超低温冷冻对德国牧羊犬精子超微结构及顶体酶类活性的影响

为探讨超低温冷冻对德国牧羊犬精子超微结构及顶体酶类活性的影响,对冷冻前后德国牧羊犬精子采用扫描电镜和透射电镜观察超微结构变化;采用改良明胶底膜法、改良BNPNA法、磷酸苯二钠法对精子透明质酸酶、顶体酶和酸性磷酸酶活性进行研究。结果表明:鲜精和冻前精子形态变化不显著,而超低温冷冻后精子头部、颈部和尾部发生形态变化的精子数极显著高于鲜精和冻前精子;超低温冷冻后德国牧羊犬精子3种顶体酶活性极显著降低;超低温冷冻后德国牧羊犬精子3种顶体酶活性与精子活率和顶体完整率呈正相关(P0.01),与畸形率呈负相关(P0.05)。     

猪精液冷冻与常温保存技术的研究

为研究冷冻保存和常温((17±0.5)℃)保存后猪精子活率、活力和顶体完整率,比较了猪精液冷冻稀释液中2种甘油含量细管法的快速冷冻效果,以及不同解冻温度对冷冻精液的影响,采用细胞计数法、FDA-PI双重染色法与Giemsa染色方法检测精子的活率、活力和顶体完整率。结果显示:3%(体积分数,下同)甘油冷冻解冻后精液的活率、活力(38.54%、52.24%)显著(P<0.05)高于2%甘油组(15.63%、28.22%),但3%甘油组顶体完整率(11.55%)显著(P<0.05)低于2%甘油组(21.71%)。38℃水浴解冻后的精子在39℃培养箱中4 h内活率高于0.3,而50℃水浴解冻后1 h后的活率低于0.3。精液稀释液Anderohep和BTS在常温((17±0.5)℃)保存新鲜猪精子的活率与顶体完整率上效果相似,保存3 d内精子活率达0.6以上,保存6 d内精子活率为0.3以上。结果表明,使用3%甘油冷冻保存及2种常温保存稀释液均可以较好地保存精子。     

巴马香猪精液冷冻过程中精子内抗氧化酶活性与精子质膜完整性关系研究

猪精液冷冻过程中,精子质膜往往因受到活性氧(ROS)的氧化而发生损伤,精子品质也随之下降.精子 ROS水平受抗氧化酶活性的影响,然而冷冻过程中精子细胞内抗氧化酶活性变化与细胞膜完整性的关系还缺乏报 道.该试验将巴马香猪精液冷冻保存降温过程中的精子分为4种状态,即鲜精、15 ℃精液、5 ℃精液和冷冻解冻 后精液,检测了各种状态下精子的运动参数、质膜完整性(PMI)和顶体完整性(AI),分析了超氧化物歧化酶(SOD) 活性、谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx)活性和ROS(丙二醛MDA)水平.结果表明:15 ℃精子各项指标和鲜精无显著 差异(p>0.05);5℃精子运动能力、质膜完整性和抗氧化酶活性低于鲜精(p<0.05),而精子细胞内MDA 水平与 鲜精无显著差异(p>0.05);冷冻解冻后精子的运动能力、质膜完整性和抗氧化酶活性均低于其他各组(p< 0.05),精子MDA水平显著高于其他各组(p<0.05).同时,SOD和Gpx活性与精子PMI和AI之间的相关性均达 到了显著水平(p<0.05).可见,当精子降温至15℃以下直至冷冻时,SOD和GPX活性逐渐降低,精子细胞清除 ROS的能力随之下降,精子质膜脂质过氧化反应增强,质膜受损,内容物外渗是精液品质降低的重要原因.     

