小鼠精子体外培养过程中Ca~(2+)对微管蛋白乙酰化的影响

微管蛋白的乙酰化作用对细胞代谢过程,维持细胞的稳定性及运动性具有特殊作用,而有关哺乳动物精子蛋白乙酰化修饰的研究报道较少,且成熟精子蛋白乙酰化作用机制尚未明确。本研究利用精子活力参数计算机辅助检测(CASA)技术、蛋白免疫印迹(WB)以及免疫荧光等实验技术,分析测定小鼠精子体外培养过程中,不同浓度Ca2+以及HCO-3、环腺苷酸(dbcAMP)等精子获能调节因子对微管蛋白乙酰化的影响。结果表明,小鼠精子中分子量约为55、37、26kDa微管蛋白发生乙酰化修饰,获能培养后微管蛋白乙酰化程度明显高于未获能培养;钙离子对精子运动能力以及微管蛋白乙酰化修饰起双重调节作用,低浓度Ca2+(≤2.0mmol/L)促进精子活力及微管蛋白乙酰化(P0.05),而高浓度Ca2+(4.0mmol/L)明显抑制精子活力MOT(48.88%)、曲线运动速度VCL(99.46μm/s)及微管蛋白乙酰化(P0.05);加入钙离子级联信号调节因子钙调蛋白抑制剂(W7)和钙调蛋白激酶抑制剂(KN-93),能有效缓解高浓度Ca2+(4.0mmol/L)对微管蛋白乙酰化的抑制作用,而钙离子载体(A23187)能进一步增强高浓度Ca2+对小鼠精子微管蛋白乙酰化的抑制作用;dbcAMP、异丁基黄嘌呤(IBMX)及PKA抑制剂(H-89)等cAMP-PKA磷酸化信号因子影响微管蛋白乙酰化,但不符合cAMP-PKA磷酸化信号通路调节规律。免疫荧光结果显示乙酰化微管蛋白主要分布在精子尾部的中段和主段,且主段最为明显。本研究提示Ca2+可能通过调节微管蛋白的乙酰化,从而影响精子的活力及受精能力。     

猪精子获能期间蛋白质磷酸化时间依赖性的上调

通过获能猪精子酪氨酸磷酸化蛋白分离和表达,来确定精子获能的最佳状态.将猪精子悬浮于改良的Tris缓冲液(mTBM)获能培养基中,在体积分数为5% CO2孵箱37 ℃培养,以考马斯亮蓝染液染色的方法来评价精子获能状态, 经过SDS-PAGE分离后,进行Western免疫印迹分析,检测获能猪精子间酪氨酸磷酸化蛋白的分布.有27,47 ku的2种蛋白发生酪氨酸磷酸化,其中27 ku的蛋白酪氨酸磷酸化水平自精子体外培养后呈递增趋势,而 47 ku的蛋白酪氨酸磷酸化水平在精子培养1.5 h时最高,后呈递减趋势,1.5 h时获能状态最佳.     

