基于转录组测序挖掘小麦叶片抗旱相关基因

【目的】通过转录组测序分析干旱胁迫的小麦,以期挖掘小麦响应干旱胁迫的关键基因。 【方法】采用高通量 Illumina Hiseq 2500 测序平台对郑麦 366 号正常生长与自然干旱处理进行测序,并对测序数 据进行分析,筛选响应干旱胁迫的关键基因。【结果】两组样品中分别获得 45 471 018、45 133 470 个 clean read 片段,包含 6.82 Gb、6.39 Gb 碱基信息,拼接组装后,得到 188 334 个转录本和 119 588 个 Unigenes。通过筛选 共获得 1 207 个 DEGs,其中 752 个上调,455 个下调。GO 功能富集分析显示,上调的 DEGs 主要富集在水解酶 活性、催化活性、代谢过程、甘油代谢过程、膜和细胞部分等;下调的 DEGs 富集在细胞器、细胞和氧化还原 酶活性的最多。KEGG 途径富集分析发现,DEGs 显著富集于淀粉和蔗糖代谢、卟啉和叶绿素代谢、光合作用 - 天线蛋白、光合作用、苯丙烷生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢、甘油磷脂代谢、氨基酸代谢和光合生物中的碳 固定等代谢通路。5 个抗氧化酶基因的 qRT-PCR 结果与 RNA-Seq 测序结果变化趋势相一致。【结论】利用转录 组测序技术获得了大量小麦抗旱相关基因,为深入研究小麦响应干旱胁迫的分子机制提供更多的基因遗传资源。     

外源茉莉酸对燕麦在不同干旱胁迫下转录组的影响

为探究外源茉莉酸(Jasmonic acid，JA)对不同干旱胁迫下燕麦转录组的影响，本研究测定轻度(0.017 mol/L PEG-6000处理)和重度干旱胁迫(0.034 mol/L PEG-6000处理)处理及再添加JA处理的‘蒙燕1号’转录组，并对表达显著差异基因(DEGs)进行GO和KEGG功能富集分析。结果表明:GO功能富集分析显示，不同干旱胁迫处理下，外源JA诱导的DEGs均主要富集在膜、催化酶、转移酶和对刺激反应等代谢途径。KEGG功能富集分析显示，在未进行干旱胁迫条件下(CK)，外源JA诱导1 955个基因表达上调，4 666个下调；DEGs主要富集的通路为代谢途径和次生代谢物的合成，其中苯丙素的生物合成通路基因表达发生显著变化。轻度干旱胁迫下，外源施用JA诱导1 574个基因表达上调，933个基因下调；DEGs主要富集的通路为次生代谢的生物合成、植物激素信号转导、精氨酸和脯氨酸代谢通路，其中脱落酸和水杨酸信号转导、精氨酸和脯氨酸代谢通路中基因表达均上调；重度干旱胁迫下，外源JA诱导223个基因表达上调，456个下调；DEGs显著富集的只有鞘脂代谢通路。与未施用JA相比，不同干旱胁迫下，施用JA均可诱导细胞分裂素(CTK)代谢通路中CTK的N-糖基化基因(UGT73C5)上调和氧化酶/脱氢酶基因(CKX11)下调，以及脱落酸(ABA)信号转导相关基因(THI1.3)和未知功能基因(AT1G71250)表达发生显著变化。综上，轻度和重度干旱胁迫下，外源JA能诱导燕麦响应干旱胁迫的CTK和ABA相关基因表达发生显著变化。     

中华蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌早期胁迫的转录组学

【目的】白垩病是困扰养蜂生产的顽疾。目前,尚无利用二代测序技术研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫白垩病的报道。本研究利用RNA-seq技术对健康(Ac CK)及球囊菌(Ascosphaera apis)胁迫的中蜂4日龄幼虫肠道(Ac T)进行深度测序,在转录组水平研究中蜂幼虫在球囊菌胁迫早期的胁迫应答。【方法】通过Illumina Hi Seq 2500平台对Ac CK和Ac T进行双端(PE125)测序,首先对测序数据进行质控和评估,利用edge R软件进行差异表达基因(DEG)分析,进而对DEGs进行GO富集分析及KEGG代谢通路富集分析,最后,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证测序数据的可靠性。【结果】Ac CK和Ac T的转录组测序共得到188 457 338条原始读段(raw reads),经过滤得到182 088 448条有效读段(clean reads),两端Q20与Q30均在97.96%和94.97%以上,说明测序数据质量良好;主成分分析(PCA)结果显示第一与第二主成分可分别解释基因表达总体差异的75.8%和10.7%;DEG分析结果显示上调基因与下调基因的数量分别为344和239个;GO富集分析结果显示DEGs共富集在36个GO分类(term)上,其中基因富集数最多的细胞(106 unigenes)、细胞组件(106 unigenes)和代谢进程(104 unigenes);KEGG代谢通路富集分析结果显示上调与下调基因分别富集在72个和45个代谢通路上,其中上调基因富集数最多的是核糖体(72 unigenes)、碳代谢(16 unigenes)和糖酵解(14 unigenes),而下调基因富集数最多的是碳代谢(9 unigenes)、二羧酸代谢(8 unigenes)和氨基酸生物合成(7 unigenes),进一步分析表明中蜂幼虫肠道的部分细胞免疫对球囊菌的胁迫产生应答,而体液免疫不产生应答,宿主的代谢相关基因受到球囊菌的显著抑制。【结论】揭示了中蜂幼虫在球囊菌入侵早期的胁迫应答,为深入解析中蜂幼虫的胁迫应答机制提供了重要信息,也为在分子水平研究关键应答基因打下了基础。     

