绿色荧光蛋白在IGF2b基因慢病毒载体感染鲤受精卵中的标记效果

以水母绿色荧光蛋白基因为模板进行PCR扩增得到目的基因(Green fluorescence protein, GFP),然后加上酶切位点BamHI和NheI,构建pLenti6.3IRESEGFP载体,转染DH5α感受态细胞进行菌落PCR,取阳性进行酶切鉴定,再取呈阳性的质粒进行测序,使用浓度为1 μg/μL的质粒与慢病毒表达载体进行连接,通过荧光显微镜观察到绿色荧光,表明本实验获得的GFP和慢病毒载体整合成功;用此转染293T细胞,通过荧光显微镜同样检测到了绿色荧光。使用建鲤的组织提取RNA,然后按照Fermentas公司的MMLV操作说明书进行反转录,得到IGF2b基因后加酶切位点进行扩增,将IGF2b整合到用GFP作为标记基因的慢病毒载体上,再以此转染建鲤未分裂的受精卵,48 h后通过荧光显微镜也观察到了绿色荧光蛋白的表达。试验表明绿色荧光蛋白在IGF2b基因慢病毒载体感染鲤受精卵中的标记是成功的。这些结果为基于含有GFP慢病毒转基因鱼育种技术的开发奠定了基础。     

慢病毒载体介导外源基因在不同细胞及鸡体不同组织中的表达

以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为标记基因构建复制缺陷型慢病毒载体生产病毒,以病毒感染不同来源、不同分化特征的细胞,并进行鸡囊胚注射,观测外源基因的表达情况。试验结果表明,在所有类型细胞中均可检测到EGFP较高水平的表达,其中在HeLa、293FT细胞中的转染效率约1×10^8TU·mL^-1（TU：转染单位）,在C127细胞中为5×10^7TU·mL^-1,在鸡胚胎成纤维细胞（CEF）中约为1×10^6TU·mL^-1,病毒在鸡原生殖细胞（cPGC）中转染效率最低为1×10^2TU·mL^-1。病毒的感染可引起细胞表型的不利改变。用该病毒载体注射鸡囊胚获得了可直接活体观察绿色荧光信号的转基因鸡,转基因效率约53％;外源基因在鸡体不同组织如表皮、消化道等器官中检测到不同水平的表达,并表现出不同的分布特征。     

慢病毒载体介导成纤维细胞高效稳定表达绿色荧光蛋白

 试验尝试建立稳定表达外源基因的人成纤维细胞系。取成年男性包皮皮肤的皮下组织,分离培养人皮肤成纤维细胞,分别采用脂质体和慢病毒载体介导转染人皮肤成纤维细胞表达绿色荧光蛋白。结果显示,来自成年人包皮皮下组织的成纤维细胞呈梭形,具有快速的增殖和稳定的生长性能。脂质体介导转染的人皮肤成纤维细胞绿色荧光蛋白表达不稳定,阳性细胞表达率低,转染后的人成纤维细胞变得更为细长,细胞生长速度降低。慢病毒载体介导人皮肤成纤维细胞高效稳定表达绿色荧光蛋白,转染后细胞生长性能和形态没有变化,经过多次传代和冻存复苏对人皮肤成纤维细胞绿色荧光蛋白的表达没有影响,通过流式细胞仪对慢病毒介导表达绿色荧光蛋白的人皮肤成纤维细胞检测显示,绿色荧光蛋白表达阳性率为99.85%,并且表达绿色荧光蛋白的人皮肤成纤维细胞细胞均一程度为76.05%。试验证实了慢病毒载体能够高效稳定介导人皮肤成纤维细胞表达绿色荧光蛋白。     

慢病毒活体介导精原干细胞生产转基因小鼠

【目的】用慢病毒在体内感染精原干细胞,建立转基因动物生产技术平台。【方法】用三质粒慢病毒载体系统转染293T细胞包装慢病毒,转染后裂解细胞,收集携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒。将慢病毒液注射到小鼠曲细精管,获得F0代小鼠,制备小鼠睾丸组织切片,进行免疫双荧光检测。将F0代小鼠与野生型母鼠交配,获得F1代小鼠,PCR检测F1代是否为转基因小鼠。【结果】通过裂解细胞的方法成功制得慢病毒,将其注射到小鼠曲细精管,获得了10只F0代小鼠,经免疫双荧光检测,发现慢病毒可在活体上感染精原干细胞。8只F0代小鼠与野生型母鼠交配后共获得了41只F1代小鼠,经PCR检测,21只携带慢病毒基因片段,转基成功率为51.22%,表明慢病毒介导的基因改造是可遗传的。【结论】建立了一种操作简单、花费少、易于实施的慢病毒活体介导精原干细胞生产转基因小鼠的技术体系,该技术也可以推广到其他动物上,对于加速功能基因鉴定、疾病模型构建和家畜转基因育种等领域的研究有促进作用。     

猫多能性基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

从含有猫Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc的质粒中获取目的基因,将目的基因与携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体LV5进行定向连接,构建慢病毒表达载体LV-Oct4、LV-Sox2、LV-Klf4、LV-c-Myc,将其连接产物分别转化至细菌感受态细胞中,经筛选阳性克隆、酶切鉴定后测序,通过lipofectamine2000介导转染293T细胞对慢病毒进行包装并测定病毒滴度,探讨猫多能性基因Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc慢病毒载体的构建与包装。结果表明:经双酶切鉴定及测序分析,成功构建并包装出LV-Oct4、LV-Sox2、LV-Klf4及LV-c-Myc慢病毒载体,基因测序结果与目标序列完全一致,且病毒滴度均达到107 TU·mL-1以上。说明成功地构建了猫多能性基因慢病毒表达载体,获得稳定产生慢病毒颗粒的包装细胞株。     