金雀异黄酮对冻融猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及获能相关基因表达的影响

【目的】探究金雀异黄酮对冻融猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及获能相关基因的影响,为丰富猪精子冷冻保存技术的理论基础及后续开展蛋白酪氨酸激酶抑制剂对冻融猪精子获能影响研究提供参考依据。【方法】采集猪精液后,设精液冷冻对照组(CK组)、100.0μmol/L金雀异黄酮冷冻处理组(G组)和鲜精组(F组),使用Western blotting、SDS-PAGE、免疫荧光、ELISA和实时荧光定量PCR等检测各组精子的蛋白酪氨酸磷酸化水平、精子不同部位蛋白酪氨酸磷酸化位点变化情况、蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶G(PKG)活性及黏附蛋白家族基因(AQN1、AQN3、AWN、PSP-Ⅰ和PSP-Ⅱ)和精子运动抑制因子(SPMI)基因mRNA的表达水平,分析金雀异黄酮对冻融猪精子的保护机制。【结果】与CK组相比,G组的32和69 kD蛋白酪氨酸磷酸化水平、顶体+顶体后区磷酸化位点、PKA活性显著降低(P0.05,下同);AWN基因相对表达量极显著升高(P0.01,下同),PSP-Ⅰ基因相对表达量显著降低,PSP-Ⅱ和SPMI基因相对表达量极显著降低。F组中未检测到32和69 kD蛋白酪氨酸磷酸化,而37和58 kD蛋白酪氨酸磷酸化水平和PKA活性显著降低;AQN1、AQN3和AWN基因相对表达量极显著升高,PSP-Ⅱ基因相对表达量显著降低,SPMI基因相对表达量极显著降低。【结论】金雀异黄酮既能降低冻融猪精子顶体+顶体后区蛋白酪氨酸磷酸化水平,且PKA活性降低可能与p32和p69蛋白表达量降低有关,又可有效提高冻融猪精子中AWN基因及有效降低PSP-Ⅰ、PSP-Ⅱ和SPMI基因的表达量,在一定程度上提高冻融猪精子质量。     

钙离子对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及活力影响

研究主要探究钙离子(Ca2+)对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及活力的作用。利用计算机辅助精子活力分析仪(CASA)检测、蛋白免疫印迹测定不同Ca2+浓度对精子活力指标及蛋白酪氨酸磷酸化水平的影响,并对精子样品的酪氨酸磷酸化蛋白的分布情况进行观察。结果显示,当Ca2+浓度≤1.0mmol/L时,精子活力和蛋白酪氨酸磷酸化水平增高;然而,当Ca2+浓度≥3.0mmol/L时,则明显抑制精子活力和蛋白酪氨酸磷酸化水平,尤其分子量约为27和34kDa的高丰度蛋白磷酸化程度明显降低(P0.05)。高浓度Ca2+(4.0mmol/L)明显抑制鞭毛处蛋白酪氨酸磷酸化。因此,细胞外钙离子对猪精子活力和蛋白磷酸化起到重要调节作用,低浓度Ca2+促进精子活力及蛋白酪氨酸磷酸化,高浓度Ca2+(≥3.0mmol/L)抑制精子活力及蛋白酪氨酸磷酸化。本研究初步明确了Ca2+浓度对猪精子蛋白磷酸化及精子活力的影响,为进一步研究精子获能提供参考。     

培养液pH值对小鼠精子体外培养过程中活力及蛋白修饰的影响

为了探究不同pH对小鼠成熟精子体外培养过程中活力参数及蛋白修饰的影响,研究采用不同pH值(6.6~7.8)培养液培养小鼠精子2h,利用计算机辅助精子活力分析仪(CASA)、蛋白免疫印迹(WB)及免疫荧光技术,分析测定小鼠精子活力参数、蛋白修饰的变化情况,并对小鼠精子磷酸化蛋白及乙酰化蛋白进行细胞亚组分定位。结果显示,pH为7.2~7.4时精子能动性(sperm motility,MOT)、平均路径速度(path velocity,VAP)、平均直线运动速度(straight line velocity,VSL)和平均曲线运动速度(curvilinear veiocity,VCL)都有较高值,pH为6.6或7.8时精子活力受到显著抑制(P0.05);培养液的pH为7.4处理组,小鼠精子蛋白磷酸化、乙酰化和琥珀酰化修饰均达到较高水平,无论pH降低(7.2)还是升高(7.4)这些蛋白修饰水平都减弱,与精子活力参数变化趋势一致;免疫荧光定位结果显示,获能组磷酸化蛋白及乙酰化蛋白荧光强度明显高于未获能组,磷酸化蛋白及乙酰化蛋白遍布精子整个鞭毛区域,其中头部核区蛋白乙酰化修饰水平较高。上述研究表明pH值7.2~7.4为小鼠精子体外培养的最适pH值范围,pH值可能通过影响精子体外培养过程中的蛋白磷酸化、乙酰化及琥珀酰化作用调节精子活力及功能。本研究对探究pH值调控哺乳动物成熟精子活力的分子机理及体外培养具有重要意义。     

