绵羊繁殖轴相关组织TPH1和TPH2基因表达分析及TPH2基因多态性与产羔数的关系

为探讨TPH1和TPH2基因在绵羊不同繁殖状态下的表达差异及TPH2基因多态性与小尾寒羊产羔数的关系,利用实时荧光定量PCR技术检测该2个基因在不同繁殖状态下成年苏尼特羊(短光照3只,长光照3只)和小尾寒羊(卵泡期3只,黄体期3只)的大脑、小脑、下丘脑、松果体、垂体、卵巢、输卵管、子宫、肾脏和肾上腺等10种组织中的相对表达量;同时采用Sequenom MassARRAY?SNP技术检测TPH2基因单核苷酸多态位点SNP在常年发情绵羊品种(小尾寒羊、湖羊和策勒黑羊)和季节性发情绵羊品种(滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊)的多态性,并将基因多态性与小尾寒羊产羔数进行关联分析。结果表明:该2个基因在2个绵羊品种各组织广泛表达,TPH1基因在苏尼特羊下丘脑和松果体中短光照表达量极显著高于长光照(P0.01),在苏尼特羊垂体中短光照表达量显著高于长光照(P0.05),在小尾寒羊垂体和卵巢中卵泡期显著低于黄体期(P0.05);TPH2基因在苏尼特羊卵巢组织长光照下的表达量显著高于短光照(P0.05),TPH2基因在小尾寒羊下丘脑组织中卵泡期的表达量极显著高于黄体期(P0.01)。小尾寒羊中TPH2基因g.107854166CT和g.1078541669CT 2个SNP位点关联分析表明,该2个位点与季节性发情性状和小尾寒羊第1、2以及第3胎产羔数均无显著关联(P0.05)。综上,TPH1和TPH2基因在苏尼特羊绵羊下丘脑和松果体中呈季节性光照节律差异表达,暗示其可能参与季节性发情上游基因的调控,而TPH2基因可能参与调控小尾寒羊下丘脑中激素分泌和卵巢发育,但g.107854166CT和g.1078541669CT不是调控季节性发情和小尾寒羊产羔数的关键位点。     

绵羊IRS1基因CDS区克隆、序列分析及其组织表达研究

【目的】克隆绵羊IRS1基因CDS区,并研究其序列特征和组织表达。【方法】选择健康、3岁、处于第4胎的泌乳高峰期(产后第3周)小尾寒羊和空怀期小尾寒羊母羊各3只作为研究对象,利用克隆测序技术获得绵羊IRS1基因的CDS序列,用生物信息学分析其编码的氨基酸序列特征,用RT-qPCR检测IRS1基因在肝脏、心脏、背最长肌、脾脏、肺脏、卵巢、肾脏和乳腺组织中的表达模式。【结果】绵羊IRS1基因的CDS全长为3 708 bp,编码1 235个氨基酸,蛋白分子量为130 462.80,等电点为8.99,不稳定指数为73.55,预测该蛋白为不稳定、碱性亲水性蛋白。蛋白互作分析表明,绵羊IRS1可以与胰岛素样生长因子1受体(IGFR1)、磷酸肌醇-3-激酶调节亚基1(PIK3R1)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、丝裂原活化蛋白激酶10(MAPK10)和生长因子受体结合蛋白2(GRB2)相互作用,KEGG分析发现IRS1主要参与了PI3K/AKT和MAPK 2个信号通路。RT-qPCR分析表明,IRS1基因在小尾寒羊各组织中均表达,并且表现出明显的组织特异性,它在背最长肌中的表达量最高,其次是肝脏和心脏,在肺脏、肾脏、卵巢和乳腺组织中表达量较低,在脾脏中弱表达。同时,绵羊IRS1基因也表现出明显的时序表达性,在泌乳高峰期小尾寒羊中,IRS1基因在乳腺组织中的表达量是空怀期乳腺组织中表达量的2.77倍(P0.05)。但在除乳腺和脾脏外的其他6个组织中,该基因在空怀期中的表达量均显著高于泌乳高峰期中的表达量(P0.05)。【结论】克隆得到绵羊IRS1基因完整的CDS序列,它全长3 708 bp,编码1 235个氨基酸。IRS1在小尾寒羊各组织中广泛表达,并且表达出明显的组织特异性和时序特异性。     

