十字花科蔬菜根肿病菌的PCR检测

 利用设计合成的1对根肿病菌（Plasmodiophora brassicae）特异性寡聚核苷酸引物（前引物:5’GAA GAT GCC CAC GCC GTC GT3’和后引物:5’ATC TGT TCA GCA AAG CGT CGA3’）,对分离自十字花科作物（白菜、青菜、甘蓝、芥蓝、花椰菜等）及土壤中的根肿病菌全基因组DNA进行PCR（Polymerase Chain Reaction）特异性扩增试验。试验结果表明,试验设计合成的引物能从十字花科根肿病菌全基因组DNA中扩增到629 bp长度的分子片段,该对引物可用于十字花科蔬菜根肿病的分子鉴定和分子监测,为十字花科根肿病的早期准确诊断和病菌检测提供了快速、简便的方法。     

三七病原根结线虫核糖体基因ITS区段的克隆测序及其在检测中的应用

根据NCBI基因库中根结线虫属rDNA序列,设计通用引物M18s/M28s,对采自云南文山、砚山、马关、蒙自等地的4个三七病原根结线虫种群(Meloidogyne hapla)rDNA区段进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,并将扩增到的目的片段克隆到pGEM-T载体上。对重组克隆进行测序和序列分析,结果表明:4个种群rDNA同源性为100%,ITS区序列长度为479 bp,其中ITS1序列长度为213 bp,5.8S序列长度为159 bp,ITS2序列长度为107 bp。根据此序列设计-对特异性寡聚核苷酸引物Mhf/Mhr,应用PCR技术,以北方根结线虫(Meloidogynehapla)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)和爪哇根结线虫(Meloido-gyne javanica)全基因组DNA为对照,对三七病原根结线虫全基因组DNA进行特异性扩增。结果表明,该对引物能从供试的北方根结线虫和三七病原根结线虫种群全基因组DNA中扩增到462 bp长度的分子片段,而南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫则无扩增产物。该引物可用于三七病原根结线虫的检测。     

十字花科蔬菜根肿病菌的PCR快速检测

利用设计合成的根肿病菌 (Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ)特异性寡聚核苷酸引物Ｄ85 81 9Ｆｗ/Ｄ85 81 9Ｒｖ,根据本研究组成员对十字花科蔬菜根肿病菌核糖体基因ＩＴＳ区段克隆测序结果 (未发表 )而设计的引物ＩＴＳＦｗ/ＩＴＳＲｖ和真菌核糖体基因ＩＴＳ区段通用引物ＩＴＳ1 /ＩＴＳ4,对分离自十字花科作物(白菜、青菜、甘蓝、芥蓝、花椰菜等 )根肿病菌全基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ(ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ)特异性扩增试验。试验结果表明 ,这 3对引物均能从十字花科根肿病菌全基因组ＤＮＡ中扩增…     

巢式PCR检测油茶根腐病菌的研究

为建立油茶Camellia oleifera根腐病菌层生镰刀菌Fusarium proliferatum的巢式聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系．扩增层生镰刀菌核糖体DNA基因间隔序列（ITS）区并测定其序列,比较该序列与GenBank中近似种的ITS序列差异．设计了特异性引物GF1和GR2,利用该对引物与ITS1和ITS4进行巢式PCR扩增检测层生镰刀菌。结果显示,巢式PCR对层生镰刀菌的检测灵敏度可达100ag基因组DNA,比常规扩增方法提高了1万倍。利用设计的GF1／GR2特异性引物与ITS区通用引物进行巢式PCR扩增．可灵敏地扩增出油茶根腐病菌层生镰刀菌DNA。     

三七病原根结线虫的分子鉴定

利用设计合成的1对北方根结线虫（Meloidogyne hapla）特异性寡聚核苷酸引物Mh-F／Mh-R,以北方根结线虫、南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫全基因组DNA为对照,对采自云南文山、砚山、马关、蒙自等地区的三七根结线虫全基因组DNA进行PCR特异性扩增。结果表明,设计合成的引物能从北方根结线虫和供试的4个三七病原根结线虫全基因组DNA中扩增到462bp长度的分子片段,而南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫的全基因组DNA无扩增产物。表明4个地区的三七病原根结线虫种群均为北方根结线虫,该对引物可用于三七根结线虫的分子鉴定。     

利用巢式PCR检测花生青枯病菌

为建立花生青枯病菌的快速检测技术,本研究利用细菌16S-23SrDNA内源转录间隔区(ITS)通用引物L1/L2扩增花生青枯病菌基因组DNA并对其扩增序列进行克隆测序,通过与其同属近缘种做比较,设计1对特异性引物W1/W2,利用该对引物与细菌通用引物L1/L2建立了花生青枯病菌的巢式PCR检测方法。结果显示,引物W1/W2只能从花生青枯病菌中扩增出374bp的特异片段;巢式PCR检测灵敏度可达10fg·μL-1基因组DNA,较常规PCR提高1000倍;该技术可用于花生青枯感病期或者发病潜伏期时的病害检测。     