干旱处理下2个梨品种转录组差异表达基因分析

【目的】以转录组数据为基础挖掘梨抗旱关键基因,为培育梨抗旱品种提供理论基础。【方法】以正常浇水和干旱处理下黄冠梨Pyrus bretschneideri‘Xuehuali’×P.pyrifolia‘Shinsseiki’和黄金梨P.pyrifolia‘Niitaka’×P.pyrifolia‘Nijisseiki’的叶片进行Illumina Hi Seq TM 2000高通量转录组测序分析,利用基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库分析2个梨品种中的差异表达基因(DEGs)。【结果】2个梨品种间在正常浇水和干旱处理下分别发现了4 377和3 841个DEGs,其中只在干旱处理下的DEGs有1 340个。这些DEGs在GO数据库的3个本体生物过程、分子功能和细胞成分中富集到的数量分别是1 387、922和1 253个,与植物抗旱相关的代谢过程、应激反应和生物膜等条目分别富集到349、139和151个DEGs。仅在干旱处理下的1 340个DEGs被比对到102个KEGG代谢通路上,其中与植物内源激素相关的代谢通路有3个。将1 340个DEGs进行转录因子分析发现,被注释为转录因子的有37个,分布在17个转录因子家族中,其中乙烯应答转录因子(ERF)家族所拥有的DEGs最多,为11个。【结论】本研究发现了与梨抗旱相关的内源激素代谢基因和转录因子,干旱胁迫下这些基因在2个梨品种中差异表达,这可能与2个品种的抗旱性差异存在密切关系,为下一步梨抗旱分子机理研究奠定了基础。     

利用RNA-Seq发掘玉米叶片形态建成相关的调控基因

【目的】叶片宽度和长度等叶形特性是决定植株形态,进而影响种植密度的重要农艺性状,通过转录组测序技术筛选并挖掘玉米叶片形态建成相关的代谢路径及调控基因,为深入认识叶片发育的分子机理和鉴定叶宽、叶长候选基因奠定基础。【方法】以极端窄叶自交系NL409和宽叶自交系WB665为材料,利用RNA-Seq技术鉴定7叶期第七片叶近基部的差异表达基因(DEGs),通过生物信息学分析,筛选与叶片发育密切相关的代谢通路,利用qRT-PCR验证不同激素路径叶形相关基因的表达结果,并结合启动子区域的序列差异挖掘叶形功能基因。【结果】分析对照(WB665)和样品(NL409)高通量测序结果,在叶宽形成关键部位共筛选出5 199个DEGs,其中,2 264(43.55%)个基因表达上调,2 935(56.45%)个基因下调表达,下调基因明显多于上调基因;GO功能富集分析表明,差异基因主要富集在细胞膜相关的细胞组分中,涉及代谢过程和细胞响应刺激;KEGG富集分析表明,差异基因主要参与到核糖体、植物激素信号转导、苯丙烷类代谢、乙醛酸和二羧酸代谢等过程,其中核糖体、植物激素信号转导、鞘脂类代谢下调表达基因较多的路径与叶片发育密切相关。核糖体路径富集到多个PRS(PRESSED FLOWER)基因,分析发现PRS13(PFL2)可能在调控窄叶发育过程中发挥重要作用。鞘脂代谢路径富集的基因几乎全部下调表达,引起抑制叶片发育的AP1(APETALA1)类和MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase)类基因上调,以及促进叶片发育的LFY(LEAFY)下调,与窄叶发育受抑制的表型一致。植物激素信号转导路径富集到的油菜素内酯(BR)响应基因和赤霉素(GA)代谢基因下调,细胞分裂素(CTK)和大部分生长素(Auxin)响应基因上调,与窄叶中DELLA蛋白基因上调表达,抑制GA并促进CTK基因表达的作用模式一致。通过qRT-PCR对18个叶片发育相关基因进行分析,结果表明,其表达趋势与转录组结果一致,分析发现BR相关的ROT3、Auxin相关的NAL7-like、AGO7-like以及TCP类转录因子CYC/TB1等基因与窄叶的形成密切相关。【结论】明确了一些与玉米叶片发育密切相关的代谢路径,还发现植物激素间的动态平衡对叶片发育有着重要影响,尤其是生长素与油菜素内酯、细胞分裂素与赤霉素之间的相互作用对调控叶片形态可能发挥重要作用。     

