哲罗鲑雌性蛋白的研究

采用柱层析、蛋白质免疫印迹和电泳等方法,对哲罗鲑Hucho taimen的雌性蛋白进行了系统研究。结果表明：哲罗鲑血清和卵黄中均存在雌性蛋白,其雌性蛋白的性质相同,均为糖脂磷蛋白;与血清雌性特异蛋白一样,卵黄雌性特异蛋白的相对分子质量也为460 000,由相对分子质量分别为137 800、84 200和10 800的3个亚基组成,等电点为5.60;卵黄雌性蛋白的兔抗血清均与哲罗鲑雌性血清发生免疫反应,不与雄性血清发生免疫反应,表明这两种蛋白均具有雌性特异性;两种蛋白的抗血清可以相互检测,表明哲罗鲑雌鱼血清中雌性蛋白与卵黄中的雌性蛋白在免疫原性上和结构上具有较高的同源性。     

黄颡鱼仔鱼卵黄蛋白ELISA检测方法研究

【目的】建立黄颡鱼仔鱼(Pelteboagrus fulvidraco)卵黄蛋白的ELISA检测方法,探讨黄颡鱼仔鱼体内卵黄蛋白含量的发生规律及仔鱼投喂生物饵料的最佳时间,为研究黄颡鱼仔鱼早期营养和开口饵料提供依据。【方法】以黄颡鱼仔鱼为试验材料,卵黄蛋白抗血清为抗体,纯化的卵黄蛋白为抗原,建立间接竞争酶联免疫吸附反应(ELISA)检测方法,测定黄颡鱼仔鱼卵黄蛋白在不同发育时期(破膜43,48,57,65,72,81,89,96,105,113,120和129h)的变化情况。【结果】黄颡鱼仔鱼卵黄蛋白ELISA检测中,抗血清的最佳稀释倍数为1∶20 000倍,包被抗原的最佳质量浓度为125ng/mL,最适检测质量浓度为20～2 000ng/mL,批内变异系数为6.529%,批间变异系数为6.873%。利用建立的ELISA方法检测发现,黄颡鱼卵黄蛋白含量随发育时间的延长而逐渐递减,至96h时缓慢下降直至消失。【结论】利用ELISA方法能相对准确地检测黄颡鱼仔鱼卵黄蛋白含量的变化,破膜96h是黄颡鱼仔鱼由内源营养阶段转向外源营养阶段的转折点,此时开始投喂适口的生物饵料更有利于黄颡鱼仔鱼开口摄食及生长发育。     

鲢鱼体内卵黄蛋白原ELISA试剂盒的研制

以鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)为抗原,卵黄蛋白原抗血清为抗体,建立了检测鲢鱼体内卵黄蛋白原的间接酶联免疫吸附反应(ELISA)方法,组装卵黄蛋白原ELISA试剂盒,并对其性能进行鉴定。结果表明,建立的ELISA间接法检测浓度为6.1~396.0 ng/m L,灵敏度为6.1 ng/m L,且在该范围内标准曲线线性良好;稳定性试验结果表明,在系列抗原标准品中添加1%蔗糖、20%甘油和0.000 5%Mg Cl_2时,试剂盒在37℃条件下放置7 d,其标准曲线灵敏度和线性基本保持不变,说明筛选的该稳定剂配方对ELISA试剂具有良好的保护作用。     

利用基因工程抗体建立的新型双抗夹心ELISA法检测Cry1Ac毒素

为明确新型双抗夹心ELISA方法检测Cry1Ac毒素的效果,分别用纯化后的抗Cry1Ac单链抗体和anti-Cry1Ac兔多克隆血清(Anti-Cry1Ac-PAbs)作为捕获抗体和检测抗体,通过方阵滴定确定其最佳工作浓度,建立双抗夹心ELISA法。再用优化后的双抗夹心ELISA方法对检测Cry1Ac毒素的敏感性、特异性和回收率进行鉴定。结果表明,新型双抗夹心ELISA法最低检测限为0.91 ng/ml,线性检测范围为1.04 ng/ml~3.49μg/ml。5种稻米中Cry1Ac毒素的平均回收率为69.42%~87.95%,变异系数为1.19%~6.50%。     

