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相似文献
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1.
采用“富集PCR”方法,用单个特异引物和oligo(dT)15从桃伤处理叶片cDNA 中扩增出特异性片段⒚将扩增产物分离并克隆筛选到13 个重组克隆,其中有6 个克隆能与ACC氧化酶基因组DNA 杂交,对其中一个阳性克隆pGEMAC12 作酶切分析,发现其酶切图谱与已报道的桃果实成熟相关的ACC氧化酶cDNA 基本一致⒚DNA 序列分析表明,插入片段两端DNA 序列均是 5'端特异引物序列,表明是由5'端特异引物单个引物扩增出来,全序列分析表明插入片段全长833 bp,是ACC 氧化酶cDNA 基因编码区的一部分,5'端缺少启始密码子ATG,3'端缺少部分编码序列和终止密码子TAA⒚  相似文献   

2.
选用FPV282E4株BamHI7.3kb含非必需区片段,经XbaⅠ酶切,将A、B、C3个片段亚克隆于KS(—)质粒中,同时使D片段自身环化,获得KSFa、KSFb、KSFc、pUCFd4个重组克隆,经酶切鉴定证明亚克隆正确。为以FPV基团组非必需区的BamHI7.3kb片段中BglⅡ片段所在区域构建重组载体质粒和体内重组表达外源基因的研究以及非必需区的核苷酸序列分析奠定基础  相似文献   

3.
根据已克隆的植物抗病基因的保守序列设计引物,对玉米DNA进行扩增、克隆并对部分克隆进行了测序。测序结果与Genebank进行序列同源性比较分析。其中pGEM2-23号克隆与玉米中乙醇脱氢酶基因(adh1)在15047~15272bp处具有85%同源性;pGEM2-25号克隆与水稻BAC库中10号染色体的OSJNBa0055P24克隆片段在67005-67151bp处具有82%同源性。推测pGEM2-23克隆为-与乙醇脱氢酶有类似作用的抗病相关侯选基因的片断。  相似文献   

4.
本文重缚和构建了新城疫病毒(NDV)融合蛋白基因,并对该基因进行了鉴定,将新城疫病毒F基因片段经RT-PCR扩增,插入经EcoRI/SalI酶切的克隆载体pUC18及表达载体pGEMEX,转化大肠杆菌JM109株,用氨苄青霉素平板法初步筛选克隆,再用双酶切法,核酸探针,PCR及核苷酸序列分析法鉴定,表明插入成功并且阅读框架正确。  相似文献   

5.
从成熟的番茄果实中提取总RNA,进行RT-PCR扩增合成乙烯形成酶cDNA,并将其克隆至载体Bluescript的EcoRV位点,经限制酶谱分析,构建亚克隆进行全序列测定和序列分析。将所克隆基因以反义基因的形式定向重组到载体pSPROK上,同时将带有完整启动子和终止子的标记基因BAR基因引入pSPROK中,最终获得表达乙烯形成酶反义基因和BAR基因的植物表达载体pBAR-EFE。  相似文献   

6.
K88菌毛蛋白亚基基因克隆、表达及重组蛋白抗血清制备   总被引:5,自引:1,他引:4  
利用PCR技术,从仔猪黄痢的致病菌中扩增出不含信号肽序列的K88菌毛蛋白亚基基因片段,将其克隆到E.coli表达载体pET28a(+)中,构建了该基因的原核表达载体p8828,导入E.coliBL21(DE3),得到工程菌株。DSD-PAGE分析结果显示,经IPTG诱导,该亚基基因高效表达出重组K88菌毛蛋白,约占菌体总蛋白的30%。用含重组蛋白的凝胶作为抗原,免疫新西兰大白兔,首次制备K88菌毛  相似文献   

7.
用 P C R 技术,从马立克氏病病毒( M D V) C V I988/ C 株感染的鸡胚成纤维细胞( C E F)基因组 D N A 中扩增出含起始密码子的 M D V pp 38 基因同源物编码序列。在以 Digoxigenin ( Dig.)标记的 pp38 基因作为探针,在 Southern blot中,该探针能识别该 P C R 扩增片段。将该 P C R 扩增片段在 Bam HⅠ和 PstⅠ位点克隆进 p U C18 质粒载体,酶切分析筛选到含 pp38 基因同源物的重组质粒并进行了全序列分析,证明该重组质粒是 pp 38 基因同源物克隆。  相似文献   

8.
以大麦黄矮病毒GPV株系的RNA为模板,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,扩增出1134bp的缺失复制酶基因。将扩增的片段克隆到pUC19的Smal位点上并进行了序列测定,获得正向插入的重组质粒pUC19D。以Kpnl从Xbal从pUC19D上切下此基因并插入质粒pEmu-mcs-N得到植物表达载体pPPI8。应用花粉管通道法转化普通小麦品种陇鉴127、陕160和晋麦47,通过卡那酶  相似文献   