杜洛克猪精子体外4℃保存过程中活力参数及蛋白修饰变化

为探究体外4℃保存对猪精子活力参数及蛋白修饰的影响,使用猪精液保存稀释液体外4℃保存猪精子7d,利用计算机辅助精子活力分析仪(CASA)分析测定新鲜精液和保存7d后精液的精子活力指标;使用相应试剂盒检测精子中ATP水平及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性;应用蛋白免疫印迹(WB)技术,比较新鲜精液在4℃保存7d后蛋白翻译后修饰水平的变化。结果表明,猪精液体外4℃保存7d后,精子活力参数呈现下降趋势。其中,运动力(MOT)、快速前进性运动速率(PRO)、平均路径速度(VAP)、平均直线运动速率(VSL)与新鲜精液相比分别降低59.99%、37.03%、12.34%、18.97%,且差异显著(P0.05);发现精子中ATP水平和GAPDH酶活性在4℃保存7d后显著降低(P0.05),即随着体外保存时间的延长,精子细胞内的能量供应不足,代谢水平降低;猪精液4℃保存7d后精子蛋白的磷酸化和酰化修饰明显减弱,这一结果与精子活力、代谢酶活性结果的变化趋势一致。研究结果证实,在体外4℃保存条件下,可能因精子细胞内能量代谢受阻而影响了精子活力及蛋白修饰水平。因此,本研究无论对于丰富精子的能量代谢基础理论,还是对于延长猪精液低温保存时间,提高人工授精效率,均具有重要的理论和实践意义。     

不同获能方法对冻融塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影响

为探讨不同获能方法对塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化水平的影响,冻融塔里木马鹿精子随机分为4组,用钙离子载体、肝素、咖啡因和 Percool 离心4种方法进行精子获能的诱导,利用金霉素（CTC）染色法评价精子获能状态,采用 SDS-PAGE 分离精子膜蛋白,进行 Western blotting 免疫印迹分析,检测酪氨酸磷酸化蛋白的表达水平.结果显示,冻融精子经4种精子获能方法处理后,肝素诱发的精子获能率显著高于钙离子载体组和 Percool 组（P ＜0．05）.钙离子载体组、肝素组和咖啡因组精子蛋白酪氨酸磷酸化水平高于 Percool 组和对照组.另外,冻融精子随着上游处理及肝素诱导获能的进行,检测到分子量分别为14,25~30,40,47,55 ku 的酪氨酸磷酸化蛋白,这些蛋白的酪氨酸磷酸化水平在获能60~120 min 期间相对较高,而且此时精子获能率及超激活运动精子比例也显著提高（P ＜0．05）.结果提示,肝素可以较好的诱导马鹿精子获能,马鹿精子获能与蛋白酪氨酸磷酸化相关.     

孕酮诱发马鹿精子顶体反应的研究

以马鹿为试验对象,采用上浮法诱导马鹿精子体外获能,以孕酮(P4)诱导顶体反应,旨在摸索出P4诱发马鹿精子顶体反应的最适宜体系.研究结果表明:0.5～1000μmol/L的P4可提高获能马鹿精子的顶体反应率;其中,1μmol/L与10μmol/L的P4可显著(P<0.05)促进马鹿精子发生顶体反应,并以10μmol/L的P4处理组的顶体反应率最高(74.44±0.71)%.10μmol/L的P4诱导获能马鹿精子顶体反应在10～20min的处理时间内均获得了较高的顶体反应率(均72.41%以上),并以处理10min的顶体反应率最高(78.40%).P4能促进获能马鹿精子的顶体反应,但不能显著(P>0.05)促进未获能马鹿精子的顶体反应.     

