异育银鲫促甲状腺激素β亚基基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR、RACE及克隆等方法获得了异育银鲫促甲状腺激素β亚基(TSHβ)基因全长cDNA序列。该cDNA全长926 bp,5’端非编码区68 bp;3’端非编码区372 bp;开放阅读框(ORF)486 bp,编码161个氨基酸。经序列分析显示,其编码的氨基酸序列与金鱼[Carassius auratus(goldfish)]、鲤(Cyprinus carpio)、鳙(Aristichthysnobilis)、斑马鱼(Danio rerio)、虹鳟(Salmo gaidnerii)、鲑(Salmo salar)、鳗鲡(Anguilla anguilla)具有较高的相似性,其相似性分别为91.3%、87.6%、83.2%、77%、58.6%、56.1%、43.55%,同源性较高,这说明TSHβ亚基在长期的进化中具有较高保守性。而且在比较中还发现:异育银鲫和其它7种鱼类相比在5’端多11个氨基酸序列,并且都含有定位保守的12个半胱氨酸残基和一个N糖基化位点。     

沼泽型水牛促卵泡素基因β亚基的克隆与序列分析

根据GenBank公布的奶牛FSHβ亚基的编码序列设计1对特异性引物,成功克隆出广西沼泽型水牛FSHβ亚基cDNA,并将其序列提交到GenBank,获得接受号为EF710660。以DNA Star生物分析软件对其同源性进行分析,结果表明,广西沼泽型水牛与已公布的印度水牛（Bubalus bubalis）的FSHβ亚基cDNA序列的同源性最高,达99%,与绵羊（Ovis aries）为96%、牛（Bovine）为95%、山羊（Capra hircus）为95%、梅花鹿（Cervus nippon）为95%。     

福建黄兔促卵泡素β亚基(FSHβ) cDNA序列的克隆与序列分析

从性成熟的福建黄兔母兔脑垂体中提取总RNA,经RT-PCR扩增目的片段,获得长为390bp的黄兔促卵泡素β亚基cDNA片段。将扩增的片段与pMD18-T载体连接,转化至DH5α感受态细胞中。随机挑选阳性重组子进行鉴定、测序,将测序结果与包括人、奶牛、绵羊、水牛、小鼠在内的多种哺乳动物基因序列进行同源性分析,同源性相似度72.2%~96.5%,同时遗传进化分析结果表明,兔形目的FSHβ基因与灵长目动物的亲缘性更高。对福建黄兔与日本白兔已提交的FSHβ亚基的cDNA序列进行比较,发现在81bp及219bp处存在C→T和G→A两处突变,但未引起氨基酸变化。     

外源性皮质醇对异育银鲫TSH-β mRNA表达和血清甲状腺激素水平的影响

运用Sybr Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法和放射免疫方法（RIA）分析了外源性皮质醇（cortisol）对异育银鲫促甲状腺激素β亚基（TSH-β）mRNA表达和血清甲状腺激素水平的影响.实验设计为10周,实验组每两周注射一次0.2 mg/kg体重的cortisol（用57%酒精溶解）,对照组注射同剂量的57%酒精.实验期间没有投喂饲料.在本实验条件下,研究结果显示：注射3次外源性cortisol后,异育银鲫TSH-β mRNA表达量与对照组相比略有下降;注射5次后,与对照组相比显著降低（P＜0.05）.另一方面,RIA结果显示：注射3次外源性cortisol后,实验组与对照组相比,血清甲状腺激素T3和T4含量虽略有升高,但无显著差异;而注射5次后显著升高（P＜0.05）.以上结果提示：外源性cortisol能够影响异育银鲫脑下垂体-甲状腺轴.     

刺五加ATP合酶β亚基基因的克隆与序列分析

[目的]克隆刺五加叶绿体的ATP合酶β亚基cDNA并对其进行生物信息学分析。[方法]根据已知物种叶绿体ATP合酶β亚基基因的序列,设计1对同源引物,通过RT-PCR扩增得到刺五加ATP合酶β亚基cDNA,并对其进行序列比对及结构预测分析。[结果]RT-PCR扩增获得了长1099bp的刺五加ATP合酶β亚基cDNA,该基因编码366个氨基酸。序列比对及结构预测分析表明,刺五加ATP合酶β亚基基因编码的氨基酸与水稻的同源性最高,达96.41%。其二级结构中含有171个α螺旋（alpha helix）,占46.72%;53个延伸链（extended strand）,占14.48%;27个β折叠（beta turn）,占7.38%;115个无规则蜷曲（random coil）,占31.42%。第262～271位氨基酸为ATP合酶β亚基的标志性位点。整个多肽链无明显的疏水区域,初步认定为亲水性蛋白。[结论]该试验克隆得到的ATP合酶β亚基基因为叶绿体ATP合酶β亚基基因,为研究刺五加能量代谢对植物次生代谢的影响及了解植物ATP合酶的结构与功能提供了必要的信息。     