9.
鸽Ⅰ型禽副粘病毒F基因克隆及序列分析   总被引:1,自引:0,他引:1  
利用RT-PCR技术获得了编码鸽Ⅰ型禽副粘病毒GD-P1分离株F0裂解位点附件884bp的F基因cDNA片段,并将其克隆到pGEM-T Easy质粒中,获得了重组质粒T-pPMV-F-I,核酸序列测定和分析表明,该片段与新城疫病毒强毒株F48E9和HER/33相应区域的同源性分别为87.5%和88.19%,与新城疫病毒弱毒株LaSota和B1株的同源性分别为83.83%和84.15%。该病毒F0裂  相似文献   

10.
番鸭细小病毒M91G27株VP3基因的克隆与序列测定   总被引:1,自引:0,他引:1  
利用PCR技术,从纯化番鸭细小病毒M91G27毒株鹅胚尿囊液中扩增出病毒结构多肽VP3基因。将该PCR扩增片段克隆入pUC18质粒载体的HincⅡ和SacⅠ位点之间,酶切分析筛选到含1.6kb基因片段的重组质粒MP13。结果表明:该片段与国外已报道毒株核苷酸序列有98.8%的同源性,氨基酸序列有98.1%的同源性,证明该重组质粒是VP2基因的克隆。  相似文献   

11.
丙酮酸羧化酶(PEP)是控制油菜蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶,抑制种子中pepc基因的表达,使其底物(丙酮酸)更多地朝生成油脂的方向流动,对提高种子的含油量,增加油菜的经济价值具有重要的意义、利用PCR技术从甘蓝型油菜湘油15号基因组中扩增了PEP基因片段,并将其克隆到pGEM-T Easy载体上进行测序.测序结果表明:扩增片段长576bp,与Yannai报道的PEP基因相应区域的同源性为95%.用扩增引物上设计的BamHI和SacI两位点酶将PEP基因片段切下,反向插入到pBII21.N质粒的Napin启动子之后,构建了种子特异性反义PEP表达载体,并通过农杆菌介导法将反义PEP基因转化到湘油15号中。  相似文献   

12.
cDNA fragment of fertility gene MS2 from cotton was cloned by RT-PCR approach, it was highly homologous with relevant genes of Brassica napus and Arabidopsis thaliana. According to the principles of constructing RNAi vector, sense and antisense fragments of MS2 gene carrying restriction endonuclease recognition sites were amplified via PCR technique, ligated with the first intron of upland cotton chinase gene, then inserted into artificially modified plant expression vector pBI121, yielding RNAi vector pBGP12MSIn. The results showed that RNAi vector pBGP12MSIn harboring MS2 gene driven by anther specific promoter BGP was successfully constructed. Our results laid a foundation for studying the function of this gene and genetic transformation of plant male sterile lines.  相似文献   

13.
芸薹属DFR基因家族RNA干扰载体的构建   总被引:1,自引:0,他引:1  
二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)是类黄酮途径的一个关键酶,对种皮色泽和花色的形成具有重要作用。本研究从甘蓝型油菜克隆了600 bp(不计人工酶切位点)的芸薹属DFR基因家族的RNA干扰片段BDFRI,将其反义片段和正义片段分别插入到本课题组新近改造的植物RNAi平台载体pFGC5941M的启动子与间隔区之间、间隔区与终止子之间,构建了11 400 bp的RNAi干扰载体pFGC5941M-BDFRI,通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌菌株LBA4404中形成了工程菌株。此载体的构建为进一步研究DFR基因参与决定芸薹属种皮色素和茎叶彩色性状的分子机理和代谢调控奠定了基础。  相似文献   

14.
雄性育性基因RNA干扰载体的构建与鉴定   总被引:1,自引:1,他引:0  
1材料与方法1.1材料酶和试剂:各种限制性内切酶购自Roche公司,T4DNA连接酶购自上海生工公司,Taq聚合酶、dNTP、凝胶回收试剂盒均购自Promega公司,引物由上海生工公司合成,其他试剂均为进口或国产分析纯。植物材料和质粒:棉花洞A雄性可育株由西南大学棉花教研室提供,表达载体P^BП21质粒和大肠杆菌菌株XL1-Blue由西南大学生物技术中心实验室保存。pUCm-T克隆载体购自上海生工公司。  相似文献   