茶多酚对猪精液常温保存效果的影响

【目的】研究茶多酚(TPP)对猪精液常温保存效果的影响。【方法】手握法采集20月龄健康杜洛克种公猪精液,在基础稀释液中添加不同质量浓度的TPP(0(CK),0.01,0.02,0.04,0.08,0.16g/L)作为稀释液进行常温(17℃)保存,每隔24h检查精子活率、质膜完整率和顶体完整率,分别在精液保存0,2,4,6d时检测精液中的细菌含量,并在3d和6d时检测精液中的丙二醛含量(MDA)和总抗氧化(T-AOC)活性。【结果】添加0.02,0.04,0.08g/L TPP可明显提高猪精子活率、质膜完整率、顶体完整率和T-AOC活性,降低精液的MDA含量和细菌含量。且以0.04g/L TPP效果最佳,精液有效保存时间为6d。6d时0.04g/L TPP组猪精子活率、质膜完整率、顶体完整率、丙二醛(MDA)含量、总抗氧化(T-AOC)活性和细菌含量分别为60.02%,46.40%,75.25%,2.39nmol/L,2.31U/mL和2.19×106 CFU/mL。【结论】茶多酚能有效提高猪精液常温保存效果,最适添加量为0.04g/L。     

杜洛克猪精子体外4℃保存过程中活力参数及蛋白修饰变化

为探究体外4℃保存对猪精子活力参数及蛋白修饰的影响,使用猪精液保存稀释液体外4℃保存猪精子7d,利用计算机辅助精子活力分析仪(CASA)分析测定新鲜精液和保存7d后精液的精子活力指标;使用相应试剂盒检测精子中ATP水平及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性;应用蛋白免疫印迹(WB)技术,比较新鲜精液在4℃保存7d后蛋白翻译后修饰水平的变化。结果表明,猪精液体外4℃保存7d后,精子活力参数呈现下降趋势。其中,运动力(MOT)、快速前进性运动速率(PRO)、平均路径速度(VAP)、平均直线运动速率(VSL)与新鲜精液相比分别降低59.99%、37.03%、12.34%、18.97%,且差异显著(P0.05);发现精子中ATP水平和GAPDH酶活性在4℃保存7d后显著降低(P0.05),即随着体外保存时间的延长,精子细胞内的能量供应不足,代谢水平降低;猪精液4℃保存7d后精子蛋白的磷酸化和酰化修饰明显减弱,这一结果与精子活力、代谢酶活性结果的变化趋势一致。研究结果证实,在体外4℃保存条件下,可能因精子细胞内能量代谢受阻而影响了精子活力及蛋白修饰水平。因此,本研究无论对于丰富精子的能量代谢基础理论,还是对于延长猪精液低温保存时间,提高人工授精效率,均具有重要的理论和实践意义。     

解冻温度对大额牛(Bos frontalis)精子活率及形态的影响

分别用32、35、38、41和44 ℃水浴解冻大额牛细管冻精,解冻后在常温(平均温度18.06±1.50 ℃,相对湿度46.64±4.52 %)下保存40 h,分别在0、6、12、18、24、30、36、38、39和40 h取样在显微镜下观察记录精子活率和活力;并在解冻后0、6、12、18和24 h用姬姆萨染色,在显微镜下观察记录精子形态,统计分析5个时段的精子畸形率.研究结果:①35 ℃解冻的精子复苏率为68.80 %,极显著高于44 ℃解冻的54.2 %(P<0.01),但与其它3个解冻温度比较差异不显著(P>0.05).②以38～44 ℃解冻的精子存活时间在38～39 h之间,以32 ℃解冻的存活时间最短,仅为36 h.④解冻后0 h的精子活率在42.50 %～50.00 %之间,不同解冻温度间差异不显著(P>0.05);保存6、12和18 h时,分别以35、38和41 ℃显著高于44 ℃(P<0.05);保存24 h后,各解冻温度间差异不显著P>0.05).④解冻后0 h的精子活力以35 ℃极显著高于44 ℃(P<0.01);保存6 h以32～41 ℃显著高于44 ℃(P<0.05);保存18 h,以32和41 ℃高于44 ℃(P<0.05);保存24 h后各解冻温度间差异不显著(P>0.05).⑤用41和44 ℃解冻的总精子畸形率极显著高于38 ℃(P<0.01),显著高于35 ℃(P<0.05),32、35和38 ℃间及32、41和44 ℃间差异不显著(P>0.05),用35和38 ℃解冻对精子形态损伤较小.研究表明:解冻温度越高大额牛冻精的精子活率和活力降低速度越快,精子畸形率也高,且解冻温度对精子头部和尾部形态的影响最大;大额牛细管冻精宜用38±3 ℃水浴10s解冻,解冻后在18 ℃以下常温下保存6h对其精子活力等影响不大.     