黑龙江省南瓜疫病菌遗传多样性分析

试验利用通用引物ITS1和ITS4对南瓜疫病菌(Phytophthora capsici)的19个菌株的ITS rDNA进行扩增,然后利用4种限制性内切酶酶切PCR扩增产物,分析各菌株间的DNA限制性片段多态性。运用ITS通用引物在所有供试南瓜疫病菌菌株上均可扩增到一条长为575bp的特异DNA片段。经限制性内切酶酶切和聚类分析,将黑龙江省南瓜疫病菌可划分为4种病原型。运用一对ITS通用引物扩增供试菌株得到20个ITS标记,其中多态性标记占95%。供试菌株在遗传上有相似性,差异也非常明显,表明南瓜疫病菌群体内部存在着丰富的遗传多样性。     

检疫性真菌病害向日葵黑茎病菌和茎溃疡病菌的三重PCR分子检测

向日葵黑茎病菌Leptosphaeria lindguistii和向日葵茎溃疡病菌Diaporthe helianthi是向日葵上寄生的2种重要的检疫性真菌病害.针对这2种致病菌,目前国内外已有形态学鉴定和危害的研究报道以及向日葵黑茎病菌的ITS序列分析和RFLP初步研究,但未见有2种病原菌同步分子检测的报道.本研究首先通过培养,观察比较了2种病原菌的菌落和形态特征.发现前者菌落絮状,分生孢子器深褐球型,分生孢子为单胞肾形;后者菌落短绒毛状,分生孢子器柠檬黄,分生孢子为线型.通过油菜黑茎病菌L.biglobosa的肌动蛋白基因设计供试材料的通用引物act F/act R,扩增产物片段约为720 bp,然后采用真菌通用引物ITS1/ITS4和引物act F/act R,针对所有菌株菌丝DNA进行ITS区域和Actin基因PCR扩增,经克隆测序结果比对分析发现,向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的ITS区域存在极高的相似度.因此,依据Actin基因特异位点分别设计出向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的特异引物LLF/LLR和DHF/DHR.在同一PCR管中3组引物(ITS1/ITS4,LLF/LLR和DHF/DHR)经优化体系后,ITS1/ITS4扩增序列作为所有菌株菌丝基因组DNA提取模板的质量监控,针对向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌单一模板的ITS区域与Actin基因中的两个位点同时进行三重PCR扩增.利用此方法检测向日葵黑茎病菌出现580 bp的ITS保守区扩增片段和255 bp的Actin基因的特异扩增带,向日葵茎溃疡病菌出现580 bp的ITS保守区扩增片段和394 bp的Actin基因特异扩增带.所有菌株均未见非特异性片段的干扰.此三重PCR检测体系的建立为此两种检疫性真菌病害的同步分子检测提供了特异方法.     

云南马铃薯青枯病菌的PCR检测

利用针对马铃薯青枯病菌hrp基因族DNA序列设计合成特异性寡核苷酸引物（引物1：5‘GAAGAGGAACGACGGAAAGC-3‘和引物2：5‘CGAACAGCCCACAGACAAGA-3‘）,进行马铃薯青枯病菌PCR特异性扩增试验。该试验合成的引物能从马铃薯青枯病菌总基因组的DNA和细菌纯培养,以及人工接种和自然发病的马铃薯块茎中特异性扩增青枯病菌hrp基因区段1993bp的分子片段。该试验结果为马铃薯青枯病菌的鉴定、检测及病害流行学研究提供了新的技术的方法。     

首次测得蝴蝶兰基腐病菌rDNA ITS区序列

用White et al．于1990年设计的引物ITS4和ITS5对蝴蝶兰基腐病菌(Fusarium spp．)的rDNA ITS区片段进行了PCR扩增，并将扩增产物克隆到大肠杆菌JM109中进行测序，测得的序列长度为565bp。该序列的测得为蝴蝶兰基腐病菌的诊断提供了有利证据。     

烟草疫霉的快速分子检测

 根据烟草疫霉与其他疫霉菌ITS序列的差异设计了1对寡聚核苷酸引物,用于烟草疫霉的PCR检测。结果表明,在优化的反应体系与扩增条件下,该对引物表现出强特异性,只在烟草疫霉为模板的扩增体系中具有1条660bp的条带。利用此特异性引物可稳定地从含有烟草疫霉的土壤及其发病组织中检测出病原菌。本实验提供并完善了一套快速检测烟草疫霉的方法和技术,特别对土传病害的准确诊断与快速检测在实践和理论上具有重要意义。     

