用反义RNA技术创造高直链淀粉玉米材料

 【目的】利用反义RNA技术调控玉米淀粉的生物合成过程,创造高直链淀粉玉米材料。【方法】克隆玉米淀粉分支酶(sbe2a)基因片段,以载体pWGLL为基础,构建高效反义表达载体,通过花粉管通道法将其导入玉米自交系铁7922中。【结果】获得了4株转基因株系,GFP表达检测、PCR扩增和Southern杂交结果表明,目的基因已整合到基因组中,且能够遗传。对4株转基因植株进行RT-PCR和淀粉分支酶活性检测,结果表明转反义sbe2a玉米淀粉分子酶基因的转录受到了明显抑制,淀粉分支酶活性明显低于野生型,相差最多的降低79.4%;直链淀粉含量也发生明显的变化,最高的提高了84.3%,且总淀粉含量与对照之间基本没有差异。【结论】采用反义RNA技术通过沉默内源sbe2a,可获得高直链淀粉含量的玉米材料。     

高直链淀粉玉米和糯玉米籽粒发育过程中与淀粉合成相关酶活性的比较

为深入了解高直链淀粉玉米籽粒发育时期直链淀粉积累的理化机制,选取1个糯玉米自交系为对照,分析和比较糯玉米和3个高直链淀粉玉米自交系在籽粒发育时期淀粉合成相关酶活性的变化。结果表明,籽粒发育过程中蔗糖合成酶(SS)、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸(ADPGPPase)、可溶性淀粉合成酶(SSS)、束缚态淀粉合成酶(GBSS)、淀粉分支酶(SBE)、淀粉去分支酶(DBE)在糯玉米和高直链淀粉玉米中均呈单峰变化趋势,但是不同酶达到峰值的时间不同。SS和ADPGPPase为淀粉合成提供合成底物;高直链淀粉玉米中直链淀粉大量积累可能是SSS、GBSS、SBE这3种酶综合作用的结果,而DBE在淀粉合成过程中的作用可能是对支链淀粉精细结构的修饰,对淀粉积累没有简单直接的关联。     

玉米淀粉分支酶sbe Ⅱ b基因启动子的克隆与特异表达

[目的]构建玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。[方法]LA-PCR扩增了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子序列,并克隆到pMD18-TVector上。再将启动子克隆到pBI121载体上,构建植物表达载体pBI121-sbeⅡb。把GUS基因连到pBI121-sbeⅡb上构建pSBE-GUS后利用农杆菌介导法转化烟草。分别进行PCR和Southern杂交检测,并对经基因枪轰击和农杆菌介导的烟草种子、根、茎及叶进行GUS组织化学分析和荧光检测。[结果]测序结果与GenBank中发表的玉米sbeⅡb基因启动子同源性达98.52%。共培养和筛选培养后获得4株转pSBE-GUS植株,叶片仅有少量蓝斑出现,而根和茎部未见蓝斑,但烟草种子有大量蓝斑显出,初步推断sbeⅡb基因启动子能启动GUS在种子中特异表达。[结论]成功构建了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。     

玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子的克隆与特异表达（英文）

[目的]构建玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。[方法]LA-PCR扩增了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子序列,并克隆到pMD18-TVector上。再将启动子克隆到pBI121载体上,构建植物表达载体pBI121-sbeⅡb。把GUS基因连到pBI121-sbeⅡb上构建pSBE-GUS后利用农杆菌介导法转化烟草。分别进行PCR和Southern杂交检测,并对经基因枪轰击和农杆菌介导的烟草种子、根、茎及叶进行GUS组织化学分析和荧光检测。[结果]测序结果与GenBank中发表的玉米sbeⅡb基因启动子同源性达98.52%。共培养和筛选培养后获得4株转pSBE-GUS植株,叶片仅有少量蓝斑出现,而根和茎部未见蓝斑,但烟草种子有大量蓝斑显出,初步推断sbeⅡb基因启动子能启动GUS在种子中特异表达。[结论]成功构建了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。     