大草蛉卵黄发生的动态分析

用蒸馏水沉淀法提取大草蛉(Chrysopa septempunctata Wesmael)的卵黄蛋白，免疫家兔，并将所得抗血清经雄虫匀浆液吸收，获得抗卵黄蛋白的特异抗体，经纯化后，用辣根过氧化物酶标记抗体。采用酶联免疫测定(ELISA)直接法，系统测定了大草蛉成虫期脂肪体、血淋巴和卵巢中卵黄蛋白的动态变化。结果表明：脂肪体是卵黄原蛋白合成的场所，卵黄原蛋白的合成始于羽化后第4d；脂肪体、血淋巴中卵黄原蛋白的滴度在羽化后第4d开始迅速上升，至成虫期的第7d达到高峰期；在羽化后第4d的卵巢中可以检测到卵黄蛋白，此后其含量迅速上升，到成虫期的第7d达到高峰期。经SDS—PAGE分析，结果表明：大草蛉的卵黄蛋白由165kD和46kD的大小2个亚基组成。     

双抗体夹心ELISA法检测海产蟹血卵涡鞭虫方法的初步建立

以针对血卵涡鞭虫的特异性单克隆抗体为捕获抗体,纯化的抗血卵涡鞭虫的兔抗血清为检测抗体,初步建立了检测血卵涡鞭虫的双抗体夹心ELISA方法。方阵滴定确定最佳反应条件：包被的单克隆抗体浓度为10μg/mL,多抗兔血清工作浓度为14.3μg/mL,待检样品稀释度为1：800;HRP-羊抗鼠IgG按1∶20 000稀释。用建立的ELISA方法对86份已知背景样品进行检测,阳性检出为97.6%,血卵涡鞭虫抗原检测的灵敏度为100 pg/mL;与蟹血淋巴细胞、假丝酵母菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌等样本均无交叉反应。结果表明,建立的双抗体夹心ELISA方法灵敏度高、特异性强,可用于诊断梭子蟹乳化病血卵涡鞭虫病的检测。     

兔抗2,4-D多克隆抗体的制备

采用水溶性碳化二亚胺法(EDC),将2,4-D与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共价偶联,分别合成免疫原2,4-D-BSA和包被原2,4-D-OVA,经紫外分光光度计扫描鉴定。用合成的免疫抗原免疫新西兰大白兔,并用合成的包被原进行ELISA试验对抗血清进行定性定量测定,结果表明,获得的抗血清效价达1.6×105。用所制备的抗血清建立间接竞争ELISA方法。优化了ELISA的工作条件,方阵测定确定了包被抗原最佳浓度(5μg/mL),抗血清最佳稀释度(1∶50 000),并建立了ELISA标准工作曲线。工作曲线表明在50~2 000ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系,该法检测底限为50 ng/mL。     

丽蝇蛹集金小蜂卵黄原蛋白合成与摄取及卵黄磷蛋白降解的时间动态

采用ELISA测定法检测了蝇类蛹期外寄生蜂-丽蝇蛹集金小蜂卵黄原蛋白合成与摄取,及卵黄磷蛋白降解的时间动态.结果表明:该蜂卵黄原蛋白的合成与摄取分别起始于寄生后的第10 d和第13 d,即正处于该蜂的蛹初期和隐成虫期;胚胎内的卵黄磷蛋白随其发育过程而降解,寄生后第3 d,即胚胎发育结束时则全部降解完毕.此外,还探讨了卵黄蛋白合成、摄取和降解过程中,血淋巴、卵巢或卵内可溶性蛋白含量的的时间动态变化.     