绵羊BMPR2基因组织表达及其多态性与产羔数的相关性分析

[目的]为探讨骨形态发生蛋白2型受体(bone morphogenetic protein receptor 2,BMPR2)基因在卵泡期和黄体期及单羔和多羔小尾寒羊组织表达特征及其多态性与小尾寒羊产羔数之间的关系.[方法]采用qPCR技术检测BMPR2基因在小尾寒羊14种组织中的表达模式.同时,使用Sequenom MassARRAY?SNP技术对BMPR2基因3个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点在6个绵羊品种中的多态性进行检测,并与小尾寒羊产羔数进行关联.[结果]BMPR2在14种组织中呈广谱表达,其中在肺脏、大脑、肝脏以及下丘脑组织高表达;BMPR2在卵泡期多羔组下丘脑-垂体-卵巢组织中的表达量均高于单羔组.BMPR2基因g.203707935A>G和g.203708072T>C位点在单、多羔绵羊品种间的等位基因频率差异显著(P<0.05).通过相关分析发现,g.203708352A>G位点与小尾寒羊三胎产羔数显著相关(P<0.05),野生型产羔数显著高于杂合型.通过对该位点不同基因型与小尾寒羊FecB基因型复合分析发现,3种复合基因型与小尾寒羊三胎产羔数显著关联(P<0.05),AA-GG基因型产羔数显著高于AA-AG和AA-AA基因型,推测该位点突变可能削弱了FecB基因信号强度,导致产羔数下降.[结论]BMPR2基因g.203708352A>G位点与小尾寒羊产羔数呈显著负相关,为小尾寒羊产羔性状选育提供了参考依据.     

新吉细毛羊KAP1.4基因多态性分析

为了进一步了解KAP1.4基因在新吉细毛羊群体中的多态性,采用DNA测序法对新吉细毛羊和小尾寒羊基因组编码区进行测序,找出基因突变位点,然后采用PCR-SSCP技术对新吉细毛羊KAP1.4基因编码区序列进行多态性分析。结果表明:与小尾寒羊基因组比较,新吉细毛羊KAP1.4基因码区有4处突变点,分别在136bp处发生C→T的突变,在199bp处发生T→C的突变,在310bp处发生T→G的突变以及在322bp处发生A→T的突变。而且新吉细毛羊在KAP1.4基因座上检测到AA、AB、AC基因型,以A等位基因为主。因此,KAP1.4基因在新吉细毛羊群体中存在多态性,并且以AC型为主。     

缺氧诱导因子和促红细胞生成素及其受体基因在绵羊各组织中表达量

【目的】研究缺氧诱导因子(HIF)及其下游靶基因促红细胞生成素(EPO)及其受体(EPOR)在绵羊正常生理状况下各组织的表达,为靶向调控或缓解绵羊缺氧应激的研究提供组织学依据。【方法】采用实时荧光定量PCR方法,检测4只新疆细毛羊14种组织中HIF、EPO和EPOR基因的相对表达量。【结果】HIF-1α和HIF-2α基因均在绵羊肺组织的相对表达量最高,且极显著高于其它组织(P<0.01);在肺脏HIF-2α基因的表达量约为HIF-1α表达量的5.2倍。EPO基因在绵羊肾脏的相对表达量最高且显著高于垂体、结肠、脾脏、盲肠、肝脏、肾上腺、瘤胃、下丘脑以及心脏(P<0.05)。EPOR基因在肺脏的表达量最高,肺脏和睾丸的相对表达量显著高于脾脏、下丘脑、肾脏、心脏等组织(P<0.05)。【结论】HIF-1α、HIF-2α和EPO及其受体基因在绵羊的肺部或肾脏的高表达,可能是绵羊缺氧应激感受及其调控的重要器官。     

