转Bt杀虫蛋白基因的抗棉铃虫棉花新种质

采用花粉管通道途径，将合成的Ｂｔ杀虫蛋白基因导入棉花优良品种泗棉３号和中棉所１２号，获得了转基因植株。组织化学分析表明，ＧＵＳ标记基因已在Ｒ１代植株中得到表达。据对ＧＵＳ阳性转基因棉株的ＰＣＲ分析结果，证明Ｂｔ杀虫蛋白基因出现在Ｒ１代中，并通过自交传递至Ｒ２代。经鉴定，获得了５株对棉铃虫幼虫有高度毒杀作用的Ｒ１代单株Ｓ５４５、Ｓ５９１、Ｓ６３６、Ｓ１００１（泗棉３号＋Ｂｔ／ＧＵＳ）及Ｚｈ１１０９（     

人工合成Bt基因对棉花的遗传转化

采用子房注射法，将构建在植物高效表达载体上的全序人工合成的Ｂｔ杀虫基因ＧＦＭＣｒｙＩＡ转入棉花品种（系）“中棉所１９”、“华农９１６”、“５４１”和“３５１７”中，获得对棉铃虫幼虫致死率在８０％以上的植株２９株。用ＰＣＲ法检测，结果表明，这些株株均呈阳性。在这２９株阳性植株中，对棉铃虫致裂纹经为１００％，且自身只有轻微伤害的植株有２６株。这说明Ｂｔ基因经改造，增加其提高转录与翻译能力的表达调控元件     

CaMV基因Ⅵ在拟南芥上的遗传转化及交叉保护

通过对ＣａＭＶ ＣＡＢＢ－ＢＪＩ和Ｂａｒｉ－１株系基因Ⅵ的克隆和转化，在根癌农杆菌菌种ＧＶ３１０１的介导下，利用真空渗入法获得了转化ＧＡＢＢ－ＢＪＩ和Ｂａｒｉ－１基因Ⅵ的拟南芥转基因植株。分子检测表明，基因Ⅵ已整合进拟南芥基因组并有不同程度的表达。在转基因植株中，出现了类似病毒感染症状、多生长点及花粉生活力较低等个体的变异株。而多数传基因樾株（占转基因植株７０．４％）为无症状的正常植株。对转化Ｃａ     

石斑鱼生长激素基因的合成及其在拟南芥中的表达

为了使石斑鱼生长激素基因适合在植物中表达,重新合成了石斑鱼生长激素基因,对其密码子进行了优化,把合成的基因构建于植物表达载体pBI121上并转化模式植物拟南芥,获得了30个转基因抗性植株。对24株PCR阳性苗进行Northernblotting分析,结果表明,鱼类生长激素基因可以在转基因植物中表达,其表达在不同的转基因植株中存在明显差异,表达最强的植株与最弱的植株相比,二者表达量差异达到43倍。     

水曲柳FmSOC1基因烟草中遗传转化

为研究水曲柳SOC1基因对植物开花的调控功能,将水曲柳SOC1基因通过农杆菌介导法转入模式植物烟草中。利用PCR及Southern杂交法检测,结果有10株被确定为转基因植株。利用RT-PCR法对5株转基因烟草进一步分析表明,SOC1基因在3株烟草中表达。表型分析表明,转基因烟草植株生长较快,叶片窄小,开花时间提前。     

CaMV基因Ⅵ在拟南芥上的遗传转化及交叉保护

通过对ＣａＭＶＣＡＢＢ－ＢＪＩ和Ｂａｒｉ－１株系基因Ⅵ的克隆和转化，在根癌农杆菌菌种ＧＶ３１０１的介导下，利用真空渗入法获得了转化ＣＡＢＢ－ＢＪＩ和Ｂａｒｉ－１基因Ⅵ的拟南芥转基因植株。分子检测表明，基因Ⅵ已整合进拟南芥基因组并有不同程度的表达。在转基因植株中，出现了类似病毒感染症状、多生长点及花粉生活力较低等个体的变异株。而多数转基因植株（占转基因植株７０．４％）为无症状的正常植株。对转化ＣａＭＶＢａｒｉ－１株系基因Ⅵ的９个无症状转基因株系接种ＣａＭＶＣＡＢＢ－ＢＪＩ病毒抗性表明，９个转基因株系表现出了不同的抗性     