酸雨胁迫下琯溪蜜柚叶片转录组差异表达分析

【目的】研究琯溪蜜柚受酸雨胁迫的内在分子机制,为琯溪蜜柚科学种植提供基础资料,也为酸雨逆境生理提供理论基础。【方法】以模拟酸雨胁迫24 h的琯溪蜜柚叶片进行Illumina HiSeq TM 4000高通量转录组测序分析,将组装得到的基因在参考基因组、Nr和KEGG数据库进行比对;利用FDR与log2(FC)来筛选差异基因,筛选条件为FDR0.05且|log2(FC)|1,将筛选的差异基因做GO和KEGG富集分析。【结果】模拟酸雨喷淋24 h后,琯溪蜜柚嫩叶出现明显块状伤斑;共得到21 497个基因,全部得到注释,与对照相比,酸雨处理组中有879个基因显著上调,588个基因显著下调;筛选出样本中前50个DEGs(差异基因),均为上调表达基因,大部分涉及代谢途径、次生代谢、苯丙基类丙烷生物合成和萜类物质合成等相关基因。GO富集分析表明差异表达基因主要位于细胞外区域;执行分子功能中催化剂活性是最为显著富集的GO term,其次是氧化还原酶活性;生物过程中差异表达基因最显著的GO term是DNA代谢过程。KEGG富集分析表明DNA复制是差异表达基因中最显著富集的Pathway,其次是次生代谢的生物合成,再次是苯丙素类合成途径。对次生代谢合成途径中4个差异表达基因[POD同工酶cg3g018770和cg2g001440、肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)同工酶cg1g021310、4-香豆酸-辅酶a连接酶(4CL)同工酶cg3g029290]进行PCR荧光定量分析,验证了转录组数据的可靠性。【结论】琯溪蜜柚对酸雨耐性较强,对酸雨胁迫的响应是多基因参与、多生物过程协同调控的过程,次生代谢的调节可能是应对酸雨胁迫的主要方式。     

干旱胁迫下割手密根系转录组差异表达分析

【目的】探明云南割手密82-114受干旱胁迫的内在分子机制,挖掘与抗旱密切相关的功能基因,提高割手密抗旱基因的研究与利用。【方法】以干旱胁迫24、48和72 h的云南割手密82-114的根系进行Illumina Hi Seq TM 4000高通量转录组测序分析,将组装得到的Unigene分别与Swiss-Prot、Nr、KOG、Pfam和KEGG数据库进行比对,利用RPKM来衡量各样本间的基因表达丰度,以FDR≤0.05和|log2 fold change|≥1来评估样本间的差异表达基因,通过Gene Ontology(GO)数据库、KEGG pathway数据库对不同干旱胁迫样本差异表达基因的功能和参与的调控路径进行分析。【结果】未胁迫处理的CK与胁迫24、48和72 h后的样本转录组分别检测到134 724、130 368、133 564和131 321个表达基因,与CK相比,各胁迫样本显著上调(或下调)的差异表达基因分别有3 061(1 302)、2 304(2 841)和3 236(2 525)个;以FDR值=0为筛选条件,3个样本的极显著差异表达基因主要参与转录激活、水分运输、DNA结合、ATP结合及细胞膜、跨膜运输和防御反应等有关代谢活动。GO富集分析表明:3个胁迫处理的样本在生物学途径中富集最多的类别并不完全相同,其中,胁迫24 h与48 h的样本富集最多的类别是与DNA依赖型转录和转录调节子相关的基因,胁迫72 h样本富集最多的类别是与翻译相关的基因;而在细胞组件和分子功能中,3个胁迫样本富集最多的基因类别均是与内在的膜、核和ATP结合相关的基因。KEGG富集分析表明:胁迫24 h的样本有2 248个差异表达基因参与了107条代谢途径,胁迫48 h的样本有2 114个差异表达基因参与了130条代谢途径,胁迫72 h的样本有2 392个差异表达基因参与了144条代谢途径;经KEGG显著性富集分析,筛选到鞘糖脂生物合成途径、MAP激酶信号途径和ABC转运蛋白等与非生物胁迫或逆境相关。【结论】获得3个干旱胁迫样本与CK样本间差异表达基因的变化及其功能信息,发现参与云南割手密82-114干旱胁迫响应相关的细胞外信号调节激酶、磷脂酶D、β-氨基己糖苷酶和ATP结合盒B亚族(MDR/TAP)-1等,获得在整个干旱胁迫时期稳定上调表达基因70个,稳定下调表达基因11个,通过同源基因序列的比对分析,阐明这些基因在各自的代谢通路中被强烈诱导或抑制表达,显示与干旱胁迫存在密切关系。     