粳稻杂种后代胚乳淀粉分支酶基因表达特性分析

选用籽粒直链淀粉含量有显著差异的亲本和杂种后代,分析籽粒灌浆过程中直链淀粉积累和淀粉分支酶活性以及淀粉分支酶基因mRNA表达量等变化特点。结果表明,直链淀粉含量高的亲本及后代在灌浆过程中合成和积累的直链淀粉量显著高于直链淀粉含量低的亲本及后代;直链淀粉含量高的亲本及后代的淀粉分支酶活性均比直链淀粉含量低的亲本及后代高,灌浆不同时期的籽粒直链淀粉含量与淀粉分支酶活性间均呈正相关;亲本及杂种后代籽粒OsSBE1和OsSBE3的mRNA表达量随灌浆进程逐渐增加,达到峰值后又逐渐下降,呈单峰曲线变化,其表达量峰值都出现在抽穗后17 d,在灌浆过程中胚乳OsSBE4基因的mRNA表达量相对比较小;杂种后代籽粒淀粉分支酶基因mRNA表达量随籽粒直链淀粉含量的变化发生变化,且能超亲表达;直链淀粉含量和淀粉分支酶活性高的基因型其SBE1和SBE3的mRNA表达量也高,低的基因型其mRNA表达量也低,SBE4的表达量与此相反。     

水稻OsSBEIIb基因的克隆和时空表达特征及SNP位点多态性

水稻淀粉分支酶(OsSBEIIb)对水稻支链淀粉的合成至关重要,而水稻支链淀粉的含量与水稻支链淀粉和抗性淀粉的含量密切相关.为了明确OsSBEIIb基因在水稻淀粉合成中的作用,通过PCR技术扩增获得了湘早籼2号水稻的OsSBEIIb基因cDNA编码区序列.生物信息学分析表明,OsSBEIIb基因具有一个编码825个氨基...     

山药块茎膨大期淀粉合成关键酶活性及 调控基因的表达分析

为了探究山药块茎膨大期淀粉合成、积累与淀粉合成关键酶及其相关调控基因表达的关系,以淀粉含量差异显著的河北安平白山药(Dioscorea opposita Thunb.)和毕克齐长山药(Dioscorea opposita Thunb.)为试验材料,测定块茎膨大期块茎中淀粉、支链淀粉、直链淀粉含量及比例(支链淀粉/直链淀粉)和淀粉合成关键酶(AMY、ADPGase、SPS、SSS)活性,并采用实时荧光定量PCR对块茎中淀粉合成关键酶基因(SPS 1、Isoamylase 3、PFK 3、Starch synthase 3)表达进行分析。结果表明,AMY、ADPGase及SSS对淀粉的合成起关键作用,ADPGase可能是直链淀粉合成的关键酶,SPS和AMY可能对支链淀粉合成起作用。PFK 3基因在山药淀粉合成过程中起重要作用,且PFK 3基因和Starch synthase 3基因可能对直链淀粉的合成起重要作用。     

转淀粉分支酶反义基因（sbe2b）玉米直链淀粉含量的变异分析

以利用花粉管通道法转化玉米淀粉分支酶基因的反义表达载体的后代中的PCR阳性植株为试材,分析其直链淀粉含量的变异.结果表明:转基因玉米的淀粉分支酶活性有明显的下降,种子的直链淀粉含量比未转化对照有显著提高,T1代种子的直链淀粉含量提高幅度为2.2%～24.9%,最高含量达到了59.4%,表明外源基因的导入有效地抑制了淀粉分支酶基因的表达.转化的淀粉分支酶反义基因能稳定传递,T2代大部分株系的分离比率大致呈3:1,符合孟德尔分离规律;部分株系的分离比率接近于15:1,但卡平方测验不显著.     

玉米淀粉分支酶基因片段的克隆和植物表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了玉米淀粉分支酶的cDNA基因片段，并将其克隆到pMD18-Tvector载体上，对重组子进行了PCR检测和限制性内切酶分析，测定了DNA全序列。结果表明：克隆片段全长为935bp。将反义 正义基因片段插入到pB1121 35S启动子下，构建成表达质粒pCJSBE2b。通过花粉管通道法将其导入玉米自交系，获得了转基因植株。     