转基因马铃薯植株的抗性筛选及其PCR鉴定

近年来,转基因技术研究发展很快,筛选、鉴定转基因植株是基因转移的必须环节。本实验利用农杆菌(含有pARTGF植物表达载体)介导法将外源基因转入马铃薯植株,经过含有卡那霉素培养基的抗性筛选,初步筛选出转基因马铃薯植株A、B、C分别为5株、7株、8株;将筛选的转基因马铃薯植株利用PCR进行检测,经分析,其结果初步表明,已成功将目的基因转入马铃薯基因组中,并获得阳性植株分别为2株、4株、5株。     

PCR检测转凝乳酶基因烟草的

利用转基因技术将凝乳酶基因转入烟草中表达的植物生物反应器策略具有十分重要的创新性和应用意义。本研究通过CTAB法提取转cym基因的烟草抗性再生植株的总DNA,并利用Primer软件,同PCR法对转基因烟草的抗性再生植株进行了检测,根据电泳检测结果初步确定在全部51株再生植株中共有17株阳性植株被检出,阳性率为33%。转基因阳性植株的确定为进一步研究凝乳酶基因的植物反应器研究奠定了基础。     

利用农杆菌介导法获得RNAi转基因枫香的研究

随着我国林业生态工程和退耕还林的开展，木材生产与需求之间的矛盾愈加严重，培育速生优质大径材的研究更加重要。基于LEAFY基因在植物生长发育中的特性，利用PCR和Gateway技术构建了含有LEAFY基因保守序列的RNA干涉植物表达载体LFY-RI，利用根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciems介导法获得转基因植株，利用RNA干涉技术抑制转基因植株中LEAFY基因的表达，从而获得枫香Liquidambar formosana不育转基因植株。并利用聚合酶链式反应（PCR）技术和PCR-Southern杂交技术检测了转基因植株中外源基因整合情况。共获得了5株枫香转基因植株，分子检测表明，其中4株为转基因阳性植株。由于转基因植株还比较幼嫩，对它们生长发育以及木材品质的变化尚处于在观察中。图5参12     

苹果叶片再生的改进及转抗虫基因植株的获得

用分别含有全部改造和垢Ｂｔ基因植物表达载体ＰＢ４８，７和ＰＢ４８．６的土壤农杆菌转化苹果优良品种（红富士、早生富士、辽伏）的叶片外植体，经过对ＭＳ培养基成分调整，在Ｎ量保持不变的条件下以（ＮＨ４）２ＳＯ４取代ＮＨ４ＮＯ３，使得转化后再生频率大增，现已获得２３２株转化再生植株，这些植株可以在含５０ｍｇ．Ｌ＾－１的卡那霉素培养基上生长，选出部分植株作ＰＣＲ检测，表明Ｂｔ基因已被导入这些苹果品种中。     

Bt杀虫蛋白基因导入新疆棉花获得抗虫转基因植株

通过花粉管通道法将人工全序合成的Ｂｔ杀虫蛋白基因导入新陆早４号和Ｃ６５２４两品种中，收获注射地Ｂｔ杀虫蛋白基因的棉花种子２万余粒。经棉铃局喂的抗虫性生物检测，得到高抗虫的１８株新陆早４号转化苗和３６株Ｃ６５２４转化苗；以Ｂｔ基因的一对引物进行ＰＣＲ分析，５４株抗棉铃虫的转化棉花苗均扩增出部分Ｂｔ杀虫蛋白基因的目标带。未转化的对照棉花苗则无此条带，证实Ｂｔ杀虫蛋白基因已整合到转化抗虫棉株的染色体上，     

美洲斑潜蝇自然分布格局的研究

逐行逐株调查了400余株自然生长棉花上美洲斑潜蝇危害的棉花叶片和幼虫潜道，在此基础上研究了美洲斑潜蝇的自然分布格局，结果表明：美洲斑潜蝇在棉田发生的初期，其分布格局为均匀分布；在棉田发生一段时间后，即棉花生长进入蕾、花、铃盛期，被害叶片在棉田仍呈均匀分布，但幼虫潜道在棉株上、中部和以整株棉花为取样单位时为聚集分布，在棉株下部则为随机分布。进一步分析表明，幼虫潜道在棉株上、中部的聚集是由环境因素所引起的；以整株为取样单位时的聚集是由环境因素或美洲斑潜蝇自身活动习性所引起的。当以整株棉花为取样单位时，幼早潜道的聚块面积为1株棉花。     