不同糖类对蓝狐精子常温及冷冻保存特性的影响

人工采取6只优质芬兰雄性蓝狐精液,利用含有不同性质糖成分的Tris-卵黄-柠檬酸钠-甘油稀释液稀释后,常温保存及制成细管冻精,荧光免疫方法检测蓝狐鲜精液常温保存及冷冻复苏后冻融精子的质量,目的在于比较不同性质糖在蓝狐精子常温及低温冷冻保存中的作用。结果表明,常温保存时,果糖、木糖及海藻糖试验组精子活力、质膜完整率及顶体完整率较高,与对照组差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);超低温冷冻保存时,果糖、海藻糖稀释液有利于提高冻融精子质量,活力(44.6%、43.7%)与对照组(35.6%)差异显著(P<0.05),质膜完整率(50.6%、51.2%)、顶体完整率(53.2%、54.1%)与对照组间(39.6%、43.5%)差异极显著(P<0.01),而其他糖分试验组与无糖对照组差别不显著(P>0.05)。结果提示:果糖、木糖、海藻糖亦可作为蓝狐精液常温保存的稀释液成分,而果糖、海藻糖为蓝狐精液超低温冷冻保存较理想的保护剂     

稀释液·清洁剂·冷冻程序对猪精液冷冻效果的影响

探讨了稀释液、清洁剂及冷冻程序对猪精液冷冻保存效果的影响。结果显示:①稀释液Ⅳ保存鲜精,精子活率明显低于其他组(P<0.05);但其作为冻精的解冻稀释液时,效果最佳(P<0.05),说明猪精液冷冻保存时可采用第Ⅰ～Ⅲ组稀释液,而解冻时采用第Ⅳ组较佳。②稀释液中于不同阶段添加SDS(Sodiumlaurylsulfate,十二烷基硫酸钠)或OEP(OrvusESPaste,清洁剂)均能显著提高冷冻精子活率(P<0.05),SDS与OEP对冻精活率的影响无显著差异(P>0.05)。③精液冷冻程序采用-70℃、液氮熏蒸与直接液氮熏蒸在对解冻后冻精精子活率上无显著差异(P>0.05)。添加咖啡因能有效提高冻精的解冻后活率。     

猪鲜精17℃保存剂效果对比试验

选择2种著名品牌猪精液常温保存稀释剂为对照组(对照一、对照二),试验组为本课题组经大量试验开发的猪精液常温保存稀释剂,旨在探讨研发的稀释剂对猪鲜精保存效果。试验结果表明,课题组研发的猪精液17℃常温保存稀释剂在有效保存时间和精子总存活时间方面均显著高于对照一组,而相对于对照二组,显著提高了大白种猪精液有效保存时间和精子总存活时间(P0.05),其余各组差异均不显著(P0.05)。试验中的3种不同稀释剂在前3d对精子质膜完整性均有较好保护作用, 3组间差异不显著(P0.05);保存到第5天,试验组和对照二组中精子质膜完整性显著高于对照一组(P0.05),但前2组之间质膜完整性无显著性差异(P0.05);保存至第7天,对照一组、对照二组和试验组中精子质膜完整性分别为49.94±3.08, 58.83±2.22, 72.86±2.62,精子质膜完整性在该3组之间均存在差异显著性(P0.05)。结果显示,在相同储存条件下,本课题组研制的精液常温保存剂对精液保存时间,质膜完整率等指标优于国内市场上著名品牌,且保存效果稳定。     

