下游同源臂的基础上,采用融合PCR技术制备了eivpP基因缺失用的融合片段,并成功克隆到自杀质粒pDM4内,再将重组自杀质粒转化到大肠杆菌S17-1λ(pir)中,与鮰爱德华菌野生菌株ATCC33202共培养。经同源重组和蔗糖负筛获得鮰爱德华菌eivpP基因缺失突变阳性克隆,经PCR鉴定结果显示,突变株未检测出eivpP基因,即eivpP基因彻底敲除成功。本试验结果可为研究eivpP基因在鮰爱德华菌致病过程中的作用机制提供数据资料,为鮰爱德华菌弱毒疫苗的研发提供理论依据。     

通过缺失大丽轮枝菌Vdku80构建其高效基因敲除受体菌株

【目的】验证大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）非同源末端连接途径关键基因Vdku80的功能,构建高效的大丽轮枝菌基因敲除受体菌株。【方法】利用常规基因敲除的方法,构建大丽轮枝菌Vdku80基因缺失的突变体菌株ΔVdku80。即将Vdku80的同源重组DNA片段（Vdku80的基因组上下游DNA片段之间连接潮霉素抗性基因）通过农杆菌介导的转化转入大丽轮枝菌,通过同源区段的重组,潮霉素抗性基因便会替换掉野生型Vdku80,从而获得突变体菌株ΔVdku80。对突变体菌株ΔVdku80的生物学表型,即生长速率、产孢量和对棉花的致病性进行测试。分别以大丽轮枝菌野生型菌株和ΔVdku80作为受体菌株,采用上述基因敲除方法测试2个几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI的基因敲除效率。【结果】成功构建了Vdku80缺失突变体ΔVdku80。野生型和突变体菌株ΔVdku80在PDA培养基上的菌落形态相似,且培养8 d后菌落直径无明显差别。野生型和突变体菌株ΔVdku80产孢高峰均出现在摇瓶培养后第5天,且该时期产孢量亦无明显的变化。浓度为0.02%的MMS对野生型和突变体菌株ΔVdku80的生长均有明显的抑制作用,且抑制程度相同。接种野生型和突变体菌株ΔVdku80 4周后,棉株真叶均开始表现出萎蔫、褪绿等发病症状,野生型和突变体菌株ΔVdku80对棉花造成的病情指数分别为54.2±4.9和53.6±5.4,亦无明显变化。因此,突变体菌株ΔVdku80的生长速率、产孢量和致病性相对于野生型菌株均未发生明显变化。使用野生型菌株作为基因敲除的受体菌株,几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI的基因敲除转化子在总转化子中的比例分别为44%和31%;而使用ΔVdku80作为基因敲除的受体菌株,几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI基因敲除转化子在总转化子中的比例分别为94%和87%。【结论】Vdku80缺失的菌株ΔVdku80作为受体菌株可以提高其他基因的基因敲除效率,且Vdku80的缺失对大丽轮枝菌的生长速率、产孢量和致病性均无影响,因此不会干扰其他基因的敲除所带来的表型变化。Vdku80缺失的菌株ΔVdku80可作为高效的大丽轮枝菌基因敲除受体菌株。     

布鲁菌缺失疫苗株M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA的构建及毒力和免疫原性的评估

【目的】利用分子生物学技术,通过同源重组的方法构建了新型的羊种布鲁菌Brucella melitensis减毒活疫苗株,为布鲁菌的防治提供新的选择.【方法】以羊种布鲁菌减毒活疫苗M5株及缺失bp26基因的M5-Δbp26缺失突变株为亲本株,利用电击转化法,将含有znuA基因上下游同源臂的自杀质粒转入到亲本株中,通过同源重组敲除znuA基因.对构建的新型基因缺失株进行生物学特性及毒力的鉴定与分析.【结果和结论】PCR及核苷酸序列测序结果表明,羊种布鲁菌减毒活疫苗znuA单基因缺失株和bp26、znuA双基因缺失株均构建成功,分别将其命名为M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA.与亲本株相比,2种缺失突变株的生物学特性没有显著性差异;体外连续传至20代后,菌落PCR和核苷酸测序结果显示M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA株具有良好的遗传稳定性.小鼠脾脏质量和脾脏菌落数表明,M5-Δbp26-ΔznuA双基因缺失株毒力最弱,单基因缺失株M5-ΔznuA和M5-Δbp26次之.血清中抗体水平的监测显示,znuA基因的缺失对布鲁菌减毒活疫苗诱导机体体液免疫的能力没有影响.获得了免疫原性保持良好而毒力减弱的羊种布鲁菌减毒活疫苗基因突变株M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA.     