GbCDPK83基因在干旱胁迫下的功能鉴定

为了探究 GbCDPK83基因在海岛棉响应干旱胁迫中的功能。利用PCR技术克隆 GbCDPK83基因，采用生物信息学方法分析GbCDPK83蛋白的理化性质、结构特征和在细胞中的位置，通过基因重组技术构建VIGS沉默载体并侵染棉花。本研究成功构建了沉默表达载体，沉默植株中 GbCDPK83的表达明显被抑制。干旱胁迫后， GbCDPK83沉默植株叶片比对照萎蔫更严重，相对含水量显著降低，相对电导率和丙二醛含量显著上升，脯氨酸含量升高但低于空载体及非转基因植株。沉默 GbCDPK83使海岛棉耐旱性减弱。     

辽棉19号转化耐盐基因AlNHX1的研究

为提高辽宁棉花品种的耐盐性,利用农杆菌介导上胚轴外植体转化法,将来源于盐生植物獐茅的Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(AlNHX1)导入棉花辽棉19号中,分析影响棉花上胚轴外植体农杆菌转化的几个重要因素,建立并优化了该品种的转化体系,结果表明:1)农杆菌侵染的最佳时间为90s,共培养过程中乙酰丁香酮最适浓度为100 mg/L,筛选培养基中潮霉素最适浓度为30 mg/L,生根培养基中吲哚乙酸IBA的最适浓度为10mg/L;2)对转化植株进行PCR检测,表明耐盐基因AlNHX1已导入辽棉19号中;3)在盐胁迫下,转基因植株的电导率,渗透势都显著低于未转化植株。结果表明,通过筛选并优化转化体系,辽棉19号品种的耐盐性有较明显的提升,为沿海滩涂地区种植棉花提供了一定的参考。     

海岛棉GbTCP5基因沉默和过量表达载体的构建及拟南芥转化

海岛棉具有优良的纤维品质,TCP蛋白参与细胞生长和增殖调控,本研究构建海岛棉GbTCP5基因沉默和过量表达植物表达载体。以GbTCP5基因pGEM-T Easy-GbTCP5质粒为模板进行PCR扩增,并将该基因构建到植物表达载体pCAMBIA3301中,利用冻融法转入农杆菌GV3101菌株,通过农杆菌浸染法转化拟南芥植株,初步证明已获得转化海岛棉GbTCP5基因的拟南芥。利用重叠PCR方法替换拟南芥AtMIR319的成熟链和互补链序列,构建含有amiRTCP5前体的植物表达载体amiRTCP5-pCAMBIA3301,为深入研究海岛棉GbTCP5基因的生物学功能奠定基础,为研究棉花纤维发育机制提供理论依据。     

棉黄萎病对棉叶脯氨酸含量及光合蒸腾作用的影响

抗病品种陕1155、陕2059与感病品种泗棉2号、冀棉11号之间,经统计分析表明,病情指数差异显著(p<0.05).用磺基水扬酸法测定不同抗性棉花叶片游离脯氨酸含量,接种后感病品种泗棉2号,冀棉11号含量显著高于抗病品种陕1155和陕2059(P<0.05).2个抗病品种之间和2个感病品种之间差异不显著.测定不同发病程度棉苗的光合与蒸腾作用表明,接菌后的棉苗即使不表现症状,净光合率也显著下降(P<0.01),病棉苗比健棉苗净光合率下降90%～96%.病棉苗的气孔传导使蒸腾速率显著下降(P<0.01),但发病程度与气孔传导和蒸腾速率之间无显著相关.叶片气孔阻力随棉苗的病情发展呈显著增加趋势(P<0.05).     

Somatic embryogenesis and plant regeneration in glandless upland cotton (<Emphasis Type="Italic">Gossypium hirsutum</Emphasis> L.)

Glandless upland cotton has an important economic value. Embryogenic calli and regenerated plants were obtained from the hypocotyl explants of glandless upland cotton seedlings, cultivar Jisheng1. The results indicated that somatic embryogenesis was significantly influenced by the types of auxin and cytokinin. 2, 4-D was advantageous to induce cotton callus, but embryogenic callus could not be obtained on the 2, 4-D medium. Embryogenic calli were also not obtained on the MSB sold medium with the combination of IBA and BA. However, embryogenic calli were induced when the hypocotyl explants were cultured on the IBA and KT medium. More than 31% of the hypocotyl segments produced embryogenic calli when the MSB medium was supplemented with 1.0 mg·L⁻¹ IBA and 0.5 mg·L⁻¹ KT. Embryogenic calli with somatic embryos could be observed within three months. Somatic embryo germination and maturation occurred on the hormone-free MSB medium with 1.0 g·L⁻¹ Gln and 0.5 g·L⁻¹ Asn. A number of regenerated plants could be obtained in six months. In the present study, a simple and efficient system was established to induce a number of embryogenic calli and regenerate plantlets from hypocotyl explants.     