冷休克和冷冻对猪精子微细结构和精清内酶的影响

用9头梅山、8头二花脸和4头苏白公猪的精液进行了冷休克和冷冻试验.共分原精(对照)、稀释、稀释后平衡和冷冻四种情况,10个处理组别。结果表明,冷休克使猪精于活力明显下降,并随着低温处理的延长和冷冻过程而加剧.冷休克后光镜下顶体形态主要表现为质膜膨大,顶脊突出或形成皱褶。稀释后平衡有保护顶体减轻冷休克损伤的迹象.冻后精子主要表现为顶体严重肿胀,起泡乃至破裂.原精的顶体完整率与活力呈正相关(r=0.60,p<0.01),低温处理后这两个性状的相关不显著。猪精子冷冻前后的电镜观察研究揭示,解冻后精子的主要损伤部位在顶体.冻后精子质膜严重膨大、破裂,顶体外膜肿胀,形成小泡,顶体內容散失.试验中未见到由质膜和顶体外膜共同形成的所谓“杂合泡”。冷休克和冷冻后精清内 GOT 和 LDH 活性增加,冻后精清內 LDH 为原精的1.5倍,GOT 为原精的13.6倍。低温处理对精清内 GPT 活性的影响不大。用琼脂糖凝胶电泳分离猪精清,得到5条 LDH 同功酶区带.原精冷休克后 LDH—4上升(p<0.05),解冻后精清內 LDH—4上升(p<0.01),原精经稀释平衡后,M—LDH明显升高。     

温度胁迫对岩扇贝幼贝抗氧化酶活力的影响

为探究温度变化对岩扇贝Crassadoma gigantea幼贝(壳长为36.39 mm±4.45 mm)抗氧化系统的响应,试验从低温开始每天1℃逐渐升温,共设5、10、15、20、25℃5个温度试验组,检测温度胁迫下各组岩扇贝幼贝鳃组织抗氧化酶活力(超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT活性和总抗氧化能力T-AOC)的变化。结果表明:岩扇贝幼贝SOD活力在5℃时显著低于其他温度组(P0.05),温度为10~25℃时无显著性差异(P0.05);CAT活力在温度5~20℃时各组间无显著性差异(P0.05),在25℃时显著高于其他温度组(P0.05);T-AOC能力在15℃时显著高于其他温度组(P0.05),温度从15℃升高或降低,T-AOC能力都会显著下降(P0.05),温度从15℃降低至5℃时,T-AOC能力的下降幅度显著高于温度从15℃升高至25℃时的下降幅度(P0.05)。研究表明,高温对岩扇贝幼贝鳃组织中CAT活力有着明显的诱导作用,对T-AOC能力有着明显的抑制作用,低温对岩扇贝幼贝组织中SOD活力、T-AOC能力有着明显的抑制作用,从抗氧化酶活力的变化证明了15℃为岩扇贝幼贝最适生长水温。     

精子与慢病毒共孵育条件的优化以及转基因猪的制备

【目的】探索慢病毒与精子共孵育的方法,并制备转基因猪。【方法】采用正交试验分析精子密度、病毒量、精子与慢病毒共孵育时间、精子与慢病毒共孵育温度对精子活力的影响,采用PCR和Southern blotting检测转基因。【结果】①优化慢病毒与精子共孵育条件为：100 µL慢病毒原液（5×105cfu）与1.0×107个/mL精子在17℃下孵育30 min;②与病毒孵育后的精子（109个/mL）给母猪人工授精时,经PCR检测49头仔猪中有14头呈阳性;③Southern blotting结果表明,8头PCR阳性仔猪中,4头融合了外源基因。【结论】优化了精子与慢病毒共孵育的条件（100 µL慢病毒原液（5×105cfu）与1.0×107个/mL精子在17℃下孵育30 min）,成功制备了转基因猪,并检测有外源基因的融合。     

超低温冷冻对俄罗斯鲟精子抗氧化酶活性的影响

为了探讨超低温（-196℃）对精子的损伤机理，采用试剂盒测定了冷冻前后俄罗斯鲟精浆和精子中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—PX）和谷胱甘肽还原酶（GR）等酶活性。结果表明，经过超低温冷冻保存后，俄罗斯鲟精子活力下降，添加抗冻保护液冷冻后的精浆中SOD、CAT、GSH—PX活性较鲜精组显著升高（P〈0．05），较未添加保护液组显著降低（P〈0．05），GR的活性则显著低于鲜精组（P〈0．05），但显著高于未添加保护液组（P〈0．05）；添加抗冻保护液冷冻后的精子中SOD、CAT、GSH—PX活性较鲜精组显著降低（P〈0．05），较未添加保护液组显著升高（P〈0．05），GR活性则显著高于鲜精组（P〈0．05），但显著低于未添加保护液组（P〈0．05）。这说明超低温冷冻对俄罗斯鲟精子的抗氧化系统产生了较大影响，成为影响精子活力的一个重要原因。     