泉古菌Sulfolobus islandicus PCNA1的原核表达及其多克隆抗体的制备

泉古菌Sulfolobus islandicus中PCNA有3个同源类似蛋白,本研究选取PCNA1作为研究对象,为获得可溶性表达的PCNA1蛋白,制备多克隆抗体,深入了解PCNA1基因的功能,将PCNA1基因片段克隆到组氨酸标签融合的表达载体pET30a中,利用IPTG诱导,金属螯合亲和层析进行纯化分析表明,融合蛋白大部分可溶。紫外分光光度法测定纯化蛋白的纯度可达90%以上,浓度约为2 mg/mL。免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗血清效价可达1∶10 000以上,Western印迹检测证明抗体特异性良好。     

水稻类病斑突变体LM1基因的图位克隆

类病斑坏死突变体(lesion mimic mutant,LMM)是一类表型类似于植物过敏反应的突变体,对植物抵御外界病原菌浸染的抗病机理研究具有重有意义。以水稻突变体库中类病斑突变体lm1为材料,经图位克隆获得突变基因LM1,同时测定了相关生理指标。分析结果表明:与野生型相比,突变体叶片细胞中的丙二醛(MDA)积累水平明显升高,而叶绿素含量、Fv/Fm却显著低于野生型。遗传分析及精细定位显示,lm1突变体表型受一对隐性核基因LOC_Os12g16720控制,并将该基因命名为LM1,LM1位于水稻第12号染色体短臂的着丝粒附近,是SPL1的等位基因,编码细胞色素P450单加氧酶;LM1突变导致其功能缺失,使植物体内活性氧得到累积,引发细胞程序性死亡并诱导病斑形成。     

水稻穗退化突变体spd11的遗传分析及候选基因鉴定

【目的】对水稻穗退化突变体spd11进行遗传分析及候选基因鉴定,以便了解水稻穗发育的调控机制。【方法】用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)处理粳稻品种中花11的直立密穗突变体dep2,从突变体库中筛选到一份穗退化突变体spd11。观察该突变体表型,并调查其主要农艺性状。由于突变体不能结实,将可分离出spd11突变植株的株系分单株收种、种植,并对后代株系的分离情况进行调查统计,分析该突变性状的遗传行为。将spd11杂合植株与冈46B杂交的F2后代作为定位群体,对spd11突变体进行基因定位,遴选候选基因并进行DNA测序验证;同时,对不同物种中spd11候选基因的同源基因所编码蛋白进行进化树和序列比对分析。【结果】与其对照亲本相比,spd11植株剑叶长度增加23%;穗部一次枝梗明显缩短,且一次枝梗数量减少58%。小穗几乎完全退化为白色絮状物,偶尔可见个别退化不完全的颖花着生,且该颖花仅由一个完全闭合的颖壳组成,不能正常结实。除此以外,spd11的分蘖数及剑叶宽等农艺性状无显著差异。遗传分析表明,在可分离出spd11突变株的后代中,一部分株系无分离,全部植株均为正常株,而另一部分株系有突变株分离,并且正常植株与突变植株分离明显,分离比例经卡方(χ~2)测验符合3﹕1,表明spd11的突变性状由一对隐性核基因控制。利用分子标记将该突变基因定位于第1染色体长臂2个In/Del标记ch1-2295和ch1-2299之间约43.2 kb的区域内,遗传距离分别为0.23 cM和0.46 cM,该区间内共有8个预测基因。测序分析发现,spd11突变体中OsLOG编码区第116位碱基G突变为碱基A,造成编码蛋白的第39位半胱氨酸(C)突变为酪氨酸(Y)。同源蛋白比对和系统进化分析表明LOG蛋白在不同物种中都是高度保守的,并且spd11的突变发生在非常保守的氨基酸上。对已报道的多个log等位突变体的突变位点和突变表型严重程度的比对分析表明,spd11突变位点可能处于OsLOG蛋白功能的关键位点。【结论】SPD11可能是细胞分裂素激活酶基因OsLOG的等位基因,spd11在OsLOG外显子上一个关键位点发生了突变,导致OSLOG蛋白功能受损,使细胞分裂素的活化进程受阻,从而产生了穗退化的突变表型。     