高直链玉米淀粉的理化特性研究

【目的】研究高直链玉米淀粉的理化特性,为高直链淀粉玉米新品种的培育及高直链玉米淀粉的产业化开发利用提供参考。【方法】以源自13份高直链淀粉玉米自交系和1份普通玉米自交系的籽粒为材料,研究了高直链玉米淀粉和普通玉米淀粉的淀粉粒表型特征、热特性、糊化特性、溶解度和膨胀势的差异。【结果】普通玉米淀粉中直链淀粉含量为27.72%;高直链玉米淀粉中直链淀粉含量为44.22%~78.81%,可分为Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ4个级别。SEM结果显示,随着直链淀粉含量的增加,A型淀粉粒形态由饱满光滑、有蜡质光泽的球体或多面体变为皱缩无光泽的不规则多面体,B型淀粉粒则由饱满光滑的小球体逐渐变为无蜡质光泽的椭圆形,直至扭曲成不规则颗粒。随着直链淀粉含量的升高,初始温度(To)、峰值温度(Tp)、最终温度(Tc)、温变范围(To-Tc)逐渐升高,焓变(ΔH)则逐渐降低。普通玉米淀粉有明显的粘度峰,糊化曲线呈现出典型的"双峰"特征,高直链玉米淀粉的粘度峰随直链淀粉含量的增加逐渐消失,曲线呈"S"型。普通玉米淀粉和高直链玉米淀粉的溶解曲线和膨胀曲线都显示了相同的趋势,但溶解度和膨胀势随直链淀粉含量的增加而显著降低。【结论】与普通玉米淀粉相比,高直链玉米淀粉在淀粉粒形态、热特性、糊化特性、溶解度和膨胀势等方面都表现出了不同程度的差异,且直链淀粉含量越高差异越大。     

橡实与木薯、玉米淀粉理化性质的对比研究

[目的]研究橡实淀粉的组成成分、结构及理化性质。[方法]采用理化检测方法对橡实淀粉的性质进行了研究,较系统地考察了橡实淀粉的组成、颗粒、淀粉糊等方面的性质。[结果]橡实淀粉中淀粉含量为59.61%,直链淀粉的含量为31.40%;其颗粒相对玉米淀粉颗粒较小,与木薯淀粉相近;晶体结构为C型;橡实淀粉的溶解度、膨胀度比玉米淀粉低,与木薯淀粉相近;橡实淀粉糊凝沉速度居于玉米淀粉和木薯淀粉之间。DSC分析显示,橡实淀粉的糊化温度(61.72℃)较木薯淀粉(70.22℃)和玉米淀粉(66.78℃)低,这说明橡实淀粉较玉米淀粉和木薯淀粉易糊化。[结论]研究可为橡实资源的开发利用提供基础数据。     

水稻大粒种质淀粉积累特性研究（摘要）（英文）

[目的]为合理利用水稻大粒种质提供理论依据。[方法]以水稻大粒种质31C122、31C125（千粒重近50 g）和常规水稻品种吉玉粳、赋育333为材料,对其籽粒中糖分和淀粉的积累过程进行对比研究。总糖含量采用苯酚-硫酸法测定,用不同浓度的葡萄糖标准溶液绘制标准曲线。总淀粉含量采用硫酸-蒽酮法测定[10],用不同浓度的葡萄糖标准溶液绘制标准曲线。直链淀粉含量采用农业部颁布的《NY147-88》标准法测定。支链淀粉含量=总淀粉含量-直链淀粉含量。以淀粉积累量W为依变数,开花后天数t（开花日为0）为自变数,应用Logistic方程对淀粉积累过程进行拟合。[结果]供试材料弱势粒总糖含量高于强势粒,且强势粒总糖含量峰值均出现在花后10 d,大粒种质总糖含量低于常规品种;强势粒总淀粉含量高于弱势粒,常规品种总淀粉含量高于大粒种质;供试材料各粒位支链淀粉含量高于直链淀粉,大粒种质直链淀粉含量低于常规品种;大粒种质强势粒总淀粉积累高峰较常规品种强势粒有所推迟,弱势粒总淀粉积累高峰较常规品种有所提前;大粒种质强势粒总淀粉活跃积累期长于常规品种强势粒。[结论]大粒种质的品质好于常规水稻品种。     

高直链玉米抗性淀粉制备工艺的优化研究

[目的]优化高直链玉米抗性淀粉制备工艺。[方法]以发酵所得直链淀粉含量为58％的淀粉为原料，采用压热方法通过单因素试验及4因素3水平的正交试验确定制备抗性淀粉的最佳工艺路线及工艺参数。[结果]制备抗性淀粉的最佳工艺路线及工艺参数为：压热温度135℃，压热时间40min，水分含量70％，储藏温度4℃，压热冷却循环3次。通过验证性试验验证在此条件下抗性淀粉的得率达到42．89％。[结论]为制备抗性淀粉提供了技术支撑。     