兔抗灭多威多克隆抗体的制备

根据灭多威结构特征将其改造成的新半抗原,分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共价偶联作为免疫原和包被原进行抗体制备及ELISA试验,抗血清效价达2.56×105。建立了间接竞争ELISA方法并优化了工作条件,方阵测定确定了包被抗原最佳浓度为10μg/ml,抗血清最佳稀释度为1∶51 200,建立了ELISA标准工作曲线,表明在50~5 000 ng/ml浓度范围内抑制率与灭多威浓度的对数值呈线性关系,检测限为100 ng/ml。     

褐飞虱抗原检测最佳ELISA条件的建立

应用褐飞虱单克隆抗体3B2和4B8比较了直接、间接和多种抗体夹心ELISA方法.结果表明:当拟环纹豹蛛稀释512倍(含拟环纹豹蛛0.04 mg/mL)时,直接和间接ELISA的OD值比阳性对照仍降低5%以上.而当捕食者稀释100倍时,对同种单抗、异种单抗和两种单抗混合夹心ELISA检测OD值的影响均小于5%.在加入100倍豹蛛稀释液时,3种抗体夹心ELISA检测灵敏度均为16.90 ng/mL(1/17509头褐飞虱雌成虫),直接和间接ELISA分别为:67.59 ng/mL (1/4378头)和135.18 ng/mL (1/2189头).建立了4B8稀释1000倍(28.13 μg/mL),捕食者匀浆液定容至1 mL/头后再稀释100倍,HRP-4B8稀释4000倍(1.04 μg/mL)的夹心ELISA用于检测捕食者肠道中的褐飞虱抗原.在此系统下,检测灵敏度为每头拟环纹豹蛛含1.69 μg猎物蛋白(1/175头褐飞虱雌成虫),非目标抗原的影响小于5%.     

哲罗鱼胚胎和仔鱼发育的研究

用活体观察和固定观察两种方法,首次对哲罗鱼Hucho taimen胚胎和仔鱼发育进行了系统观察,描述了哲罗鱼早期发育过程.哲罗鱼受精卵为沉性端黄卵,呈圆球形,含有大量卵黄,卵色呈桔黄色,吸水膨胀后卵径为(5.55±0.15)mm.在水温为4.8～9.0℃下,受精卵历时839 h破膜,初孵仔鱼全长为(18.45±0.32)mm,卵黄囊体积为(0.074±0.009)cm3,经过60 d左右仔鱼发育基本完成.将哲罗鱼与几种鱼类进行了对比,探讨其卵径、孵化平均水温与破膜所需时间及初孵仔鱼大小之间的关系.     

利用AFLP技术筛选与哲罗鱼Hucho taimen(Pallas)性别相关的分子标记

利用AFLP技术,分析比较雌雄哲罗鱼Hucho taimen(Pallas)之间的遗传差异。采用两个酶切组合,共45对引物组合对雌雄个体进行扩增。结果表明,电泳检测条带清晰丰富,两个酶切组合分别扩增出958和971个位点,多态性比例分别在4.76%～62.26%和6.98%～37.50%,15个位点在雌雄个体中的比例存在很大差异,聚类分析结果显示雌鱼聚在一起,雄鱼聚在一起,未发现雌雄特异位点。研究积累了大量AFLP分析数据,可为哲罗鱼性别的进一步研究奠定基础。     

哲罗鱼AFLP技术体系建立的研究

以哲罗鱼为材料提取DNA,采用两组限制性内切酶组合酶切基因组,并对酶量、酶切时间、扩增时稀释倍数及镁离子的浓度进行优化,结果表明200 ngDNA用4 U的EcoRI和PstI在37℃酶切4 h后,再分别用4 U的Tru9I和TaqI在65℃酶切4 h后用3 U的T4连接酶连接3 h,进行预扩增,预扩增产物稀释100倍后选择扩增效果最佳,得到了清晰稳定的扩增图谱;并对两组酶切组合的扩增结果进行了比较,结果显示EcoRI、Tru9I酶切组合扩增的条带数要多于PstI、TaqI酶切组合扩增的条带数,但后者的多态性要高于前者。本研究为采用该技术对哲罗鱼基因组的研究提供了参考。     