盐度和温度对大菱鲆幼鱼抗氧化酶活性的影响

采用两因素交叉分组的方法,研究了温度和盐度对大菱鲆Scophthalmus maximus幼鱼行为活动、摄食、存活情况以及体表黏液、血液、鳃、肝脏中抗氧化酶活力的影响.结果表明:水温(17、20、23、25、28℃)和盐度(5、10、20、30、40)对大菱鲆幼鱼摄食、死亡率有显著影响(P＜0.05),在水温为17、20℃与盐度为20、30的组合条件下,大菱鲆幼鱼的摄食积极性以及存活率较高,显著高于其他组(P＜0.05);温度和盐度对大菱鲆幼鱼SOD、CAT与GP-X活力有显著影响(P＜0.05);当温度一定,盐度变化的条件下,肝脏、鳃、血清和黏液中的各种酶活力在正常海水盐度(30)时活力较低,并随盐度由30起降低或升高而均出现升高的趋势;当盐度一定,温度变化的条件下,随着水温的升高,各组织中的酶活力变化规律不显著;通过分析温度与盐度交互作用对各组织不同酶活的变化以及生命表征现象,得出了最适生存阈值,即大菱鲆幼鱼的适宜生活水温为17～20℃,适宜生活盐度为20～30.     

血浆种类和温度对褶纹冠蚌钩介幼虫非寄生变态发育及早期稚蚌生长的影响

为完善褶纹冠蚌钩介幼虫体外培养技术和理论，采用体外培养技术研究了血清、温度对钩介幼虫的变态发育影响，并对早期稚蚌的成活和生长进行了评估。结果表明：鳙鱼血浆培养的钩介幼虫变态率极显著高于马血清、牛血清组(P<0.01)；18℃培养的钩介幼虫变态率均显著高于30、24℃(P<0.05)；褶纹冠蚌钩介幼虫生物学零度为9.34℃，有效积温为102.84℃·d；早期稚蚌养殖一个月后，鳙鱼血浆培养的稚蚌成活率最高(P<0.05)，鳙鱼血浆组稚蚌壳长显著高于牛血清组、马血清组组(P<0.05)；稚蚌在3 个养殖温度下，温度越低，成活率越高，且具有显著性差异(P<0.05)。综上所述，以鳙鱼血浆为营养源、18℃条件下培养的褶纹冠蚌钩介幼虫变态率最高，稚蚌养殖成活率高。     

急性高温胁迫对翘嘴鳜幼鱼抗氧化酶和消化酶活性及热休克蛋白基因表达的影响

【目的】从抗氧化酶和消化酶活性及热休克蛋白基因表达层面明确高温胁迫对翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）幼鱼生长及应激生理响应的影响,为实际生产中翘嘴鳜幼鱼培育提供可靠的参考依据。【方法】对2月龄翘嘴鳜幼鱼进行96 h的急性高温胁迫,通过预试验测试高起始致死温度（96 h-UILT₅₀）,采用突变升温方法设常温对照组（26.0℃）和急性高温胁迫组（36.0℃）,分别于胁迫0、6、12、24、48和96 h后取样,使用生化试剂盒测定抗氧化酶和消化酶活性,并以实时荧光定量PCR检测热休克蛋白基因（HSP70α和HSP90α）的表达情况。【结果】翘嘴鳜幼鱼死亡率随水温的升高不断上升,其96 h-UILT₅₀为36.22℃。在96 h的急性高温胁迫过程中,翘嘴鳜幼鱼肝脏超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性呈降低-升高-降低的变化趋势,谷丙转氨酶（GPT）活性及丙二醛（MDA）含量则表现出升高-降低-升高的变化趋势;在消化酶方面,翘嘴鳜幼鱼胃蛋白酶和肠道淀粉酶（AMS）活性呈降低-升高-降低的变化趋势,而肠道脂肪酶（LPS）活性呈升高-降低-升高的变化趋势。在急性高温胁迫过程中,翘嘴鳜幼鱼HSP70α基因相对表达量呈升高-下降的波动式变化趋势,于胁迫12 h时达最高值,在胁迫48 h时出现第2个峰值;HSP90α基因表达呈先升高后降低的变化趋势,于胁迫24 h时上调至最高值;但至胁迫96 h时HSP70α和HSP90α基因的相对表达量仍显著高于对照组翘嘴鳜幼鱼（P<0.05）。【结论】急性高温胁迫对翘嘴鳜幼鱼抗氧化酶和消化酶活性及热休克蛋白基因表达产生显著影响。其中,热休克蛋白基因HSP70α和HSP90α参与高温胁迫应答过程的生理调节,以应对高温胁迫对肝脏细胞的损伤,故可作为高温胁迫应答的标志物。     