刺五加ATP合酶β亚基基因的克隆与序列分析

[目的]克隆刺五加叶绿体的ATP合酶β亚基cDNA并对其进行生物信息学分析。[方法]根据已知物种叶绿体ATP合酶β亚基基因的序列,设计1对同源引物,通过RT-PCR扩增得到刺五加ATP合酶β亚基cDNA,并对其进行序列比对及结构预测分析。[结果]RT-PCR扩增获得了长1 099 bp的刺五加ATP合酶β亚基cDNA,该基因编码366个氨基酸。序列比对及结构预测分析表明,刺五加ATP合酶β亚基基因编码的氨基酸与水稻的同源性最高,达96.41%。其二级结构中含有171个α螺旋(alpha helix),占46.72%;53个延伸链(extended strand),占14.48%;27个β折叠(beta turn),占7.38%;115个无规则蜷曲(random coil),占31.42%。第262～271位氨基酸为ATP合酶β亚基的标志性位点。整个多肽链无明显的疏水区域,初步认定为亲水性蛋白。[结论]该试验克隆得到的ATP合酶β亚基基因为叶绿体ATP合酶β亚基基因,为研究刺五加能量代谢对植物次生代谢的影响及了解植物ATP合酶的结构与功能提供了必要的信息。     

鹅TSH-β基因序列的克隆与分析

促甲状腺激素（TSH）在调控甲状腺功能及维持体内甲状腺激素水平稳定等方面具有重要作用。本研究以扬州鹅为试验动物,用PCR方法从鹅基因组DNA中分别扩增出TSH-β基因的外显子1、2、3和内含子1、2序列,产物克隆并测序共得到2019bp;比对发现,与鸡、鸭、朱鹭、鹌鹑等禽类相应外显子序列同源性在95％以上,内含子序列与鸡、朱鹭同源性在74％以上。     

外源性皮质醇对异育银鲫TSH-β mRNA表达和血清甲状腺激素水平的影响

运用Sybr Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法和放射免疫方法（RIA）分析了外源性皮质醇（cortisol）对异育银鲫促甲状腺激素β亚基（TSH-β）mRNA表达和血清甲状腺激素水平的影响.实验设计为10周,实验组每两周注射一次0.2 mg/kg体重的cortisol（用57%酒精溶解）,对照组注射同剂量的57%酒精.实验期间没有投喂饲料.在本实验条件下,研究结果显示：注射3次外源性cortisol后,异育银鲫TSH-β mRNA表达量与对照组相比略有下降;注射5次后,与对照组相比显著降低（P＜0.05）.另一方面,RIA结果显示：注射3次外源性cortisol后,实验组与对照组相比,血清甲状腺激素T3和T4含量虽略有升高,但无显著差异;而注射5次后显著升高（P＜0.05）.以上结果提示：外源性cortisol能够影响异育银鲫脑下垂体-甲状腺轴.     

山羊促甲状腺素β亚基基因(TSHB) cDNA克隆 与组织表达研究

促甲状腺素β亚基基因(TSHB)主要表达于动物垂体腺,其表达受到光照周期调控并且与动物季节性繁殖活动密切相关.本实验以济宁青山羊和辽宁绒山羊为研究对象,运用RT-PCR方法克隆获得山羊TSHB基因部分cDNA序列(GenBank No.:JQ937288),并使用RT-PCR与荧光定量PCR技术检测TSHB基因在济宁青山羊与辽宁绒山羊下丘脑-垂体-卵巢繁殖轴及其他组织的表达分布情况.结果表明,山羊TSHB基因编码区417bp,编码含有138个氨基酸的蛋白质;各哺乳动物间TSHB基因高度保守,山羊与绵羊、牛TSHB基因同源性最高,达99％;另外,两品种山羊TSHB基因均在垂体中高表达,在济宁青山羊下丘脑、卵巢及海马等组织低度表达,而在辽宁绒山羊下丘脑低度表达,两品种其他组织均没有表达.非繁殖季节济宁青山羊垂体TSHB基因表达水平是辽宁绒山羊的1.6倍(P=0.061),其对季节性繁殖的调控功能值得进一步研究.本研究首次对山羊TSHB基因cDNA序列进行了克隆和表达分析,研究结果对山羊繁殖调控具有重要意义.     