高温胁迫下萝卜苗期的转录组分析

【目的】对高温胁迫下萝卜幼苗进行转录组测序分析,筛选不同耐热性萝卜品种间的差异表达基因,为阐明萝卜幼苗响应高温胁迫的分子机制提供理论参考。【方法】以耐热萝卜品种1116T和热敏感萝卜品种Wr129为对象,对其进行高温（40℃）胁迫处理0（常温,对照）和24 h,提取各时间点样品总RNA进行转录组测序,以|log₂ FoldChange|≥1,P<0.05且TPM≥10为标准,筛选出差异表达基因（DEGs）,并进行GO功能注释和KEGG代谢通路富集分析。【结果】随着高温胁迫时间的增加,Wr129和1116T幼苗茎叶逐渐发生萎蔫,胁迫24 h后Wr129叶片萎蔫下垂且干枯变黄,而1116T叶片轻度萎蔫下垂,仍保持绿色。12个文库共获得81.45 Gb Clean data,平均有62.30%的reads比对到萝卜参考基因组的一个位置。从2个不同耐热性品种中共鉴定到2701个差异表达基因。GO功能注释结果显示,2629个差异表达基因在GO数据库中得到注释,其中,有559个差异表达基因被注释为细胞组分类别中的叶绿体被膜、叶绿体基质和叶绿体类囊体3个条目,470个差异表达基因被注释为与胁迫响应相关的生物学过程。KEGG代谢通路富集结果显示,1166个差异表达基因富集到124条代谢通路,其中,有74个差异表达基因富集到光合作用和光合作用-天线蛋白代谢通路,23个基因富集到卟啉和叶绿素代谢通路,大部分基因在高温胁迫下被诱导; 35个差异表达基因富集到谷胱甘肽代谢途径,其中14个谷胱甘肽-S-转移酶基因（GSTs）在高温胁迫下上调表达。高温胁迫24 h,Wr129和1116T幼苗叶片PSII的最大光化学效率（F_v/F_m）和总叶绿素含量均下降,但1116T的下降幅度较小。【结论】 Wr129和1116T的耐热性存在明显差异,其原因是1116T植株可通过调控光合作用和抗氧化系统相关基因的表达,减缓F_v/F_m和叶绿素含量下降速率,从而提高植株对高温胁迫的耐受能力。     

苹果叶片不定芽再生过程的差异表达基因鉴定与分析

【目的】筛选分析‘GL-3’苹果叶片不定芽再生过程中的差异表达基因（differentially expressed gene,DEG）,进一步解析苹果叶片不定芽再生的潜在分子机制,为提高苹果的遗传转化效率提供理论参考。【方法】‘GL-3’苹果继代组培苗叶片外植体接种在再生培养基上,分别于0、3、7、14和21 d后取样并提取RNA,构建mRNA文库后采用Illumina Nova seq平台进行测序。筛选出各时间点的DEGs,根据GO（Gene ontology）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）注释结果以及官方分类,使用R软件中的phyper函数对筛选到的DEGs进行GO和KEGG富集分析;利用BLAST软件进行基因比对注释;重点分析植物再生相关的激素、酶、转录因子、多胺等DEGs;采用qRT-PCR对DEGs进行定量验证。【结果】再生培养基上培养3、7、14和21 d的苹果叶片外植体与对照组相比,分别筛选到5 250、4 937、6 852、6 493个DEGs,4个时间点共有的DEGs有3 027个。DEGs的GO功能富集显示,4个时间点筛选到的共有DEGs中上调表达的DEGs主要与氧化还原过程、细胞外围、蛋白激酶活性和有机环化合物结合等功能有关;下调表达的DEGs主要与单细胞代谢过程、钙离子结合、光合膜和类囊体部分等功能有关。DEGs的KEGG通路富集分析显示,4个时间点筛选到的共有DEGs中上调表达的DEGs主要富集在磷酸戊糖途径、植物激素信号转导、植物-病原菌相互作用和内质网蛋白质加工等途径中;下调表达的DEGs主要富集在α-亚麻酸代谢、苯丙烷生物合成、碳代谢和光合作用等途径中。对与植物离体叶片再生相关的激素、酶、转录因子和多胺等相关DEGs的表达模式进行分析发现,这些DEGs大部分呈上调表达趋势。经qRT-PCR验证后,所检测基因的表达趋势与转录组测序结果一致。【结论】通过对苹果叶片不定芽再生过程中不同时间点的基因表达谱进行检测和对比分析,获得了大量与苹果叶片不定芽再生相关的基因,研究结果为深入探讨苹果离体叶片再生机理提供了理论依据。     

小麦幼苗根系应答重金属Pb胁迫的转录组分析

为了探究小麦对重金属铅(Pb)胁迫应答的分子机制,采用水培法对小麦品种矮抗58进行不同质量浓度[0(对照)、40、80、160 mg/L]Pb胁迫处理,并对幼苗根系进行转录组测序,筛选分析差异表达基因,进行GO分类及KEGG富集分析。结果表明,不同质量浓度Pb处理下,小麦幼苗的根长和根数均受到抑制,且随着Pb质量浓度升高抑制作用增强。在Pb胁迫处理与CK间共获得了38 904个差异表达基因。其中,40、80、160 mg/L Pb条件下分别有6 072、16 581、16 251个差异表达基因。选取80 mg/L Pb处理的差异表达基因作为研究重点分别进行GO分类和KEGG通路富集分析。GO分类发现,上调差异表达基因主要富集在免疫系统过程、运动过程、代谢过程、节律性过程及催化活性和电子载体活性等方面,下调差异表达基因主要富集在发育过程、生长过程、定位过程、复制过程、生殖过程及转运活性和抗氧化活性等方面;KEGG富集分析发现,上调差异表达基因主要涉及植物激素信号转导途径、植物-病原互作途径、药物代谢途径、MAPK信号通路等方面,下调差异表达基因主要涉及次生代谢物的生物合成途径、苯丙烷类生物合成途径、抗生素生物合成途径、碳代谢和蔗糖代谢等方面。选取6个响应Pb胁迫的差异表达基因进行RT-PCR验证,结果表明6个差异表达基因的表达模式与RNA-Seq分析结果一致,进一步验证了RNA-Seq结果的准确性。     