青花菜病程相关蛋白基因 BoPR2 的克隆与表达

病程相关蛋白基因以家族形式存在于植物中,在抗病反应中起着重要作用。以青花菜为试材,利用PCR法克隆到1个PR2基因,定名为BoPR2。测序结果表明,BoPR2基因组全长1188bp,具1个内含子,编码区全长1092bp,编码351个氨基酸;序列比对和系统发育分析结果显示,BoPR2与野甘蓝、甘蓝型油菜和白菜PR2的相似度最高,在发育树上聚为一组,与亚麻荠、荠菜的相似度最低,亲缘关系最远;实时定量PCR结果表明,BoPR2的表达受芸薹根肿菌诱导,在10d时的相对表达量最大,约为对照的6倍;但BoPR2的表达不受核盘菌的诱导。BoPR2基因的克隆与表达分析,为青花菜抗病机理研究及开展分子育种奠定了基础。     

华南虎绦虫ITS及5.8S rDNA序列扩增与序列分析

以从广州动物园华南虎体内采集的2条绦虫作为研究对象,利用核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区序列(ITS)的遗传标记特点,用保守引物BD1和BD2对提取的DNA进行PCR扩增,经胶回收纯化后,连接到pGEM-T Easy载体上,然后转化并鉴定出阳性菌落,对菌落进行PCR扩增并测序,将测序结果与GenBank公布的相关绦虫ITS序列进行对比分析,结果显示,采自广州动物园华南虎的2条绦虫ITS及5.8S rDNA序列总长均为1387bp,序列相似性为100%,与猬迭宫绦虫(Spirometra erinaceieuropaei)、舌形属绦虫(Diphyllobothrium ligula)、宽节双叶槽绦虫(Diphyllobothriumlatum)的ITS及5.8S rDNA序列相似性分别为96.7%、66.5%、71.5%,结果显示,此次分离的绦虫属于迭宫属的猬迭宫绦虫,所测得的华南虎猬迭宫绦虫的ITS序列为首次报道。     

Optimization of ITS rDNA Amplification for Fungi from Black Soil in North China

In order to optimize polymerase chain reaction(PCR) amplification of the internal transcribed spacer(ITS) rDNA region from fungi found in black soil in North China,an orthogonal experimental design [L16(45)] was used to evaluate five factors(template,Mg2+,dNTP,Taq DNA polymerase,and primer) from four levels.Subsequently,the optimal annealing temperature,annealing time,extension time and cycle numbers were evaluated.The results showed that the optimized PCR solution for amplification of ITS region comprised ...     

应用特异PCR方法诊断2例猪弓形虫病

[目的]应用特异PCR方法诊断猪弓形虫病。[方法]分别以弓形虫核糖体DNA第一内部转录间隔区(ITS1)序列和529 bp重复序列为目的片段,扩增2例疑似猪弓形虫病的病料肺门淋巴结DNA,对疑似猪弓形虫病的病料进行PCR诊断。[结果]2对引物均能分别扩增出2例肺门淋巴结中弓形虫DNA的特异条带。[结论]基于2种扩增片段的PCR方法均具有较高的特异性,是诊断猪弓形虫病的一种快速检测方法。     

不结球白菜S位点受体激酶基因片段的克隆与表达分析

以不结球白菜自交不亲和系03的基因组DNA和柱头cDNA为模板,利用引物SRKF/SRKR扩增获得长度为964 bp和646 bp的SRK基因片段。序列比较分析表明,克隆的基因片段属于SRK基因的激酶域,该序列包含4个外显子和3个内含子,编码215个氨基酸,与芜菁、甘蓝、芥蓝等SRK基因有90%以上的相似性。荧光定量PCR分析结果表明:自交不亲和系03和自交亲和系105不同组织中SRK基因的表达水平存在显著的差异,SRK基因主要在自交不亲和系的柱头中高度表达,自交亲和系中该基因的表达主要分布于叶片、花蕾和柱头组织中。     

番茄白粉菌的PCR分子检测

根据番茄白粉菌核糖体DNA的ITS(internal transcribed spacer)序列的特异性,设计2对引物OidF1/R1、OidF2/R2,对番茄白粉菌进行了PCR特异性扩增试验。结果表明:2对引物都可以从番茄白粉菌基因组DNA中扩增出350 bp左右的特异性扩增产物,并具有专一性,只在白粉菌和接种感病组织DNA中有扩增条带,而番茄早疫病菌、叶霉菌以及健康组织DNA中均无特异性扩增片段;引物具有高度的灵敏度,可以检测含有1 ng的番茄白粉菌DNA。由此证明,该方法可快速、准确和灵敏地鉴定和检测番茄白粉病的发生。