几种添加剂对哲罗鲑生长和血液生化指标的影响

将哲罗鲑Hucho taimen在室内玻璃钢水族箱中用流水饲养，研究了小肽、柠檬酸、氯化钠和大蒜素对哲罗鲑（6．35g±0．21g）摄食、生长、体成分和血清生化指标的影响。养殖周期为56d，水温9．2—14．1℃。结果表明：在基础饲料中添加质量分数为1％的小肽后，显著提高了哲罗鲑的增重率和特定生长率（P〈0．05），血清总蛋白、白蛋白和球蛋白含量也显著升高（P〈0．05），而体成分与对照组差异不大（P〉0．05）；饲料中添加质量分数为0．5％柠檬酸和1．0％氯化钠对哲罗鲑摄食率、增重率和特定生长率影响不显著（P〉0．05），0．5％柠檬酸组哲罗鲑血清甘油三酯、胆固醇和高密度脂蛋白较对照组显著降低（P〈0．05）；饲料中添加25mg／kg大蒜素显著降低了哲罗鲑的摄食率、增重率和特定生长率（P〈0．05），鱼体水分升高（P〈0．05），粗蛋白和粗脂肪降低（P〈0．05），血清生化指标变化不显著（P〉0．05）。     

哲罗鱼仔稚鱼嗅囊发育及其与摄食强度的关系

为掌握哲罗鱼Hucho taimen仔稚鱼嗅囊的发育过程及其与摄食强度的关系,对哲罗鱼仔稚鱼嗅囊发育进行了组织形态学观察,研究了嗅囊发育与摄食强度之间的对应关系,描述了各发育时期的时序和形态特征。结果表明:初孵哲罗鱼仔鱼嗅囊上皮未分化,消化道未有食物充塞度;25~26日龄仔鱼仅有少数个体(11.1%)消化道有一定的食物充塞度(1级);27日龄仔鱼多数个体(占66.7%)开始少量摄食,此时嗅囊上皮仍未分化;29日龄仔鱼均摄食,消化道食物充塞度达到2级和3级的个体分别占44.4%和33.3%;30日龄仔鱼嗅囊上皮从嗅囊基部开始分化;42日龄稚鱼上皮分化更加明显,细胞分化加剧,此时嗅囊上皮分化;45日龄稚鱼均强烈摄食,消化道食物充塞度等级均达到5级,此时嗅囊上皮分化完成;55日龄稚鱼嗅囊形成第一个初级嗅板;85日龄稚鱼嗅囊分化完成,通过光镜和电镜观察,嗅上皮细胞可分为6类,即基细胞、支持细胞、纤毛非感觉细胞、纤毛感觉细胞、柱状细胞和黏液细胞。本研究结果可为哲罗鱼资源的保护和苗种培育提供理论依据。     

乌苏里江上游虎头江段哲罗鱼种群结构及生长特性

2002、2003年春、秋李对乌苏里江上游虎头江段哲罗鱼种群结构、生长特性进行了调查研究,通过对339尾样本分析,得其叉长、体重和年龄组成及生长情况：乌苏里江上游虎头江段哲罗鱼种群结构合理,种群生殖群体、补充群体较大,有利于资源的增殖和恢复。叉长与体重关系r=0．9958,生长拐点年龄t=16．5,拐点体重W=3714．71g。性成熟年龄：雌性为6^ 龄,雄性为5^ 龄,性比(9：6)为113：1。叉长、体重的相对增长率8^ 龄以下增长较大,生长比速、生长常数、生长指标与之表现出相同的规律性,表明乌苏里江上游哲罗鱼8^ 龄之前生长旺盛,以后虽然生长较8^ 龄之前减慢,但仍保持较快的生长特性。     

3种麻醉剂对哲罗亲鱼麻醉效果的比较

为寻找哲罗(Hucho taimen,Pallas)亲鱼在标志、催产注射、挤卵(精)时安全与有效的麻醉方法,本试验比较了三氯叔丁醇、丁香油和苯氧乙醇3种麻醉剂对哲罗亲鱼的麻醉效果。试验结果显示:(1)三氯叔丁醇,入麻时间和恢复时间均较长,可达到深度麻醉期;丁香油,入麻时间短,不能达到深度麻醉期,触觉恢复快,完全恢复所需时间较长;苯氧乙醇,入麻时间短,恢复也快,可达到深度麻醉期。(2)3种不同质量分数(0.1‰,0.3‰,0.5‰)的苯氧乙醇麻醉亲鱼的恢复时间y(s)与暴露时间x(s)之间可用线性方程表示,依次为:y1=24.5x+65.9,(R2=0.990 3,60≤x≤300);y3=26.5x+82.3,(R2=0.976 1,60≤x≤300);y5=55.5x+176.0,(R2=0.999 8,60≤x≤300)。试验结果表明,在本实验中,苯氧乙醇是哲罗亲鱼进行标记、催产注射、挤卵(精)等操作的合适麻醉剂,其安全效用范围为0.1‰~0.3‰,建议最佳剂量质量分数为0.3‰。     