Forskolin和促性腺激素对猪卵母细胞体外成熟的影响

利用已建立的猪卵母细胞体外无血清培养模型,研究了猪卵丘-卵母细胞复合体(CEO)在模拟生理环境的培养条件下Forskolin和促性腺激素对猪卵母细胞成熟的作用.在观察卵母细胞减数分裂恢复(GVBD)后的实验结果表明(1)cAMP产生的激动剂凡Forkolin(3μmol@L-1)处理CEO 20h可以显著协同HX抑制卵母细胞成熟;处理40h后,Forskolin(3μmol@L-1)的抑制作用被卵丘细胞分泌的某种物质克服;(2)Forskolin(3μmol L.)短期(30,60,120,240min)处理后可以诱导卵丘细胞分泌某种促进卵母细胞成熟的物质.(3)FSH(50～200U/L)能够诱导卵丘细胞分泌某种物质促进卵母细胞成熟;(4)50U/L的FSH预处理CEO结果与Forskolin结果相同,提示FSH诱导的卵母细胞成熟是通过cAMP依赖性的通路进行的.     

NAC抑制镉离子诱导的小鼠精子DLD酪氨酸磷酸化作用

重金属镉是环境中广泛存在的污染物,对机体生殖系统有很强的毒性作用。镉能诱导精子细胞蛋白二氢硫辛酰胺脱氢酶(DLD)发生酪氨酸磷酸化修饰,但机制尚不清楚。本研究利用蛋白免疫印迹技术探讨镉离子对小鼠生殖系统的毒性作用、镉诱导生殖细胞蛋白发生酪氨酸磷酸化修饰的机理及抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)对精子的保护作用。结果表明,镉离子能减弱生殖细胞的能量代谢水平,从而抑制睾丸的生长发育并导致产仔数下降;镉离子能特异性诱导精子DLD蛋白发生酪氨酸磷酸化修饰,且与钙离子具有协同作用。此外,NAC可在体外有效抑制DLD蛋白发生酪氨酸磷酸化从而抑制镉的生殖毒性,并恢复精子能量水平和活力参数。本研究从NAC抑制镉离子诱导特异性蛋白磷酸化修饰的角度,揭示NAC保护作用机制,旨在为镉离子生殖毒理学研究及疾病防治提供理论基础。     

猎豹精子结构的形态特征及畸形种类

运用扫描电镜和透视电镜对猎豹精子结构进行了系统研究,包括观察猎豹精子生物学特性,比较观察正常精子和畸形精子的形态学结构,为建立猎豹精液品质检查方法提供依据。结果表明:猎豹精子由头、颈、尾3部分构成;精子全长(64.1±11.0)μm;头部长(4.9±0.9)μm;宽(2.5±0.7)μm;颈长(0.5±0.1)μm;尾长(58.7±9.0)μm;其形态与金钱豹和华南虎的精子有所不同。结果还表明猎豹精子畸形发生在头部、颈部、尾部。     

精子提取物对绵羊显微授精受精率及胚胎发育影响的研究

将绵羊精子可溶性撮物与上不运动绵羊精人同注射于体外成熟的绵羊卵母细胞并在体外培养，结果发现，共同注射的卵母细胞卵裂率、２￣１６细胞发育率，桑椹胚发率育，囊胚发育率均显著高于对照组，其中卵母细胞卵裂率和２￣１６细胞发育率还显著高于精子单独注射组；桑椹胚，囊胚发育率明显高于精子单独注射组。     

不同浓度咖啡因对犬精液冷冻效果的影响

为提高犬冷冻精液的冷冻效果,试验向Tris-卵黄基础稀释液中添加不同浓度的咖啡因;结果表明:当所添加的咖啡因浓度为5.0mmoL/L时,精子活率为0.33±0.04(P0.01),显著对照组。添加浓度为12.5mmoL/L时,精子活率仅为0.23±0.04(P0.01),显著对照组。浓度为5.0mmoL/L时精子畸形率最低,为0.174±0.036(P0.01),显著对照组。但添加咖啡因的各组跟对照组在顶体完整率上并无显著差异。     