灰葡萄孢钙调磷酸酶β亚基基因及启动子的克隆与序列分析

采用EST标签法快速克隆灰葡萄孢钙调磷酸酶β亚基(cnb)基因的cDNA和DNA序列,通过基因步行技术扩增得到cnb启动子序列,运用生物信息学技术进行基因序列分析发现cnb基因含有4个外显子和3个内含子,最大开放阅读框为525 bp(GenBank登录号ABN54442),编码174个氨基酸,分子量为19.75 kD,等电点为4.28;预测蛋白含约59.77%的α螺旋,7.47%的β转角,4.60%的延伸串,28.16%的不规则卷曲;含有4个高度保守"EF-hand"Ca2+结合区域和几个转录调控元件,如EFI,AP-2,NF-kB和Sp1等。Southern blotting表明,cnb基因在灰葡萄孢基因组中含有1个拷贝。     

异育银鲫PTX3基因的克隆与表达分析

为研究Pentraxin 3(PTX3)在鱼类中的作用,克隆得到异育银鲫(Carassius auratus gibelio)PTX3基因,并对其序列结构特征和表达模式进行分析。异育银鲫PTX3序列由3个外显子和2个内含子构成,编码453个氨基酸。异育银鲫PTX3蛋白的前22aa为信号肽,241~453aa为PTX结构域;在PTX结构域有一个非典型的Pentraxin信号。同源进化分析发现,异育银鲫PTX3与其他鱼类聚为一支,且与斑马鱼最为相似(79%);两栖类和哺乳类各自聚为一支。实时荧光定量PCR结果显示,PTX3在异育银鲫的心脏、肝脏、脾脏、头肾、体肾、鳃、脑、肌肉、肠、血液、性腺等11个组织中都有表达。在嗜水气单胞菌攻毒后,肝脏、脾脏、头肾、肠和血液中PTX3mRNA水平都显著上调。在感染后3h,脾脏中PTX3 mRNA水平即出现显著上调;感染后6h,血液中PTX3mRNA水平即达到了峰值。这些结果表明,PTX3作为急相反应蛋白在鱼类受到病原侵袭中发挥免疫保护作用。     

鲫鱼肌间刺形成基因SOST的克隆表达研究

硬化蛋白(Sclerostin,SOST)是一种由骨细胞特异性分泌用于负调节骨形成的因子,为探究硬化蛋白SOST在鲫鱼肌间刺形成中的调控作用.本研究对鲫鱼SOST基因进行扩增,克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a(+)-SOST,转化感受态细胞BL21(DE3),利用IPTG诱导蛋白表达,分析诱导时间与诱导浓度对SOST蛋白表达的影响,并比较SOST基因内源信号肽片段切除前后的表达效果.结果显示,鲫鱼SOST基因序列为636 bp,蛋白质分子量约为38 kDa.随着时间的递增,蛋白表达量逐渐增大,诱导时间为4 h左右表达量达到最高;不同IPTG诱导浓度对蛋白的表达效果影响不大,而信号肽的存在会强烈抑制该蛋白的表达.研究结果为进一步分析SOST基因在鲫鱼肌间刺形成过程中的影响提供理论依据.     

褐飞虱Nilaparvata lugens(St(a)l)肌动蛋白基因3'-RACE及基因表达的RT-PCR检测

通过锚定的3'-RACE筛选实验,确定锚定效率最好的下游引物,用于褐飞虱各发育期肌动蛋白基因表达的RT-PCR检测.结果表明:3个锚定引物中,0422-7(5'＞TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA CTTTTTTTTTTTTTT A＜3')的锚定效率最好,可以扩增出5条褐飞虱的肌动蛋白基因3'末端片段,依其大小命名为BPH-A、BPH-B、BPH-C、BPH-D、BPH-E.RT-PCR检测表明:BPH-A从3龄开始到成虫期都有常量表达;BPH-B、BPH-C、BPH-E从2龄开始到成虫期都有表达;BPH-D在整个幼虫期都有表达,而在成虫期则检测不到.     