绵羊DIO2基因组织表达及其多态性与产羔数关联分析

[目的]本试验旨在探明Ⅱ型脱碘酶(DIO2)基因在常年发情的小尾寒羊和季节性发情的草地型藏羊中的表达模式,并探讨其多态性与绵羊季节性繁殖和产羔数之间的关系。[方法]通过荧光定量PCR(qPCR)检测DIO2基因在不同品种绵羊的10种组织中的表达,同时利用SNP技术对3个常年发情绵羊品种(小尾寒羊、策勒黑羊和湖羊)和3个季节性发情绵羊品种(滩羊、苏尼特羊和草地型藏羊)的DIO2基因2个SNP位点多态性进行检测,并与小尾寒羊产羔数进行关联分析。[结果]qPCR结果显示,DIO2基因在小尾寒羊和草地型藏羊各组织中广泛表达,其中草地型藏羊下丘脑、垂体、卵巢、子宫和输卵管组织中的表达量显著高于小尾寒羊(P0.05)。基因分型结果表明,绵羊DIO2基因g.88484603GC位点基因型频率和等位基因频率在季节性发情和常年发情绵羊品种间差异均达到极显著水平(P0.01)。群体遗传学分析表明,绵羊DIO2基因g.88484594TC位点在滩羊和策勒黑羊中表现为中度多态(0.25PIC0.5),在其他4个群体中均表现为低度多态(PIC0.25);g.88484603GC位点在这6个绵羊群体中均表现为中度多态(0.25PIC0.5)。卡方适合性检验结果表明,g.88484594TC位点在这6个群体中均处于哈代温伯格不平衡状态(P0.05),g.88484603GC位点在这6个绵羊品种中均处于哈代温伯格平衡状态(P0.05)。生物信息学分析表明,g.88484603GC位点突变前、后的mRNA二级结构发生了改变,而且其最小结构自由能降低,结构稳定性增强,蛋白质二级结构没有发生变化,但三级结构有一些变化。关联分析表明,这2个SNP位点与小尾寒羊前3胎产羔数均无显著关联(P0.05)。[结论]DIO2基因与绵羊的季节性繁殖密切相关,其g.88484603GC位点对绵羊季节性繁殖性状有一定的调控作用。     

绵羊KRTAP20-1基因变异及其在不同组织的表达特征

【目的】研究角蛋白关联蛋白(keratin-associated proteins,KAPs)编码基因的遗传变异对绒毛性状的影响,以丰富绵羊功能基因组学并开发基因标记。【方法】采用PCR-SSCP和DNA测序技术,检测KAP20-1编码基因(KRTAP20-1)在甘肃高山细毛羊(细毛羊)、青海半细毛羊(半细毛羊)和藏绵羊(粗毛羊)3个群体中的变异情况;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测KRTAP20-1基因在甘肃高山细毛羊、小尾寒羊(粗毛羊)成年母羊和羔羊不同组织中的表达情况。【结果】3个绵羊群体KRTAP20-1基因共检测到4个SNPs,其中3个为非同义突变导致氨基酸的改变(P.Gly10Ser、P.Tyr29Phe和P.Ser61Gly),1个为同义突变。等位基因A在3个绵羊群体中均为优势等位基因,其余3个等位基因在不同绵羊群体中分布差异较大。甘肃高山细毛羊KRTAP20-1基因的遗传杂合度、有效等位基因数和多态信息含量均高于其他2个群体。KRTAP20-1基因只在绵羊皮肤中表达,在其他组织中均无表达;在小尾寒羊和甘肃高山细毛羊2个群体中,羔羊皮肤组织中KRTAP20-1表达量均高于母羊,且在小尾寒羊皮肤组织中的表达量高于同期甘肃高山细毛羊,即表现出明显的群体差异性和时空差异性。【结论】绵羊KRTAP20-1基因在不同用途毛用绵羊中的等位基因分布差异及组织表达的种群特异性和时空特异性提示,该基因对羊毛相关性状的形成和表型均有影响。     