抗氟苯虫酰胺小菜蛾差异表达基因及其通路

【目的】随着氟苯虫酰胺等双酰胺类杀虫剂的广泛应用,小菜蛾(Plutella xylostella)对该类药剂的抗性愈发突出。研究旨在从转录组水平研究小菜蛾对氟苯虫酰胺的抗性机制,明确小菜蛾对氟苯虫酰胺产生抗性的关键基因及通路,为揭示小菜蛾对氟苯虫酰胺的抗性机制打下基础。【方法】以室内筛选的小菜蛾抗氟苯虫酰胺品系(Rh28)、田间抗性种群(Rz36)和敏感品系(S)为材料,通过转录组测序技术(RNA-Seq),获得抗性小菜蛾品系/种群在转录水平上的差异表达基因及抗性显著上调表达基因,采用基因本体(GO)显著性富集分析及京都基因与基因组百科全书数据库(KEGG)富集分析,确定差异表达基因具有的主要生物学功能及其参与的主要生化代谢和信号转导途径。【结果】通过将不同抗性品系/种群与敏感品系的RNA-Seq数据对比,获得数量不等的差异表达基因。将差异基因富集的生物学过程(biological process)和信号通路(pathway)进行GO分析,发现其主要集中于对刺激物的反应(response to stimulus)、催化活性(catalytic activity)和代谢过程(metabolic process)等条目中;而KEGG分析发现,差异基因主要集中于代谢通路(metabolic pathway)中,基因数量占比最高,为17.84%。通过统计分析进一步获得了抗性显著上调表达基因,并对其中218个基因开展了GO分析,其仍然主要集中在代谢过程、对刺激物的反应和生物调节(biological regulation)等条目中;通过对抗性显著上调基因进行KEGG分析,发现其仍主要集中在代谢通路中,其中谷胱甘肽-S-转移酶、细胞色素P450解毒酶及参与昆虫多种生理反应的热激蛋白(Hsp)超基因家族等基因的表达量均显著上调。通过聚类热图分析发现,显著表达上调的基因较多集中在内质网上蛋白质的加工(protein processing in endoplasmic reticulum)、酪氨酸代谢(tyrosine metabolism)、咖啡因代谢(caffeine metabolism)和Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)中。【结论】获得了小菜蛾抗氟苯虫酰胺差异表达基因及抗性显著上调表达基因,其主要富集于代谢过程、应激反应及对刺激物的反应等条目中,这些基因的相互协同调控是小菜蛾对氟苯虫酰胺产生抗性的重要机制。     

谷子萌发期响应干旱胁迫的基因表达谱分析

【目的】谷子是一种耐旱作物,通过二代测序技术获得大量的谷子萌发期响应干旱胁迫的差异基因,进而挖掘谷子萌发期抵御干旱的关键基因及其相关的分子机制。【方法】以晋谷45为材料,谷子萌发期分别用18%PEG-6000干旱胁迫(处理组)和蒸馏水(对照组)处理种子并测定1、10和18 h种子的SOD、POD和CAT活性。SOD活性用氮蓝四唑(NBT)法测定,POD活性用愈创木酚法测定,CAT活性用比色法测定;对萌发10和18 h种子的对照组和处理组构建c DNA文库并进行差异基因表达谱分析;利用Bowtie将reads比对到参考基因组,采用RSEM对bowtie的比对结果进行表达量估计;使用DESeq进行差异表达基因分析;利用NR、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO在线数据库对差异基因进行功能注释,挖掘调控谷子萌发的关键基因;利用q RT-PCR验证测序结果的可靠性。【结果】处理组的SOD活性整体比对照组高,而POD活性和CAT活性与之相反;随着萌发时间的变化,SOD活性在不断地增加,但CAT和POD活性逐渐减小。基因表达谱序列与所选参考基因组序列高度一致,基因表达呈现出高度不均一性。通过高通量测序最后获得35 470个基因,以RPKM≥0.01为筛选标准,对照样本中分别筛选出24 030和24 486个表达基因,PEG干旱胁迫处理10和18 h的样本分别筛选出24 019和23 877个表达基因;差异表达基因分析表明,谷子萌发10和18 h分别筛选出456和545个差异基因,其中87和267个上调表达基因,369和278个下调表达基因;GO功能显著性富集分析表明,差异基因主要涉及代谢过程,细胞进程和响应刺激;KEGG富集分析表明,差异基因参与到苯丙烷代谢和植物激素信号转导过程;通过q RT-PCR对5个差异基因在干旱胁迫下种子萌发时的表达分析表明,其表达趋势与表达谱分析结果基本一致。【结论】差异表达基因广泛涉及到糖、蛋白质、核酸等生物大分子代谢、次生代谢和能量代谢等过程;Sn RK2和PAL可能在干旱胁迫下调节种子的萌发。     