蟹类精子限制机制研究

为了确保雄蟹在被捕前至少有一次交配机会,在现代的渔业捕捞政策下商业性捕捞雄蟹通常设立最小捕捞规格,而雌蟹一般是被禁止的.最近调查表明,这种单一性捕捞政策的执行,降低了整个蟹类种群的规格,使可操作性率(OSR)向雌蟹偏移,可能造成精子限制.精子限制现象在自然界是存在的,渔业捕捞及蟹类固有的竞争机制加速了造成精子限制的可能.雄蟹的交配频率及规格是造成天然种群精子限制现象的主要原因,而蟹类独特的生殖系统及逐步改变的种群结构则加剧了这种现象.到目前为止,世界上关于经济蟹类精子限制现象机制的研究很多;不过还没有一套完整的理论或模型,无法直接给予和判定在某种捕捞压力下蟹类群体所受精子限制的程度.因此建立蟹类保护区或把捕捞季节放到蟹类交配季节之后可能是保护蟹类资源比较有效的方法.     

稀释液中添加不同浓度的维生素B12对牛细管冷冻精液精子形态的影响

为了阐明维生素B12（VB12）对牛细管冷冻精液形态的影响，在常规稀释液中分别添加0．00％、0．25％、0．50％、0．75％、1．00％的VB12进行试验，比较观察结果表明：0．50％组顶体完整率高于对照组，差异极显著（P〈0．01），0．75％组高于对照组差异显著（P〈0．05），1．00％组低于对照组，差异不显著（P〉0．05）。0．50％组的精子畸形率低于对照组，差异显著0．05），1．00％组高于对照组，差异不显著（P〉0．05）。显著（P〉0．05）。（P〈0．05），0．75％组低于对照组，差异不显著（P≥0．25％组的顶体完整率、畸形率与对照组相似，差异不     

牛精子核空泡观察方法的研究

利用Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＤＩＣＭ法）、ＤＮＡ染色法、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＥＭ法）３种方法检测精子核空泡，观察牛精子核空泡的大小及出现的多发部位。结果表明，应用ＤＮＡ染色法检测牛精子核空泡是最有效的方法，同是地发现牛精子核空泡多出现在精子头部赤道板区和核项区。     

大鳞大马哈鱼精子活力的观察

采集成熟的大鳞大马哈鱼精子,在不同的激活介质、人工精浆(ASP)、pH和温度条件下进行活力观察。结果表明:用生理盐水(BSS)激活的精子活力高于用水激活(P<0.05),单尾鱼的精子活力高于多尾混精(P<0.05);在ASP A,B和C液中,用ASP C液保存精子的效果最好(P<0.05);保持大鳞大马哈鱼精子活力较强的适宜pH值为8.19-8.40,而活力最强时pH值为8.40;在4℃下保存的大鳞大马哈鱼精子活力最高;大鳞大马哈鱼受精率最高时的温度和pH值分别为4℃和8.40,这与大鳞大马哈鱼精子活力最强时的温度和pH条件高度相关。     

细鳞斜颌鲴精子活力观察

为了解细鳞斜颌鲴精子的生理特性,采用实验生态-显微观察方法研究了几种因子对细鳞斜颌鲴精子活力的影响.结果表明,精子能激活的pH范围为5.0～10.58,精子活力较好的pH范围为6.0～7.84;pH 6.9时精子激活率达（89.00±1.0）％、运动时间达25.00±2.65 s、寿命达30.67±2.08 s.精子在1.0～7.0 g/L葡萄糖溶液中均有一定比例被激活,在6.0 g/L葡萄糖浓液中激活率达（89.33±0.94）％、运动时间达25.67±1.25 s、寿命达33.67±0.94 s.精子在2～7 g/L NaCl及KCl溶液中均能激活,在5 g/L NaCl及KC1溶液中活力较好;精子在0.2～0.5 g/L MgCl2及CaCl2溶液中激活率较低,在0.1、0.6、0.7 g/L MgCl2及CaCl2溶液中出现凝集现象.精子在低温4℃下保存3h活力与鲜精基本相同.D-19和Saad稀释液能有效抑制精子运动,且重新被淡水激活后活力较好,可考虑作为精子冷冻保存用稀释液.