小鼠Nr1d1基因生物信息学分析及其慢病毒干扰载体的构建

【目的】研究旨在分析小鼠Nr1d1基因序列信息及其所编码蛋白的结构和功能,构建并筛选出干扰效率最优的小鼠Nr1d1基因慢病毒干扰载体。【方法】对小鼠Nr1d1核苷酸序列和氨基酸序列进行生物信息学分析;设计合成4对小鼠Nr1d1基因的特异性shRNA序列和1对无义序列;分别将它们连接至pCD513B-U6慢病毒干扰载体上构建重组质粒,通过PCR及测序鉴定,分别将鉴定正确的重组质粒命名为pCD513B-U6-shRNA-Nr1d1-1(sh1)、pCD513B-U6-shRNA-Nr1d1-2(sh2)、pCD513B-U6-shRNA-Nr1d1-3(sh3)、pCD513B-U6-shRNANr1d1-4(sh4)和pCD513B-U6-shRNA-Nr1d1-NC(shn);将重组质粒和辅助包装质粒共转染至HEK293T细胞中,收毒后将病毒颗粒感染小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3细胞);使用荧光显微镜观察HEK293T细胞和NIH3T3细胞中的绿色荧光蛋白表达情况;Western Blotting检测并筛选出干扰效率最佳的载体。【结果】小鼠Nr1d1基因编码区序列全长1 848 bp...     

过表达及干扰人APE1重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建含过表达及干扰人APE1的重组腺病毒.方法 应用PCR技术扩增人APE1基因序列,设计并合成shRNA序列,分别插入pDC315-EGFP和pDC316-EGFP-U6表达载体,经基因测序鉴定.用重组APE1过表达和shRNA表达穿梭载体与辅助包装质粒pBHGdeltaE11ox3Cre共转染人胚肾细胞HEK293A,进行病毒包装、出毒和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度.用重组腺病毒感染人AC16心肌细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度,Western blot检测APE1蛋白表达.结果 基因测序显示APE1过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符,转染HEK293A细胞包装成功.APE1过表达和shRNA腺病毒明显影响人AC16心肌细胞中APE1蛋白表达水平.结论 成功构建了人APE1过表达及特异性shRNA腺病毒表达载体.     

西农萨能羊BTN基因RNA干扰序列的筛选及重组腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】构建西农萨能羊BTN基因RNA干扰的重组腺病毒载体,为研究BTN基因的功能和作用机制奠定基础。【方法】设计并合成3对针对BTN不同位点的shRNA编码序列,克隆到pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体中,并与已构建好的表达BTN的pDsRed1-C1-BTN载体共转染HEK293细胞,筛选有效的干扰序列。通过与腺病毒骨架质粒重组,制备表达干扰BTN基因的shRNA的腺病毒,经PacⅠ线性化后,在HEK293细胞中包装并扩增病毒,用TCID50法进行病毒滴度测定,获得高滴度的病毒上清液。【结果】成功构建了西农萨能羊BTN基因的RNAi腺病毒表达载体,腺病毒经包装和扩增后,病毒滴度可达到5×109PFU/mL。【结论】获得了有功能的pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA病毒重组子。     

NTE基因ShRNA慢病毒载体的构建与鉴定

【目的】构建神经病靶酯酶(NTE)蛋白低表达的ShRNA重组慢病毒表达系统。【方法】依照ShRNA序列设计原则设计带酶切位点的NTE ShRNA序列,与表达载体pLL3.7连接构建NTE ShRNA重组表达质粒,转染DH5α菌观察重组表达状况,与pCVM-VSV-G包膜质粒和pCMV-dr8.2dvpr表达质粒共转染293T细胞,包装得到重组慢病毒。用病毒稀释法以绿色荧光蛋白(GFP)为标记,确定转染效率及病毒含量。【结果】经酶切及测序鉴定结果显示成功构建pLL3.7-NTE ShRNA慢病毒载体。重组慢病毒质粒与辅助质粒共转染293T细胞后获得高表达的细胞,共转染48h后,收集病毒液检测病毒滴度达4.5×10~4/mL。【结论】成功构建NTE ShRNA慢病毒重组表达系统。     

过表达及RNA干扰糖尿病相关锚定重复序列蛋白基因腺病毒的制备及鉴定

目的 构建含糖尿病相关锚定重复序列蛋白(DARP)基因的重组腺病毒过表达及RNA干扰载体.方法 应用PCR技术扩增大鼠DARP基因序列,设计并合成shRNA序列,分别插入表达载体GV-314和GV-119,经基因测序鉴定.用重组DARP过表达和shRNA表达穿梭载体与辅助包装质粒pBHGloxAE 1共转染人胚肾细胞HEK293,进行病毒包装、出毒和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度.用重组腺病毒感染大鼠H9c2细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度,Western Blot检测DARP蛋白表达.结果 基因测序显示DARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符,转染HEK293细胞包装成功.DARP过表达和shRNA腺病毒明显影响H9c2细胞中DARP蛋白表达水平.结论 成功构建了大鼠DARP过表达及特异性shRNA腺病毒表达载体.     