幼虫、青年和成年日本医蛭不同生长阶段差异表达基因比较分析

【目的】筛选出调控日本医蛭生长发育的相关基因,揭示其生长发育、繁殖和抗凝分子机制,为后期开展日本医蛭养殖、生长发育及相关功能基因研究提供科学依据。【方法】以幼虫期（孵化10 d以内,HNL）、青年虫期（孵化后2个月左右,HNY）和成年虫期（孵化后2年左右,HNA）的日本医蛭为研究对象,利用Illumina HiSeq 4000平台对构建的cDNA文库进行转录组测序,按错误发现率（FDR）<0.05和|log₂ FC|>1的原则筛选差异表达基因（DEGs）,并进行GO功能注释分析和KEGG信号通路富集分析。【结果】使用3个时期的样本构建24个cDNA文库,共产生541124257条原始序列（Raw reads）,经Fastp质量控制及RNA-Seq组装,共获得20430个mRNAs转录本,并注释出88个新的mRNAs转录本。通过对日本医蛭不同生长阶段进行两两对比,共获得1348个差异表达基因,其中,在幼虫期—青年虫期（HNL vs HNY）中获得238个差异表达基因,在幼虫期—成虫期（HNL vs HNA）中获得976个差异表达基因,在青年虫期—成虫期（HNY vs HNA）中获得763个差异表达基因。幼虫期—成虫期的差异表达基因主要富集蛋白水解、肌球蛋白复合体、细胞骨架、几丁质代谢过程及对伤害的反应等GO功能条目上,以及苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸生物合成、丙烯酰胺转移酶等KEGG信号通路上。说明日本医蛭幼虫在生长过程中大量摄食并通过消化、代谢和合成物质为自身发育提供能量,而成年日本医蛭发育成熟后与其生长发育相关的代谢过程下调,且已适应环境,对于环境刺激的敏感度也有所降低。【结论】在幼虫期—成虫期（HNL vs HNA）获得的976个差异表达基因中,上调差异表达基因主要与肌肉发育相关,而与性腺发育或产卵调节及神经发育相关的差异表达基因具有明显周期特异性,其表达变化均与日本医蛭的生长发育有关。水蛭素和抗凝相关基因在青年期高表达,因此开展水蛭抗凝血能力研究时宜选用青年日本医蛭。     

卵形鲳鲹卵巢不同发育时期的转录组测序分析

【目的】鉴定筛选出与卵形鲳鲹卵巢发育相关的候选基因及信号通路,为揭示其卵巢性成熟过程的分子机制打下基础。【方法】挑选卵巢发育处于?期和Ш期的雌性卵形鲳鲹,分别构建卵形鲳鲹卵巢?期和Ш期的cDNA文库,采用Illumina HiSeqTM 2500进行转录组测序,经过滤、质量控制及拼接组装后获得的Unigenes在七大数据库（Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG和GO）中进行比对;通过FPKM及DEGseq筛选出差异表达基因,以GOseq和KOBAS对差异表达基因分别进行功能注释及信号通路富集分析,并采用MISA和GATK3进行SSR鉴定及SNP分析。【结果】卵形鲳鲹卵巢组织转录组测序获得的325156432条Raw reads,经过滤筛选得到317206752条Clean reads,拼接组装后得到59554条Unigenes;69.65%的Unigenes在Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG和GO等七大数据库中注释成功,其中有24599条Unigenes被注释到GO数据库,15997条Unigenes被注释到KEGG数据库。在卵形鲳鲹卵巢组织的2个发育时期共鉴定获得56115个基因,经差异表达分析后获得17737个差异基因,其中8169个基因在卵巢Ш期上调表达、9568个基因在卵巢Ш期下调表达。GO功能注释分析发现,卵形鲳鲹卵巢差异表达基因主要注释在细胞过程、氮化合物代谢过程、初级代谢过程、核、核部分、离子结合及水解酶活性等条目上;而KEGG信号通路富集分析结果显示,17737个差异表达基因显著富集在318条代谢途径上,其中前20条KEGG信号通路包括2-氧代羧酸代谢、PI3K-Akt信号通路、甲状腺激素信号通路、磷脂酶D信号通路、Fc εRI信号通路和细胞周期等。卵形鲳鲹卵巢转录组（59554条Unigenes）中共存在30133个SSRs和82490个SNPs。【结论】GnRHR、FSHR、FSHβ、CYP11A、SIRT3和PEG3等差异表达基因及PI3K-Akt信号通路和VEGF信号通路等与卵形鲳鲹卵巢的发育密切相关,共同调节卵巢的发育与成熟,在卵巢性成熟过程中发挥重要作用。     