绵羊Izumo1基因多态性及其与产羔数关联分析

为研究Izumo1基因多态性及与产羔数关系,本研究利用PCR和直接测序法对小尾寒羊和苏尼特羊的Izumo1基因DNA序列进行扩增、测序和BLAST分析,并和本课题组前期绵羊重测序数据进行比对,筛选出Izumo1基因SNP位点。同时,采用Sequenom MassARRAY~?技术进行基因分型,并对其SNP位点的基因型和等位基因频率在各群体中的分布进行研究。结果表明:小尾寒羊Izumo1基因DNA全长序列3 385 bp,苏尼特羊Izumo1基因DNA全长序列3 382 bp;筛选出8个Izumo1基因SNP位点,经过初步筛选,将在小尾寒羊、苏尼特羊、滩羊、萨福克羊、杜泊羊、草原藏羊这6个绵羊品种中位点分布没有差异的SNP位点排除,最终筛选获得的g.54412135AG和g.54412107CA 2个位点。Izumo1基因g.54412135AG位点在多羔和单羔绵羊品种中存在GG、GA和AA 3种基因型,G基因为优势等位基因;g.54412107CA在多羔品种中存在CC和CA 2种基因型,而在单羔品种中存在CC、CA和AA 3种基因型,C基因为优势等位基因,其基因型频率和基因频率在单、多羔绵羊群体间的分布差异均极显著(P0.01);群体遗传学分析得出g.54412135AG多态位点在6个品种中的多态信息含量(PIC)都属于低度多态(PIC0.25);g.54412107CA多态位点在杜泊羊中属于中度多态(0.25PIC0.5),在其他5个品种中都属于低度多态(PIC0.25),然而,关联分析发现Izumo1基因g.54412135AG和g.54412107CA位点的不同基因型与小尾寒羊不同胎次产羔数之间不存在显著关联(P0.05)。     

迪庆藏猪ADFP基因多态性及其组织表达特征

【目的】从分子遗传学角度分析不同基因型迪庆藏猪群体不同组织中ADFP基因的表达差异,为迪庆藏猪的选育工作提供参考依据。【方法】利用PCR扩增测序方法对113头迪庆藏猪ADFP基因进行扩增测序,利用DNA-STAR 5.0对序列进行比对分析及多态性位点（SNPs）检测;同时利用实时荧光定量PCR方法对迪庆藏猪不同组织中ADFP基因相对表达量进行检测,并运用SPSS 20.0分析ADFP基因多态性对迪庆藏猪群体不同组织中ADFP基因表达水平的影响。【结果】在迪庆藏猪ADFP基因外显子6上发现3个SNPs,分别为SNP1（C→T）、SNP2（C→T）和SNP3（T→ C）,其中SNP1和SNP2位点属于低度多态（PIC/He<0.25）,SNP3位点属于中度多态（0.25He<0.5）。迪庆藏猪不同组织中ADFP基因相对表达量存在显著差异（P<0.05,下同）,皮下脂肪中相对表达量最高,其次为肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、腿肌和背肌,心脏中相对表达量最少;另外,ADFP基因SNPs不同基因型迪庆藏猪群体中各组织的相对表达量也存在显著差异,尤其在SNP2位点杂合基因型群体肾脏中相对表达量显著高于纯合基因型群体肾脏中相对表达量,表明ADFP基因SNPs变异对迪庆藏猪组织中ADFP基因表达具有影响。【结论】ADFP基因SNPs变异对迪庆藏猪组织中ADFP基因会产生差异表达,进而影响机体脂肪沉积,ADFP基因可作为迪庆藏猪肌内脂肪沉积的候选基因。     

中国美利奴羊（新疆军垦型）核因子I/B基因的克隆及表达

【目的】研究绵羊核因子I/B （nuclear factor I/B,NFIB）基因的组织表达规律,并克隆中国美利奴羊（新疆军垦型）NFIB基因的全长编码区（coding sequence,CDS区）序列。【方法】采用半定量RT-PCR的方法分析NFIB基因的组织表达谱和皮肤表达特性,利用RT-PCR扩增绵羊NFIB基因的全长CDS区、克隆测序,并进行序列分析。【结果】①NFIB基因在绵羊多种内脏器官和皮肤组织中都有着不同程度的表达,且在皮肤组织中表达较高;NFIB基因在超细毛品系体表不同部位皮肤组织中的表达水平不存在显著性差异（P＞0.05）;同时在6个不同品系/品种绵羊体侧部皮肤组织中的表达水平也不存在显著性差异（P＞0.05）;超细毛品系绵羊皮肤组织NFIB基因的表达水平在不同季节存在显著性差异（P＜0.05）;②绵羊NFIB基因编码区至少存在3种剪接形式,其开放阅读框（open reading frame,ORF）的长度依次为1 263、1 128 和1 038 bp,分别编码420、375和345个氨基酸。【结论】中国美利奴羊（新疆军垦型）NFIB基因在皮肤组织中的表达量较高,其在超细毛品系羊体侧部皮肤组织中的表达量具有显著的季节性差异;绵羊NFIB基因至少可以编码3种不同的蛋白剪接体（protein isoform）。