15.
【研究目的】构建一个同时反义共抑制甘蓝型油菜(Brassica napus)透明种皮12基因家族(BnTT12)转录的植物表达载体。【方法】通过PCR扩增得到BnTT12家族一段503bp的特异保守片段TT12A,通过亚克隆整合到中间载体pCambia2301G,构建TT12反义植物表达载体pCambi-a2301G-TT12A。采用液氮冻融法将其转化到根癌农杆菌。【结果】经过PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成TT12反义表达载体的工程菌株。【结论】pCambia2301G-TT12A的成功构建为利用此反义载体通过遗传转化获得转基因新型黄籽油菜和进一步探明TT12基因在甘蓝型油菜种皮色素合成途径中的分子生物学机理奠定了基础。  相似文献   

16.
通过基因工程手段抑制甘蓝型油菜Δ12-油酸去饱和酶(delta-12 oleate desaturase FAD2)基因的表达,从而使油酸脱饱和产生亚油酸的步骤受阻,达到富集油酸,减少多不饱和脂肪酸含量的最终目的。依据植物RNA干扰的原理和研究中用于构建RNAi载体的基本经验,选择油菜fad2基因片段(510bp)分别以反向和正向的形式插入到油菜napin启动子下游,并在反向和正向插入的基因片段之间即间隔区导入1个来源于豌豆的rbcS-3C基因内含子(83bp)及其剪切位点之前5bp、之后4bp片段。组装完成的fad2RNAi载体转入到植物双元表达载体pCAMBIA3301,植物筛选标记基因采用抗灭生性除草剂PPT的选择基因bar及报告基因gus,从而构建成以甘蓝型油菜fad2基因为靶标的RNAi植物表达载体pCAMBIA3301-fad2i。  相似文献   

17.
磷酸烯醇式丙酮酸/磷酸转运子基因(Phosphoenolpyruvate/phosphate translocator 1,PPT1) 是细胞质体碳水化合物转运的一个关键基因,在植物莽草酸代谢和脂肪酸生物合成途径中起着重要作用.根据十字花科拟南芥PEP转运子AtPPT1基因序列与油菜数据库BBSRC Brassica DB中相应ESTs设计全长引物,以甘蓝型油菜(Brassica napus) 幼嫩叶片基因组DNA和种子cDNA为模板,克隆到了甘蓝型油菜PEP转运子基因全长序列,命名为BnPPT1.该基因基因组gDNA全长为2 075 bp,含有8个内含子,编码区长度为1 224 bp,编码407个氨基酸.序列比对结果表明,BnPPT1与同属于十字花科拟南芥AtPPT1转运子同源性很高,仅有个别氨基酸的差异.进一步采用半定量RT-PCR分析表明,BnPPT1基因在油菜各器官中表达差异很大,在幼嫩的子叶和茎中有较高丰度的表达,在中早期发育的种子中表达丰度逐步升高,种子成熟后期没有表达,暗示该基因在油菜籽粒中油份等物质积累中有重要功能.  相似文献   

18.
在获得一个与白菜核雄性不育相关的编码细胞色素P450(CYP450)的基因CYP86MF的基础上,采用PCR技术在该基因的内部第901个碱基至第1338个碱基之间设计引物,扩增出438 bp序列作为反义基因片段.把该反义片段连接至pBI121双元载体质粒上得到CaMV35S组成型启动子的表达载体pBI35S-AMF,随后利用"三亲杂交"法将pBI35S-AMF质粒转入农杆菌LBA4404和EHA105两个菌株中.PCR扩增和酶切鉴定结果表明,所构建的反义CYP86MF基因植物表达载体pBI35S-AMF是正确的,并已成功导入了根癌农杆菌中.随后,按照已建立的遗传转化体系对‘上海青'白菜进行了转化,并获得130了多株转化再生植株.  相似文献   

19.
利用PCR技术从大白菜(Brassica campestrisL.ssp.Penkinsis)新型胞质雄性不育材料CMS7311的线粒体基因组中扩增出与细胞质雄性不育相关的片断,并克隆测序。序列分析表明,该片断和报道的Poli-ma-orf224序列完全相同,没有发生变异,说明CMS7311的不育机理与PolimaCMS相似,也反映了细胞质雄性不育变异的保守性。  相似文献   

20.
利用mRNA差异显示技术寻找甘蓝型油菜黄籽基因   总被引:5,自引:0,他引:5  
 以两组不同来源的甘蓝型黄籽油菜近等基因系为材料,利用mRNA差异显示技术对90对随机引物和锚定引物组合进行筛选,获得1个能稳定重复出现的差异cDNA片段。以该差异片段为探针经Northern杂交验证了上述结果,推测该差异片段可能和种皮色泽差异形成有关。对该差异片段进行了克隆、测序,并根据此序列设计了2个嵌套特异引物,利用PCR-Walking技术延伸该差异片段,对该延伸序列进行克隆、测序及序列同源性分析。同时对mRNA差异显示技术应用过程中的相关问题进行了探讨。  相似文献   

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