木尔坦棉花曲叶病毒及其伴随的β卫星分子复合侵染引起广东棉花曲叶病

【目的】明确引起广东棉花曲叶病的病原,为该病害的防控提供理论依据。【方法】应用PCR、滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)、基因克隆及测序等技术获得病毒分离物GD01基因组及卫星分子的序列,并对序列进行分析;通过构建GD01及其β卫星分子的侵染性克隆p GreenⅡ049-1.6A、p GreenⅡ049-2.0β和利用农杆菌介导的注射接种方法,测定GD01及其β卫星分子对棉花的致病性;进一步通过Southern blot检测对接种植株进行分析与验证。【结果】侵染广东棉花的病毒分离物GD01基因组仅含A组分(DNA-A),其全长为2 737nt,且与在中国发现的木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCu Mu V)第一个分离物朱槿分离物G6序列相似性为100%。该病毒分离物也伴随有β卫星分子,其全长为1 345 nt,与G6伴随的β卫星分子(Cotton leaf curl Multan betasatellite isolate G6,CLCu Mu B-[G6])序列相似性为99.9%。构建了GD01 DNA-A及其β卫星分子侵染性克隆p GreenⅡ049-1.6A、p GreenⅡ049-2.0β,农杆菌注射接种本氏烟,接种后15 d,二者混合接种的本氏烟植株新出的叶片表现明显的皱缩、卷曲等症状;随着时间的推移,本氏烟的症状越来越明显。农杆菌注射接种棉花,接种后30 d,二者混合接种的棉花植株新出叶片开始出现叶脉变深绿色,叶片卷曲等症状;接种后90 d,二者混合接种的植株大部分叶片表现为叶片向上卷曲、叶脉深绿色、叶脉肿大等典型棉花曲叶症状,且与田间自然病株症状相同,而二者各自单独接种的棉花植株没有产生明显的症状。Southern blot检测结果显示,表现典型曲叶症状的接种棉花植株均含有GD01 DNA-A及其β卫星分子,进一步支持这些症状是由GD01 DNA-A及其β卫星分子的共同侵染引起。【结论】病毒分离物GD01 DNA-A及其伴随的β卫星分子与入侵中国的CLCu Mu V第一个分离物朱槿分离物G6相同,CLCu Mu V-[GD01]及其伴随的CLCu Mu B-[GD01]复合侵染引起广东棉花曲叶病,利用农杆菌介导的侵染性克隆接种法,完成了CLCu Mu V及其CLCu Mu B复合侵染引起棉花曲叶病的柯赫氏法则(Koch's Postulates)。     

拟南芥CYCD3;1基因植物表达载体的构建 及在烟草中的遗传转化分析

为了分析植物D型细胞周期蛋白在细胞周期中的作用,采用PCR方法从拟南芥花序中克隆出At CYCD3;1基因的全长c DNA序列。该基因的开放读码框为1131 bp,预测编码376个氨基酸,蛋白质的分子量为42701.6 Da,蛋白质的等电点为4.89。构建植物表达载体p ROKII-At CYCD3;1,并利用农杆菌介导的叶盘法将外源基因导入野生型烟草中。通过PCR及q RT-PCR检测显示,At CYCD3;1成功插入烟草基因组并在转录水平表达。表型观察显示转基因株系与野生型株系相比主要表现为花冠宽度变大,花瓣和萼片长度变长,果实变大,茎干弯曲,叶片卷曲,根尖细胞变小。综上,拟南芥At CYCD3;1基因的过量表达影响了植物的生长发育。     

新疆棉花枯萎病菌的RAPD分析

将供试新疆棉花枯萎病菌32个代表菌株及3个标准菌株进行RAPD分析，筛选出14个随机引物，共产生252个RAPD分子标记，其中79.4％具有多态性。通过聚类分析将供试菌株划分为5个RAPD组，此结果与常规鉴别寄主反应法划分生理小种的结果基本一致，RAPD分析为传统方法的结果提供了分子水平的证据，从分子水平上证明新疆棉花枯萎菌群体内7号小种占绝对优势。RAPD可作为一种标记手段用于棉花枯萎病菌生理小种及遗传分化的检测。