NTE基因ShRNA慢病毒载体的构建与鉴定

【目的】构建神经病靶酯酶(NTE)蛋白低表达的ShRNA重组慢病毒表达系统。【方法】依照ShRNA序列设计原则设计带酶切位点的NTE ShRNA序列,与表达载体pLL3.7连接构建NTE ShRNA重组表达质粒,转染DH5α菌观察重组表达状况,与pCVM-VSV-G包膜质粒和pCMV-dr8.2dvpr表达质粒共转染293T细胞,包装得到重组慢病毒。用病毒稀释法以绿色荧光蛋白(GFP)为标记,确定转染效率及病毒含量。【结果】经酶切及测序鉴定结果显示成功构建pLL3.7-NTE ShRNA慢病毒载体。重组慢病毒质粒与辅助质粒共转染293T细胞后获得高表达的细胞,共转染48h后,收集病毒液检测病毒滴度达4.5×10~4/mL。【结论】成功构建NTE ShRNA慢病毒重组表达系统。     

慢病毒介导多短发卡RNA串联载体构建与体内外抗口蹄疫效果评估

【目的】探讨应用多短发卡RNA(shRNA)串联沉默口蹄疫病毒RNA复制的可行性.【方法】针对口蹄疫病毒(Foot and mouth disease,FMDV)非结构蛋白基因3B和3D保守区域设计合成3个shRNA的串联片段,并分别用3个不同序列的启动子引导,成功构建了3shRNA串联的慢病毒RNAi载体.利用慢病毒3质粒包装系统共转于293T细胞包装成慢病毒颗粒.利用包装的慢病毒处理细胞及乳鼠,并接种FMDV,观察FMDV抑制情况.【结果和结论】结果显示,慢病毒处理BHK-21获得的转基因细胞中检测shRNA表达;通过O型FMDV接种发现转基因细胞对口蹄疫病毒的复制有明显的抑制,其中在接种后24 h病毒拷贝量仅为普通细胞的1/3;O型FMDV毒株接种于抗口蹄疫慢病毒载体预处理过的3~5日龄乳鼠,在5 LD50滴度下全部乳鼠均存活,在20 LD50滴度下存活率也提高50%.构建的慢病毒介导多shRNA串联表达抗口蹄疫载体能提高BHK-21细胞和乳鼠对口蹄疫病毒的抵抗力,有效地避免了5 LD50滴度内乳鼠的死亡现象,具有抵抗口蹄疫病毒毒性的良好性能.     

表达sFat-1基因慢病毒载体的构建及病毒生产

为了建立有效地用于转基因动物生产的慢病毒表达系统,以线虫C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因(sFat-1)为目的基因构建了慢病毒表达载体,通过与慢病毒包装载体PLP1、PLP2和PLP/VSVG一起共转染293FT细胞系生产了慢病毒颗粒,并对其感染哺乳动物细胞NIH3T3细胞系的能力进行了检测。结果表明,该系统所生产的病毒滴度约为5.0×106TU/mL,这种病毒能够感染哺乳动物细胞,说明构建的慢病毒表达系统是有效的,应用其可以生产感染力良好的慢病毒颗粒,并高效地进行sFat-1基因转移。     

慢病毒载体介导稳定表达Cas9基因的293T细胞系构建及其基因编辑效率验证

为通过慢病毒感染细胞构建稳定表达CRISPR/Cas9的293T细胞系,实现高效率基因编辑, PCR扩增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT细胞, 48 h后收集病毒并浓缩纯化测定其病毒滴度,最后用纯化后的病毒感染293T细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达Cas9的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。针对ABCG4基因设计sgRNA并构建重组载体感染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。结果表明:成功构建了Cas9-pLent慢病毒载体,用构建成功的慢病毒载体对293FT细胞进行慢病毒包装(三质粒系统)并对包装成功的病毒进行了浓缩与纯化,最后通过病毒感染293T细胞,采用荧光观察的方式测定其病毒滴度均在10~6 TU·mL~(-1)之上。用纯化后的病毒感染293T细胞并通过加药(Puro)进行抗性筛选,筛选出3株能稳定表达Cas9的293T细胞系,目的基因ABCG4的基因编辑功能验证表明其中1株T7E1酶切掉带明显, sgRNA靶向敲除效率较高,该株命名为Cas9-293T-10A。该研究建立了稳定表达Cas9的293T细胞系,可用于目的基因的高效敲除。     

山羊乳腺特异性表达慢病毒载体的构建与验证

[目的]构建山羊乳腺特异性表达尿激酶原突变体的重组慢病毒载体,证明其表达的有效性。[方法]将劳氏肉瘤病毒增强子／启动子、复制缺陷型艾滋病病毒（HIV-1）的5’端长重复序列（LTR）、HIV-1ψ卫包装信号、HIVRev反应元件、山羊B-casein调控序列、pro—UKM13、△U3／3’LTR依次连接,构建乳腺特异性表达的慢病毒载体;通过体外转染人乳腺癌细胞系（MCF-7）、仓鼠卵巢细胞（CHO）和泌乳山羊乳腺注射证明其表达有效性。[结果]构建的山羊乳腺特异性表达载体酶切鉴定是正确的;利用该载体转染细胞,采用溶圈法和Westernblot检测证实了其表达的有效性;慢病毒载体注射到泌乳山羊的乳腺,在乳汁中也检测到了尿激酶原的表达。[结论]为在转基因动物的乳腺中表达尿激酶原突变体奠定了基础。