梅花鹿Thymosin beta 10基因RNAi慢病毒载体的构建及其对鹿茸干细胞增殖的影响

利用慢病毒干扰系统,对梅花鹿生茸区骨膜干细胞(Antlerogenic periosteum cells,AP细胞)Thymosin beta 10(Tβ10)基因进行RNA干扰(RNA Interference,RNAi),并初步研究该基因对细胞增殖的影响。结果表明:试验设计的3条针对梅花鹿Tβ10基因的shRNA序列与载体质粒p LVTHM连接成功,与p SPAX2、p MD2.G质粒共转染HEK 293T细胞,获得的重组慢病毒成功感染了AP细胞;荧光定量PCR检测结果表明,RNA干扰后Tβ10基因的mRNA水平下调,MTT试验结果显示Tβ10基因的下调可以抑制AP细胞增殖。试验成功构建了针对梅花鹿Tβ10基因RNAi载体,并成功干扰了Tβ10基因在AP细胞中的表达,基因下调最高可达35.6%,并初步确定Tβ10基因下调可抑制AP细胞的增殖。     

JSRV-env慢病毒过表达载体构建及其对NIH3T3细胞增殖的影响

为研究绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)囊膜蛋白(Envelope,env)对NIH3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)增殖的影响,构建pCMV-dR8.91-JSRV-env慢病毒过表达载体并感染NIH3T3细胞。将JSRV-env基因连接红色荧光慢病毒报告载体pCMV-dR8.91,基因测序正确后将载体命名为pCMV-dR8.91-JSRV-env。将pCMV-dR8.91-JSRV-env重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞包装产生JSRV-env重组慢病毒。将重组慢病毒悬液利用超速离心沉淀法浓缩,real-time PCR测定病毒滴度。浓缩病毒转导NIH3T3细胞72h后,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖情况。结果显示:env同源重组入pCMV-dR8.91载体,测序结果与预期序列一致;pCMV-dR8.91-JSRV-env与包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞72h,real-time PCR验证JSRV-env过表达极显著(P0.01),JSRV-env重组慢病毒平均滴度为2.99×10~8 IU/mL;MTT分析显示10μg JSR-env慢病毒感染NIH3T3细胞72h显著促进NIH3T3细胞增殖(P0.05)。综上,成功构建了JSRV-env慢病毒过表达载体,证实JSRV-env能够促进NIH3T3细胞增殖。     

靶基因Bi-1RNAi重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建靶向人Bax Inhibitor-1（Bi-1）基因的shRNA慢病毒重组载体。方法借助siRNA设计工具,并结合文献资料选取Bi-1基因编码序列中有效的干扰靶点,根据连接载体中的酶切位点自行设计并人工合成干扰靶点的一对反义脱氧寡核苷酸链,先定向克隆到pU6载体（pU6-Bi-1-shRNA）,再经双酶切后克隆到慢病毒包装质粒LunIG,得到靶向Bi-1基因沉默的慢病毒包装重组质粒LunIG-Bi-1。重组质粒经PCR法进行初筛后,再通过双酶切电泳和目的基因沉默效果的检测保证插入序列的正确性。结果靶向沉默Bi-1基因的shRNA序列成功插入到慢病毒包装质粒LunIG中。结论靶向Bi-1基因沉默的慢病毒shRNA包装重组质粒构建成功。     

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶-1基因敲低人肺癌细胞A549构建及其对线粒体功能影响

目的 建立脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶-1(APE1)基因敲低人肺癌细胞A549,并初步观察线粒体功能变化.方法 APE1基因shRNA序列与pSIREN-RetroQ慢病毒载体经酶切连接重组体(pSIREN-RetroQ-shAPE1),再与病毒包装质粒共转染293T细胞;收集病毒液并感染A549细胞,嘌呤霉素筛选获得稳定细胞株A549shAPE1.免疫印迹法检测稳定细胞株中APE1干扰效率.用双氧水处理A549 shCotrol和A549 shAPE1细胞24 h,分析细胞内ATP及活性氧(ROS)变化.结果 经PCR和测序鉴定成功构建重组慢病毒载体pSIREN-RetroQ-sh APE1,免疫印迹法证实A549 shControl和A549 shAPE1稳定细胞株构建成功;双氧水处理后,A549shAPE1细胞中ATP活性明显低于A549shControl细胞(P＜0.05),而ROS明显增加(P＜0.01).结论 APE1干扰可影响肺癌细胞中线粒体功能.     