水稻白化转绿基因gra75的精细定位和生理特性分析

【目的】对水稻白化转绿突变体gra75（green-revertible albino 75）进行基因定位,并对其生理特性进行分析。【方法】利用EMS处理粳稻品种日本晴（Nipponbare）的迟熟突变体10079,从后代中获得一个白化转绿突变体gra75。对该突变体的形态特征、生理特性及主要农艺性状进行观察与分析,并应用（gra75/浙辐802）的F2群体精细定位目标基因,遴选候选基因。【结果】gra75突变体叶片从第4叶开始表现出白化性状,从第8叶开始恢复到正常绿色,之前白化的叶片也会逐渐转为淡绿色,成熟期主要农艺性状与野生型没有明显的差异。突变体苗期白化叶的叶绿素和类胡萝卜素含量显著下降,叶肉细胞中叶绿体数目减少,并且叶绿体形态发育不饱满,类囊体片层、基粒和淀粉粒数目减少。遗传分析表明该性状是由1对隐性核基因控制,该基因位于第6染色体短臂InDel标记HC1和HC2之间,遗传距离分别为0.06 cM和0.6 cM,物理距离为120 kb。对该区域候选基因分析和测序,发现LOC_Os06g07210基因（编码核糖核苷酸还原酶大亚基RNRL1）在编码区第716位碱基C突变成T,导致其编码蛋白第239位的丙氨酸（Ala）突变成缬氨酸（Val）。【结论】gra75突变体基因与已报道的水稻淡绿叶基因V3（Virescent3）为等位基因,但gra75突变体苗期的白化转绿性状能稳定表达,且白化表型对后期的主要农艺性状影响不显著,故该突变基因作为叶色标记基因在水稻遗传育种中具有较大的应用价值。     

一个水稻卷叶突变体zw209的遗传分析与精细定位

叶片是植物光合作用的主要场所,优良的叶片形态有利于塑造理想株型,提高光合效率。为了研究叶片形态建成的分子机制,从水稻T-DNA突变体库中筛选到1个叶片极度卷曲的突变体zw209,突变体有2个显著特征:1突变体泡状细胞数量和面积均变小;2突变体的叶绿素含量较高,具有较高的光合效率。遗传分析表明,zw209的突变性状由一对隐性核基因控制。通过图位克隆,将基因(ZW209)精细定位到9号染色体长臂上,位于In Del136和In Del140之间的92.3 kb区域内。在这个区域内,尚未见报告已克隆的卷叶基因,很可能是一个新的基因位点。上述结果明确了突变体的表型特征及遗传规律,为克隆ZW209基因和揭示其作用机理奠定基础。     