哲罗鱼人工育苗技术研究

采捕野生乌苏里江哲罗鱼(Hucho taimen Pallas)幼鱼,在流水池塘中培育至性腺成熟,进行人工繁殖和育苗技术的研究.结果表明:注射催产激素HCG、S-GnRH-A和DOM的混合制剂可促使成熟的亲鱼排卵,(9±2) ℃水温药物的效应时间在8～11 d.哲罗鱼的受精卵,为圆形、淡黄色,卵膜较软,无粘性.7 ～9 龄鱼的卵径为4.20～5.56 mm[平均(4.98±0.33) mm];吸水膨胀后的卵径为4.32～5.76 mm[平均(5.20±0.38) mm],增大约0.2 mm.6～12 kg的雌性亲鱼绝对产卵量为4 500～14 000粒/尾,相对产卵量1 000～1 200 ind/kg.哲罗鱼人工繁育的催产率、发眼率和仔鱼上浮率平均为87.5%、83.5%和86.4%.从卵受精到破膜需28～31 d[平均(29.3±1.3) d],完全出苗需38～41 d[平均(38.5±1.0) d],仔鱼上浮需56～58 d[平均(57.1±0.9) d].鱼苗驯化依次投喂水蚤→水蚤、水丝蚓→水丝蚓→水丝蚓、软颗粒饲料→软颗粒饲料→软颗粒饲料、硬颗粒饲料→硬颗粒饲料,可从动物性饵料转化为人工配合颗粒饲料喂养.人工养殖条件下,仔鱼体长与日龄的回归方程为L=1.9623e0.0219t,(R2=0.9507,n=30),稚鱼体长与日龄的回归方程为L=2.6877e0.0119t,(R2=0.9943,n=30),1龄鱼的平均体长为(16.2±0.93) cm,体重为(28.45±2.98) g.     

哲罗鱼人工育苗技术研究

采捕野生乌苏里江哲罗鱼(Hucho taimen Pallas)幼鱼,在流水池塘中培育至性腺成熟,进行人工繁殖和育苗技术的研究.结果表明:注射催产激素HCG、S-GnRH-A和DOM的混合制剂可促使成熟的亲鱼排卵,(9±2) ℃水温药物的效应时间在8～11 d.哲罗鱼的受精卵,为圆形、淡黄色,卵膜较软,无粘性.7 ～9 龄鱼的卵径为4.20～5.56 mm[平均(4.98±0.33) mm];吸水膨胀后的卵径为4.32～5.76 mm[平均(5.20±0.38) mm],增大约0.2 mm.6～12 kg的雌性亲鱼绝对产卵量为4 500～14 000粒/尾,相对产卵量1 000～1 200 ind/kg.哲罗鱼人工繁育的催产率、发眼率和仔鱼上浮率平均为87.5%、83.5%和86.4%.从卵受精到破膜需28～31 d[平均(29.3±1.3) d],完全出苗需38～41 d[平均(38.5±1.0) d],仔鱼上浮需56～58 d[平均(57.1±0.9) d].鱼苗驯化依次投喂水蚤→水蚤、水丝蚓→水丝蚓→水丝蚓、软颗粒饲料→软颗粒饲料→软颗粒饲料、硬颗粒饲料→硬颗粒饲料,可从动物性饵料转化为人工配合颗粒饲料喂养.人工养殖条件下,仔鱼体长与日龄的回归方程为L=1.9623e0.0219t,(R2=0.9507,n=30),稚鱼体长与日龄的回归方程为L=2.6877e0.0119t,(R2=0.9943,n=30),1龄鱼的平均体长为(16.2±0.93) cm,体重为(28.45±2.98) g.