银鲫与普通鲫早期胚胎发育的比较研究

为了解黑龙江水系银鲫Carassius auratus gibelio和普通鲫C.auratus auratus的胚胎发育过程,对银鲫(3n♀×3n♂,SS)和普通鲫(2n♀×2n♂,DD)的胚胎发育过程进行了比较观察。结果表明:SS(DD)成熟的卵子呈浅黄色,卵膜透明,圆形,有黏性,卵径为1.3¹.7 mm(1.21.7 mm(1.2¹.6 mm);水温为(23±1)℃条件下,SS(DD)受精后1 h 08 min(1 h 03 min)进入卵裂期,受精后2 h 54 min(5 h 02 min)进入囊胚期,受精后8 h 06 min(6 h 49 min)进入原肠胚期,受精后10 h 25 min(10 h 51 min)进入神经胚期,受精后14 h 22 min(16 h 20 min)进入器官形成期,59 h 31 min(59 h 05 min)后出膜。研究表明,SS和DD均具有正常的早期胚胎发育过程,这为进一步了解SS和DD的遗传背景和生殖方式提供了生物学依据。     

鲫鱼肝组织细胞核电镜图像三维重建的研究

[目的]将电镜三维重建技术引进到水产学和水生生物学研究领域。[方法]利用连续超薄切片电子显微镜技术对正常状态下鲫鱼肝组织细胞核超微结构的进行观察和连续拍照,并利用计算机三维重建技术对连续拍照的图片进行三维重建。[结果]使用Recon—struct软件,成功地对基于连续超薄切片的鲫鱼肝细胞核电镜图像进行了三维重建。[结论]使用电镜三维重建技术进行细胞超微结构的三维重建是可行的。     

土壤宏基因组中抗草甘膦新基因的克隆及其功能验证

【目的】从土壤宏基因组中克隆新的抗草甘膦新基因,并对其功能进行验证,为培育抗除草剂转基因新品种奠定基础。【方法】利用被草甘膦污染的土壤建立宏基因组文库,经筛选从中成功克隆了一个新的具有草甘膦抗性的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因(命名为soilA)。构建了Prrn启动子驱动soilA基因的原核表达载体pSYTH-soilA,将其导入大肠杆菌进行原核草甘膦抗性试验,构建了35S启动子驱动soilA基因的植物表达载体pC330E,利用农杆菌介导法转化烟草,并对经PCR和胶体金试纸条鉴定的转基因烟草植株进行草甘膦耐受能力检测。【结果】序列分析表明,所获得的soilA基因长1 347bp,编码448个氨基酸,经BLAST分析,结果表明其属于ClassⅡ型EPSPS基因家族。原核表达soilA可使受体菌具有耐受1 200mmol/L草甘膦。构建soilA植物表达载体pC330E,通过农杆菌介导法将其导入烟草,经PCR和胶体金试纸条检测共获得107株阳性烟草植株,经过喷洒试验获得了3株高耐受草甘膦植株,这3株转基因烟草最高可耐受200mmol/L草甘膦。【结论】新克隆的编码EPSPS的soilA基因能够提高受体材料的草甘膦耐受能力。     

小鼠蛋白激酶CK2β亚基cDNA的克隆与序列分析

目的：构建小鼠蛋白激酶CK2β亚基cDNA重组表达质粒，以便深入进行CK2结构与功能的研究。方法：通过反转录PCR从NIH3T3小鼠成纤维细胞中获得小鼠蛋白激酶CK2β亚基编码区cDNA，PCR扩增酶为高保真DNA聚合酶。将NdeⅠ/HindⅢ彻底双酶切PCR产物定向连接到牛小肠碱性磷酸酶去5′端磷酸的同样彻底NdeⅠ/HindⅢ双酶切的表达载体pT7—7中，转化感受态大肠杆菌DH5α获得转化子，用0．8％琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化予，将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定。随机挑选两个阳性克隆进行DNA测序。结果：转化子的阳性筛选率为100％，限制性酶切分析结果表明插入片段和重组质拉的大小与理论推测值相符。DNA测序结果表明：两个重组小鼠CK2β亚基克隆中的插入片段序列均与两种已报道的小鼠CK2β亚基cDNA编码区序列分别存在一个碱基差异，但我们报道的这2个差异碱基与大鼠、兔、猪和人CK2β亚基cDNA的编码区相应碱基序列一致。结论：本实验克隆的小鼠蛋白温酶CK2β亚基cDNA编码区序列可能是正确的序列。