基于转录组测序筛选影响从江香猪产仔数的候选基因

【目的】筛选出影响从江香猪产仔性状的基因调控网络,揭示其繁殖分子机理,为后期开展从江香猪繁殖性能研究及良种选育提供理论依据。【方法】以高产仔家系（平均产仔数≥12头,遗传稳定）和低产仔家系（平均产仔数8～10头,遗传稳定）从江香猪为研究对象,选择初情期不同产仔家系从江香猪卵巢组织各3个,使用Illumina HiSeqTM 2000测序仪进行转录组测序（RNA-Seq）,并对筛选获得的差异表达基因进行GO功能富集分析及KEGG信号通路富集分析,以寻找与从江香猪产仔数相关的基因调控网络。【结果】从高产仔家系和低产仔家系从江香猪卵巢组织中测序获得的纯净序列（Clean reads）均超过5000万条,且有96.00%以上的Clean reads能比对上猪参考基因组。以|log₂FC|≥1.0且P<0.01为标准,筛选获得高产仔家系和低产仔家系从江香猪卵巢组织差异表达基因212个,其中上调表达基因138个、下调表达基因74个。采用实时荧光定量PCR对随机选择的10个差异表达基因进行定量分析,发现OSAP、MSMB、FGFBP1、RLN、HAS1和PLBD1基因在高产仔家系从江香猪卵巢中的相对表达量显著高于低产仔家系从江香猪（P<0.05,下同）,而EDG7、PTX3、BSP1和MRO基因在低产仔家系从江香猪卵巢中的相对表达量显著高于高产仔家系从江香猪,与RNA-Seq测序结果一致。212个差异表达基因共富集在48个GO功能条目上,包含分子功能（Molecular function）、生物学过程（Biological process）和细胞组分（Cellular component）;经KEGG信号通路分析发现共有70个差异表达基因注释到特定的代谢信号通路上,其中显著性富集的KEGG信号通路有类固醇生物合成通路（Steroid biosynthesis）、钙信号通路（Calcium signaling pathway）、卵巢类固醇生成通路（Ovarian steroidogenesis）、心肌细胞肾上腺信号通路（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）和肥厚型心肌病通路（Hypertrophic cardiomyopathy,HCM）。在卵巢类固醇生成通路上发现SCARB1、STAR、COX2、CYP11A、CYP17A、17βHSD和CYP19A等7个基因与从江香猪的繁殖性能存在密切联系。【结论】从江香猪卵巢类固醇生成通路上的STAR、CYP11A、CYP17A、17βHSD和CYP19A基因与其发情排卵密切相关,于发情期上调表达能促进卵泡发育成熟及类固醇激素合成,通过增加排卵数量而促使从江香猪表现高产,故可作为从江香猪繁殖性状的候选基因。     

贵紫麦1号籽粒色素形成相关基因的差异表达

【目的】探明贵紫麦1号小麦灌浆期变紫后和变紫前2个时期籽粒的转录组差异,发掘影响贵紫麦1号花青素合成的关键基因和关键酶,丰富小麦籽粒色素转录组数据信息,为转录因子的克隆及表达提供参考。【方法】利用Illumina Hiseq 2000TM高通量测序技术对贵紫麦1号籽粒变紫前和变紫后2个时期进行转录组测序、文库构建及建库质量评估,对测序结果进行信息学分析。采用TTM对read count数据进行标准化处理,随后用DEGseq进行差异分析,设定q-value0.005且|log2(fold change)|1为阈值。通过筛选分析,获得两者间差异表达基因,按照无参转录组分析方法,对差异表达基因进行BLAST搜索,Nr数据库比对,GO功能富集及KEGG pathway分析,找出与花青素相关的关键基因和关键酶,并结合q RT-PCR验证所找到的关键基因及关键酶在不同时期的表达水平,掌握这些关键基因的信息。【结果】测序结果表明,贵紫麦1号变紫后和变紫前分别获得13.36 G和12.69 G的clean bases,clean reads为106 906 108条和101 547 534条,占原始序列的93.73%和94.90%。通过Trinity软件对所得clean reads进行拼接,共获得170 396条转录本,长度为119 020 625。拼接clean reads后获得119 572条Unigenes。在BLAST搜索中,119 572个高质量独特序列中有86 004条(71.92%)Unigenes与现有基因模型具有至少1个显著匹配。在Nr数据库比对结果鉴定了至少5种具有与来自节节麦、乌拉尔图小麦、二穗短柄草、大麦、小麦等已知基因同一性且序列相似性高的Unigenes。KOG数据库比对结果显示,注释成功的基因按KOG的26个group进行分类,注释在一般功能基因,蛋白质翻译后修饰与转运、分子伴侣及翻译、核糖体结构与生物合成等类别基因所占比重较大,分别为15.79%、14.51%和10.54%。643个差异基因中,236个呈上调趋势,407个呈下调趋势。GO注释表明,按照基因参与的生物过程、所处的细胞组分、具有的分子功能下一层级分类,共44个分类,差异基因显著富集在碳水化合物代谢过程(GO:0005975,16.03%)、应激反应(GO:0006950,10.83%)和水解酶活性分子功能(GO:0016787,34.84%)等类别中。KEGG pathway富集分析可知,353个差异基因富集到153条相关通路上,其中淀粉与蔗糖代谢、苯丙素生物合成、类黄酮生物合成等通路富集显著。类黄酮生物合成途径相关基因共66个,2条相关上调表达Unigenes,涉及查尔酮酶、隐色花色素双加氧酶2个关键酶基因,log2(fold change)分别为3.4164和2.1258。对所得关键基因进行q RT-PCR验证,证实查尔酮酶、隐色花色素双加氧酶在贵紫麦中1号中表达量呈明显上调趋势,与转录组测序分析结果一致,测序结果可靠度高。【结论】比较分析贵紫麦1号籽粒变紫后和变紫前2个时期转录组测序结果,获得大量Unigenes数据及差异表达基因相关信息,明确类黄酮代谢途径中2个关键酶基因(CHS和ANS)在调控贵紫麦1号籽粒花青素合成过程中作用显著。     