水稻雄性不育突变体oss125的遗传分析及基因定位

【目的】对水稻甲磺酸乙酯(EMS)诱变产生的雄性不育突变体oss125进行遗传分析,并利用改进的MutMap方法克隆突变基因,为进一步探讨该基因功能及在农业生产上的应用奠定基础。【方法】用化学诱变剂EMS处理籼稻品种黄华占,通过观察表型,从突变体库中筛选出一株雄性不育突变体,记为oss125。将oss125与野生型黄华占进行杂交,调查F1的育性和F2群体的育性分离情况。随机挑取F2中30个雄性不育表型的株系,提取DNA后等量混合形成DNA池,采用IlluminaHiseq2000进行高通量测序。利用改进的MutMap方法分析测序数据获得候选突变位点,并进一步采用高分辨率溶解(HRM)方法确定突变基因与不育表型的连锁关系。对候选基因进行序列分析,同时利用RT-PCR分析该候选基因的表达模式。【结果】oss125突变体在营养生长期表型与野生型黄华占相同,进入生殖生长后,花粉经1%I2-KI染色显示,以碘败为主(85%),15%能正常染色,但植株表现为完全雄性不育。oss125作为花粉受体与野生型黄华占杂交能够正常结实,F1表现为可育,F2群体的可育植株与不育植株分离比为3﹕1,表明雄性不育表型由1对隐性核基因控制。利用改进的MutMap方法分析突变体测序数据,得到4个候选位点,其中3个位于基因间区,1个位于OsRPA1a的第二个外显子区,编码区A663位点突变为C,导致其编码的氨基酸从谷氨酰胺(Q)突变成脯氨酸(P),HRM分析显示该突变与雄性不育性状紧密连锁。【结论】OsRPA1a是控制突变体oss125表型的基因,OsRPA1a编码区A663位点突变为C,导致花粉发育异常,植株表现为雄性全不育,但雌性发育正常。OsRPA1a参与水稻雄配子和雌配子发育过程,为水稻减数分裂和体细胞DNA修复所必需。前人报道OsRPA1a的T-DNA插入突变体表现为雌性全不育而雄性半不育,但oss125突变体表现为雄性全不育而雌性可育,说明该基因控制雄性发育和雌性发育的功能可能分布在蛋白质的不同区域,oss125突变体中的OsRPA1a点突变可能坐落于雄性发育功能区,不影响雌性发育功能。     

油菜乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗性突变体M9的遗传和基因克隆

 【目的】分离和鉴定自然突变的油菜乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗性突变体M9抗性基因,阐明抗性产生的分子基础。【方法】通过配置杂交组合研究其遗传规律,应用同源序列法克隆油菜ALS家族基因,采用杂交转育和小孢子培养技术将抗性基因转育到陆奥-五十铃细胞质雄性不育（MICMS）恢复系中,进行PCR鉴定。【结果】该突变体抗性由1个显性核基因控制。克隆获得BnALS1—BnALS3,核酸序列比对发现,M9抗性是由BnALS1的点突变使蛋白序列的第638位丝氨酸（AGT）残基被天冬酰胺酸（AAT）替代所致,将此抗性基因命名为BnALS1R。抗性基因BnALS1R转育到MICMS恢复系中的PCR检测表明,所有抗除草剂的恢复系都携带有BnALS1R。【结论】突变体M9抗性由1个显性核基因控制,BnALS1第638位丝氨酸突变成天冬酰胺酸是抗性产生的分子基础。     

大豆低植酸突变体Gm-lpa-ZC-2的精细定位

降低大豆植酸含量对于改善大豆营养品质极其重要。通过诱变的方法筛选到大豆低植酸突变体Gm-lpa-ZC-2,经典遗传学分析表明:其突变性状由隐性单基因所控制,并被定位在大豆连锁群B2上。试验在大豆低植酸突变体Gm-lpa-ZC-2初步定位的基础上,通过构建较大的遗传群体,运用生物信息学发展新的连锁标记,结合大豆基因组学和传统定位的方法,进行突变基因的精确定位。结果表明:位于大豆B2连锁群上的Gm-lpa-ZC-2突变基因,与连锁标记Satt168和Satt416的遗传距离远大于初步定位的结果,为18.2 cM;在此基础上,利用大豆基因组序列信息,在Satt168标记的上游序列与目的基因之间的染色体片段,4 900~8 200 kb的区域中,发掘到9对在遗传群体亲本间具有多态性的SSR引物;其中SSR位点psm lpa-224,psmlpa-225和psm lpa-226与目的基因的距离仅为0.8 cM,实现了突变基因的精细定位。     

卫星搭载获得玉米基因雄性不育的初步鉴定

1996年利用返回式实验卫星搭载玉米种子 ,从中选育出一份雄性不育突变体 ,对该不育材料通过多年、多代、多点的种植并结合与对照的同步观察、广泛测交鉴定 ,研究结果表明 ,不育材料花粉败育彻底 ,为无花粉型雄性不育 ,不育性状表现稳定 ,呈现出由隐性单基因控制的核不育的遗传特点 ,该不育材料对株高有一定的矮化作用 ,雄性不育突变体的出现与卫星搭载有关 ,为基因突变的结果