婴幼儿米粉复合酶解技术研究

[目的]研究生物酶解法在婴幼儿米粉加工过程中的应用,以提高直链淀粉含量而抑制淀粉回生。[方法]选取适宜的复合酶对米粉进行酶解,通过酶种类的筛选、复合酶配比优化,酶解pH、酶作用温度、酶添加量及酶作用时间等条件单因素分析及Box-Benhnken试验设计,优化得到了复合酶解技术延缓米粉回生过程的工艺条件。[结果]考虑实际操作,得到最优酶解条件如下:酶解pH 5.9,酶解温度56℃,复合酶总添加量0.70μg/g,酶解时间120 min。该条件下得到实际的直链淀粉含量可达26.28%。经方差及回归方程分析得到各个条件及它们之间的交互作用对于米粉直链淀粉含量影响显著。[结论]通过该试验分析法优化得到的复合酶解技术可显著抑制淀粉回生,所得到的工艺条件可用于指导工业生产。     

Construction and Identification of HSP70 Antisense RNA Expression Vector for Genetic Engineering Male Sterility in Plant

[Objective]In order to study the relation between the HSP70 gene and male sterility of plant further.[Method]s]Anther specific expression promoter Osg6B of rice was coloned by PCR then connected with HSP70 antisense fragment to construct HSP70 antisense expression vector.The expression vector was identified by PCR experiment and enzyme digestion.[Result]The sequence of coloned Osg6B promoter had 97% homology to the published sequence,and the cis-regulatory element in promoter area was integrated.HSP70 antisense expression vector driven by the promoter Osg6B was confired by colony PCR and enzyme digestion.[Conclusion]The construction of expression vector would lay solid foundation for utilization of genetic engineering male sterility of plant.     

植物HSP70反义基因工程雄性不育表达载体的构建及鉴定(英文)

[Objective]In order to study the relation between the HSP70 gene and male sterility of plant further.[Method]s]Anther specific expression promoter Osg6B of rice was coloned by PCR then connected with HSP70 antisense fragment to construct HSP70 antisense expression vector.The expression vector was identified by PCR experiment and enzyme digestion.[Result]The sequence of coloned Osg6B promoter had 97% homology to the published sequence,and the cis-regulatory element in promoter area was integrated.HSP70 antisense expression vector driven by the promoter Osg6B was confired by colony PCR and enzyme digestion.[Conclusion]The construction of expression vector would lay solid foundation for utilization of genetic engineering male sterility of plant.     

Wx蛋白组成对小麦籽粒淀粉合成的影响

 【目的】通过对籽粒淀粉积累和淀粉合成关键酶的活性进行比较，初步明确不同Wx蛋白组成小麦品种淀粉理化特性差异的酶学基础。【方法】以6类Wx蛋白组成的14个小麦品种为试材，测定其籽粒灌浆过程中直、支链淀粉积累动态和4种淀粉合成关键酶的活性变化，对测定结果进行统计分析。【结果】Wx蛋白数目和类型对4种淀粉合成关键酶活性和直、支链淀粉合成有明显影响。随着Wx蛋白数目的增多，4种淀粉合成关键酶活性呈现升高的趋势，尤其是淀粉粒束缚淀粉合成酶（GBSS），籽粒直链淀粉含量也相应升高。Wx-B1缺失蛋白对GBSS活性影响最大，直链淀粉合成能力下降最明显，其次是缺失Wx-D1蛋白，Wx-A1蛋白缺失作用最小。籽粒灌浆过程中，4种淀粉合成关键酶活性高度相关，并与直、支链淀粉含量密切相关，说明直、支链淀粉的合成是相互影响、相互制约、同步进行的。【结论】Wx基因是影响籽粒直链淀粉含量的重要决定因素，Wx基因可以通过自身数目和组成的变化，控制GBSS的活性，并对其它淀粉合成关键酶的活性产生影响，最终影响直、支链淀粉的合成，形成不同的淀粉理化特性和加工品质。