不同桑树品种响应干旱胁迫的比较转录组学分析

【目的】发掘响应干旱胁迫的关键抗旱基因,从转录水平上揭示桑树的抗旱分子机制,为后续开展桑树分子抗旱性育种工作提供科学依据。【方法】以干旱敏感性品种德果1号和耐旱性品种湖桑32号为研究对象,通过盆栽种植方式开展干旱胁迫及复水处理试验,采集24个桑叶样本提取总RNA后构建cDNA文库,在Illumina HiSeqTM 4000测序平台上进行高通量测序,并结合生物信息学对相关基因进行注释分析。【结果】经转录组测序,各样本的Clean reads范围为45723096~67280168条,有效碱基数（Clean bases）集中在6.86~10.09 Gb,GC含量在44.84%~46.48%（平均为45.61%）,Q30在90.36%~93.07%。差异表达基因（DEGs）筛选结果显示,6个差异分组（A2 vs A1,B2 vs B₁,A3 vsA1,B3 vs B₁,A4 vs A1,B4 vs B₁）分别筛选出3510、3399、5677、5507、5124和2734个差异表达基因;经干旱胁迫处理后,桑叶功能组基因中呈下调表达的差异表达基因明显多于呈上调表达的差异表达基因,说明桑树在生长过程中存在不同的功能基因以控制桑叶生长发育。不同抗旱性桑叶转录组测序数据中以涉及生物学过程的差异表达基因最多,且主要集中在小分子代谢过程（Small molecule metabolic process）、跨膜运输（Transmembrane transport）及碳水化合物代谢过程（Carbohydrate metabolic process）等方面;与分子功能相关的差异表达基因次之,主要涉及转移酶活性（Transferase activity）和水解酶（Hydrolase activity）等。干旱胁迫下不同抗旱性桑叶差异表达基因主要富集到59条KEGG信号通路上,可划分为代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程和生物系统五大信号通路;其中,抗旱性桑树品种通过提高能量代谢、碳水化合物代谢、增强光合作用及脂质代谢来更好地适应干旱胁迫。综合GO功能注释分析和KEGG信号通路富集分析,得到以下可能与干旱相关的基因: LOC21410404、LOC21404884、LOC21409623、LOC21401352、LOC21398977、LOC21388561、LOC21401447、LOC21398764、LOC21385254、LOC21384661、LOC-21410404及LOC21408971。【结论】不同桑树品种的耐旱性存在显著差异,其中抗旱性桑树品种是通过提高能量代谢、碳水化合物代谢、脂质代谢及光合作用共同应对干旱胁迫。     

基于RNA-Seq的稻瘟病菌Δznf1突变体的表达谱分析

【目的】稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的水稻稻瘟病是威胁全球水稻生产的重要病害之一,而该菌附着胞介导的侵染又是病害循环的重要环节。在前期的研究中发现一个编码C_2H_2锌指结构的转录因子基因ZNF1,参与稻瘟病菌附着胞形成、穿透和致病过程,论文旨在从转录水平上了解受Znf1调控的基因及其调控机理,为深入研究稻瘟病菌致病分子机理提供基础数据。【方法】利用RNA-Seq技术对稻瘟病菌野生型菌株Guy11和突变体Δznf1的营养菌丝体进行表达谱测序,采用FPKM法计算基因表达量,以FDR≤0.001且log2 ratio(Δznf1/Guy11)≥1为筛选标准,获得Δznf1中差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs);通过与Gene Ontology(GO)数据库和KEGG Pathway数据库比对,获得差异基因可能的生物学功能和参与的分子调控途径。为了更详细地研究受Znf1调控的基因,在同样的条件下,利用RNA-Seq技术对稻瘟病菌丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)编码基因PMK1的缺失突变体进行表达谱分析,通过对Δznf1和Δpmk1中的差异表达基因进行比较,筛选受Znf1和Pmk1共同调控的基因,并与前人的研究数据比较,分析获得在稻瘟病菌附着胞发育阶段上调表达但在Δznf1和Δpmk1中同时下调表达的基因。【结果】与野生型Guy11相比,Δznf1中共有709个差异表达基因,其中上调表达的有299个,下调表达的有410个;GO功能富集分析显示差异表达基因归类到生物学过程、细胞组分和分子功能上的基因数目分别有118、299和308个;KEGG Pathway富集分析显示,这些差异表达基因主要参与代谢途径、次生代谢物质生物合成、甘油磷脂代谢等。一些已知的稻瘟病菌致病相关基因,如LPP3、HOX7、PBS2、MPG1等,在Δznf1中表达水平下调。与Δpmk1中差异表达基因比较发现,Δznf1中约56%的差异表达基因同时也受Pmk1调控。其中,编码isotrichodermin C-15羟化酶的3个基因MGG_03825、MGG_02329和MGG_08498,在Δznf1和Δpmk1中的表达水平均显著下调。此外,在附着胞阶段上调表达的48个基因,在Δznf1和Δpmk1中同时下调表达,表明这些与附着胞形成可能相关的基因直接或间接受Znf1和Pmk1调控。采用q RT-PCR方法随机检测10个基因的表达情况,结果与RNA-Seq数据基本一致,说明本试验RNA-Seq数据的可靠性。【结论】RNA-Seq分析获得了受Znf1调控的基因信息和可能的生物学功能。一些与稻瘟病菌致病相关的基因受Znf1调控。此外,与Pmk1类似,一些在附着胞阶段上调表达的基因也同时受Znf1调控。结果可为进一步研究Znf1下游基因调控网络提供信息。