绵羊IGF1基因慢病毒表达载体的构建及其促肌细胞生长作用研究

【目的】克隆绵羊IGF-1基因CDS区,构建绵羊IGF-1基因慢病毒表达载体,分析IGF-1基因在绵羊成肌细胞增殖过程中的作用。【方法】提取绵羊肝组织总RNA,通过RT-PCR方法获得IGF-1全长CDS序列,经测序鉴定后与慢病毒载体pLEX-mcs连接,构建pLEX-IGF-1慢病毒重组表达质粒,并在293T细胞中进行病毒包装和生产。分离培养绵羊原代成肌细胞,并用重组慢病毒使其感染,建立稳定转染pLEX-IGF-1的绵羊成肌细胞系。通过绘制细胞生长曲线,分析过表达IGF-1对绵羊成肌细胞生长的影响;采用流式细胞仪检测细胞周期变化。【结果】克隆获得长518bp的IGF-1CDS区序列。成功构建了pLEX-IGF-1载体,其可在绵羊细胞系中进行稳定表达。通过Western blotting检测显示,IGF-1在293T细胞以及绵羊原代成肌细胞中获得表达,细胞生长曲线显示,稳定表达IGF-1的成肌细胞比对照细胞生长速度显著加快(第1天差异显著(P0.05),第2~6天差异极显著(P0.01));细胞周期测定结果显示,稳定表达IGF-1的成肌细胞比对照细胞较早进入S期,且在S期的细胞数目比对照细胞多29.35%。【结论】绵羊IGF-1能够有效促进绵羊成肌细胞的生长。     

重组犬IFN-γ在HEK293T细胞中的表达

为了建立一套犬IFN-γ(cIFN-γ)在HEK293T细胞中表达的方法,用伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激犬脾细胞,通过RT-PCR方法从脾细胞中扩增犬IFN-γ基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建的真核表达载体pcDNA3.1A-cIFN-γ经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:克隆的犬IFN-γcDNA基因与GenBank上发表的序列一致,同源性100%。表达产物经Western-blot方法检测,证明克隆的犬IFN-γ基因能够在HEK293T细胞中进行表达,并且表达产物能够分泌到细胞外。     

慢病毒载体介导的APP695过表达SH-SY5Y细胞系的构建和鉴定

目的通过构建pLVX-APP695-PGK-Puro慢病毒载体,用以建立可以稳定过表达APP695蛋白的SH-SY5YAPP695细胞株。方法利用PCR方法扩增目的基因片段APP695,并构建pLVX-APP695-PGK-Puro慢病毒载体,鉴定后将构建好的载体与慢病毒包装系统共转染293T细胞,并以最适感染复数感染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,筛选稳转SH-SY5Y-APP695细胞株并用PCR和Western blot鉴定稳转株细胞APP695表达。结果对pLVX-APP695-PGK-Puro载体进行酶切鉴定及DNA测序证明构建过表达APP695的重组慢病毒载体成功,PCR和Western blot显示构建的SH-SY5Y细胞稳转株成功。结论成功构建APP695基因的慢病毒载体并成功构建了SH-SY5Y-APP695细胞株,该载体可在SH-SY5Y细胞株中高水平表达APP695。     

M蛋白基因shRNA抑制PRRSV在Marc145细胞中复制的研究

 【目的】通过靶向PRRSV基因组中的M基因的siRNA来抑制PRRSV在Marc145细胞中的复制。【方法】构建4个能转录小发夹RNA（shRNA）的质粒，将其与靶蛋白表达质粒共转染HEK293A细胞，观察荧光或进行半定量PCR；或将其转染Marc145细胞，感染PRRSV后进行IFA、TCID50和实时PCR检测。【结果】shRNA表达质粒对M融合蛋白表达的抑制率约为50％，使M真核质粒表达蛋白的mRNA水平降低54%～64%，表达的shRNA在PRRSV感染后48 h使病毒的TCID50和mRNA水平均降低到1/10～1/100倍，间接免疫荧光结果表明shRNA表达质粒转染孔的荧光细胞数显著减少。【结论】shRNA表达质粒特异性的抑制了靶蛋白M和PRRSV的复制，靶向PRRSV基因组M基因不同区域的siRNA可以作为控制该病毒传播的候选策略。     