紫彩血蛤低温保活技术研究

[目的]研究紫彩血蛤在低温条件下的保活效果。[方法]以紫彩血蛤为原料,测定了它的冻结曲线并对其在生态冰温区域内和冰块堆积条件下以及不同冷藏温度和湿度下的保活效果进行了比较。[结果]紫彩血蛤的生态冰温区大致在0~-2℃。随着温度的升高,紫彩血蛤的存活率逐渐降低,存活率最高的组为冰温保藏组(-1.5~-0.5℃),在保活10 d后其存活率依然达99%。淡水冰堆积组和4~6℃组保活效果较好,在保活7 d后,两者的存活率均达99%,而且总体表现接近。湿度对紫彩血蛤保活效果有一定的影响,呈正相关性,相对湿度越高越有利于蛤体的存活。[结论]该研究为紫彩血蛤的实际生产应用提供了理论依据。     

猪用复合微生态制剂制备及保存期内活菌数研究

为了确定两种猪肠道益生菌的同体发酵效果,以及复合微生态制剂在不同保存条件下的活菌数变化.对猪肠道益生菌干酪乳杆菌、罗伊氏乳酸杆菌进行同体发酵,测定其活菌数,然后按照一定比例将两种益生菌与液体发酵的纳豆芽孢杆菌冻干菌粉混合制成复合微生态制剂;测定该制剂在4℃和室温保存状态下14 d内及半年内益生菌活菌数量的变化.保存14...     

6种鸡精液冷冻稀释液以及冻后保存条件比较

为探究不同稀释液对鸡精液冷冻保存效果的影响,选择LR、Lake’s、BPSE、Modified Sasaki、Beltsville和Nabi共6种稀释液对霞烟鸡精液进行冷冻,解冻后分别在37或4 ℃条件下短时间保存,分析不同冷冻稀释液和保存条件对精子活率、活力、功能完整性和抗氧化指标的影响。结果表明,6种稀释液中Lake’s稀释液的冻后活率、活力和顶体完整性最高,分别为48.20%、45.70%和45.26%;LR稀释液虽然获得了48.16%的冻后活率,但其活力显著低于Lake’s稀释液。解冻后4 ℃保存更适合鸡精子的短时间保存,Lake’s和Nabi稀释液在4 ℃条件下保存45 min后活力仍达30 %以上。虽然Nabi稀释液解冻初始时的精子活率和活力低于LR和Lake’s稀释液,但随着保存时间的延长,其冻后精子存活能力表现最佳。随着冻后保存时间的延长,LR、Lake’s和Nabi稀释液冻后精子的线粒体活性、质膜完整性和抗氧化能力均呈现下降趋势,且37 ℃保存时下降更为明显,同时LR稀释液在这些指标上表现出较差的耐受性。综上所述,Lake’s和Nabi冷冻稀释液对鸡精子冷冻保存的效果最佳;解冻后4 ℃保存可延长冻精的体外存活时间;LR稀释液虽获得了较高的冻后活率,但其活力和冻后耐保存性能较差。     

载体对26℃条件下牛粪厌氧处理性能的影响

在26℃低温条件下,采用两步发酵法观察玻璃纤维、尼龙纤维和岩棉对牛粪厌氧处理沼气产量、pH值、总COD去除率的影响。结果表明,添加载体对流动发酵期间的pH值没有显著影响;岩棉载体由于脱落导致较低的沼气产量,玻璃纤维和尼龙纤维载体对沼气产量的影响主要出现在发酵的16～30d,其沼气产量分别比对照提高13.30%和12.75%(P<0.05),在发酵的24～30d,添加玻璃纤维和尼龙纤维使总COD去除率分别提高10.86%和8.83%(P<0.05)。在低温条件下,采用两步的流动发酵可以在一定程度上提高反应器的沼气产量。