猪β防御素-2基因在HEK293T细胞中的表达

用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致。表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达。     

人B7-H4慢病毒表达载体的构建

目的构建人B7-H4慢病毒表达载体。方法将RT-PCR扩增的B7-H4基因全长编码序列克隆到慢病毒转移载体,通过脂质体转染293细胞,包装成人B7-H4慢病毒颗粒。RT-PCR、流式细胞术和Western blot鉴定B7-H4在重组慢病毒感染293细胞中表达,50%组织培养感染剂量法（TCID50法）检测重组慢病毒滴度。结果成功构建了pMD18-T-hB7-H4质粒和pEZ-Lv105-hB7-H4质粒。基因测序分析证实人B7-H4编码序列成功整合到质粒载体。TCID50法测定Lenti-hB7-9H4慢病毒滴度为1.7×10^9 copies/mL。RT-PCR、流式细胞术和Western blot证实Lenti-hB7-H4慢病毒转染细胞后可有效表达人B7-H4 mRNA和蛋白质。结论成功构建了表达人B7-H4的慢病毒颗粒。     

表达H3N2亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒对小鼠免疫原性的研究

【目的】构建一株表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,并测定其对小鼠的免疫效力。【方法】以含有SIV A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)HA基因的重组质粒pMD18-H3HA为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因,将其亚克隆入质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有H3HA及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP。利用脂质体转染方法将穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP基因在细胞中的表达筛选重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP。将重组病毒rAd-H3HA-EGFP以108TCID50两次接种6周龄的Balb/c小鼠,时间间隔为3周,通过检测免疫小鼠的抗体水平及对病毒攻击的保护情况评价该重组病毒的免疫原性。【结果】HA基因已被重组到腺病毒的基因组中,并能够伴随病毒的复制而表达,表达蛋白具有良好的生物性活性。重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP经增殖、纯化后其TCID50可达1.58×1010.mL-1,以108TCID50的剂量免疫小鼠后,能够诱导产生高水平的特异性抗体,并对H3亚型SIV的攻击提供有效保护。【结论】构建了一株具有良好免疫原性的复制缺陷型重组腺病毒,为H3亚型SI活载体疫苗的研制奠定了基础。     

小鼠IL-5真核表达质粒的构建及表达

[目的]克隆小鼠白细胞介素-5（mIL-5）cDNA构建真核表达质粒,并转染293细胞检测其是否表达。[方法]以小鼠脾脏细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-5基因cDNA,酶切后插入pRc-CMV/Fc真核表达质粒中,构建重组真核表达质粒mIL-5/Fc-pRc-CMV,转染293细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。[结果]Fc-pRc-CMV中插入DNA序列与mIL-5 cDNA一致,重组质粒转染293细胞后,ELISA可检测出质粒能在293真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。[结论]该研究成功克隆了小鼠IL-5基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

牛TLR2全长基因表达质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达(英文)

[目的]构建牛TLR2全长基因表达质粒,并在HEK293细胞中表达。[方法]利用RT-PCR技术克隆TLR2基因的全长编码区,连接到pMD18-Tsimplevector,再亚克隆到pEGFP-N1载体,得到包含TLR2基因全长的重组真核表达质粒。将重组质粒瞬时转染到HEK293细胞。流式细胞计数法和共聚焦显微镜法检测转染效率和表达蛋白在细胞中的定位;qRT-PCR法检测TLR2 mRNA在HEK293/boTLR2中的表达。最后,通过脂膜酸刺激HEK293/boTLR2细胞试验来分析TLR2蛋白的生物活性。[结果]成功克隆TLR2基因全长并连接到真核表达载体,并在HEK293细胞中表达。在LTA刺激的条件下,转染重组质粒的细胞比未转染的HEK293细胞分泌更多IL-8。[结论]本研究建立的细胞模式为TLR激动剂和拮抗剂的筛选提供快速有效的手段,有利于开展TLR激动剂和TLRs相互作用的研究。     

H5N1禽流感病毒HA基因的重组腺病毒表达载体的构建

采用PCR方法扩增出禽流感病毒HA基因,将其定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中构建pAdtrack-H5,之后将pAdtrack-H5与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-H5,将pAdeasyd-H5经PacⅠ线性化后转染HEK293细胞株,包装出含有HA基因的腺病毒pAd-H5。结果表明:含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-H5和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-H5经PCR、双酶切及核苷酸测序鉴定无误。包装成功的腺病毒pAd-H5经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。