马铃薯抗晚疫病转基因材料的获得及活性氧清除酶系与抗病过程关系分析

 【目的】获得马铃薯抗晚疫病转基因材料，初步分析活性氧清除酶系与抗病过程的关系。【方法】通过农杆菌介导的方法，以茎段为外植体，将抗晚疫病基因R1、R3a 和RB分别转化马铃薯感病栽培品种Desiree，并通过特异PCR扩增目的基因、无菌苗快速抗病鉴定和离体叶片接种鉴定、RT-PCR分析来筛选阳性转化株系。并测定转基因株系和野生型接种晚疫病原菌生理小种89148-9后，体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性变化。【结果】结果证明，3个抗晚疫病基因都已经整合进入马铃薯基因组中并稳定表达，所获得的转基因株系接种小种89148-9后其抗性有不同程度的提高，大部分表现为高抗或抗病，有明显的HR反应;转基因株系在接种小种89148-9后3种酶的活性都升高，且活性高峰比野生型早。【结论】获得了一批高抗或抗晚疫病的马铃薯转基因材料;活性氧清除酶系可能参与了R基因介导的抗病过程。     

水稻基因启动子OsBTF3p的克隆和启动活性分析

 【目的】分子克隆水稻基因OsBTF3启动子片段，明确其对靶基因表达的启动作用，为抗病转基因水稻研究提供理论依据和启动子元件材料。【方法】对OsBTF3编码区上游1387 bp的启动子（OsBTF3p）序列进行了克隆和序列分析，构建了OsBTF3p∷GUS融合基因植物表达载体pCAM-OsBTF3p，利用农杆菌介导的水稻遗传转化，获得了39株OsBTF3p∷GUS转基因植株，对OsBTF3p进行了启动活性、组织特异性及病原菌诱导性分析。【结果】分子克隆了OsBTF3p片段，其序列与GenBank中的已知序列一致。在转基因水稻愈伤组织中能够检测到GUS活性，表明该启动子具有启动活性。在转基因水稻叶片维管束组织和根部组织能检测到GUS活性。水稻白叶枯病菌(Xoo)侵染后OsBTF3p驱动的GUS活性明显地上调表达。【结论】OsBTF3p具有驱动GUS基因表达的启动活性、组织表达特异性和病原菌诱导性。     

大豆rbcS基因启动子的克隆及在转基因烟草中的功能缺失分析

【目的】进一步验证栽培大豆rbcS基因启动子功能,为植物基因工程相关研究提供启动子资源。【方法】从栽培大豆中克隆了rbcS基因5′端上游1 538bp的DNA序列,根据光诱导表达调控元件及顺式作用功能元件所在的位置,设计含1 089,712和190bp 3个5′端缺失体,并将rbcS基因启动子(1 538bp)及3个5′端系列缺失体序列分别与gus基因融合,构建植物表达载体并命名为pGmrbcS、pA、pB和pC,用农杆菌介导法转化烟草,通过gus基因活性变化检测不同缺失体的表达特性。【结果】克隆了1 538bp的大豆rbcS基因启动子序列及1 089,712和190bp的5′端缺失体启动子片段。GUS活性检测表明,在pGmrbcS转基因烟草的叶中GUS活性最高,且与pCAMBIA1301转基因烟草叶片中CaMV35S启动子驱使gus基因的表达量相当,而茎、根中GUS活性较低。GUS定量分析表明,T1代转基因烟草光下培养时,3种缺失体启动子叶片中的GUS表达活性均与CaMV35S启动子相当,其中pB活性最高,是CaMV35S启动子活性的1.4倍,pA、pC活性低于pB,分别为pB活性的84%和71%;含pA的转基因烟草于黑暗中萌发的幼苗叶片gus基因不表达,光下萌发幼苗叶片有gus基因表达,而含有pB、pC的转基因烟草,在黑暗和光下萌发的幼苗叶片中均有gus基因表达,且表达量以pB最高。【结论】含有长度为1 089bp(pA)光诱导元件的rbcS基因缺失体启动子具有光诱导和组织特异表达特性,长度为712bp(pB)的缺失体启动子的启动活性最高。     

马铃薯sgt3基因启动子克隆及其功能鉴定

【目的】克隆马铃薯茄啶鼠李糖基转移酶基因(sgt3)的启动子序列并对其进行功能鉴定.【方法】采用染色体步移技术(genome walking)进行启动子的克隆,构建了该启动子驱动报告基因gfp::gus的植物双元表达载体p1304sgt3p,以pCAMBIA1304为阳性对照表达载体,采用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达及稳定遗传转化,结合GUS组织化学染色对其进行功能鉴定.【结果】电泳图表明为1条长约2 500bp的特异扩增条带,瞬时表达和稳定遗传表达的烟草叶片的GUS组织化学染色结果均显示gus基因在转化烟草叶片中高效表达,并且低于阳性对照,非转化烟草叶片中无表达.【结论】成功克隆到sgt3基因起始密码子上游2392bp的启动子序列并且该启动子具有活性.     

玉米根部特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】从玉米幼根基因组DNA中克隆β-葡萄糖苷酶基因根部特异性启动子序列ZmGLU1P,并对其功能进行分析。【方法】利用PCR技术从玉米品种P138幼根基因组DNA中克隆玉米根部特异性启动子片段ZmGLU1P,将其与GUS基因融合,构建植物表达载体pCAMBIA121-ZmGLU1P,转化到EHA105根癌农杆菌中,通过根癌农杆菌介导法转化烟草NC89,对转化烟草植株进行PCR和Southern杂交检测。采集PCR和Southern杂交检测为阳性的转基因烟草的根、茎、叶,进行GUS活性的组织染色检测。【结果】克隆获得了ZmGLU1P片段,其长度为1 846 bp,与已报道的序列同源性达99%以上。转基因烟草植株的PCR和Southern杂交结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,根中GUS活性最强,而在茎和叶等组织中GUS活性甚微,表明ZmGLU1P片段具有根部特异性启动子功能。【结论】玉米β-葡萄糖苷酶基因上游1 846 bp的片段ZmGLU1P具有根部特异性启动子功能,为根部特异性启动子。     

大豆豆荚特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】克隆大豆豆荚特异性启动子,并对其进行功能分析,为研究抗病虫基因在大豆荚中的特异性表达奠定基础。【方法】利用PCR技术克隆得到豆荚特异性启动子(Pod Specific Promoter,PSP)的核心序列,用PSP序列取代质粒pBI121中的CaMV 35S启动子,构建与GUS基因融合的豆荚特异性报告载体pPSP-GUS,通过农杆菌介导法转化烟草"NC89",对转基因植株进行分子生物学检测,将鉴定为阳性的植株经GUS组织化学染色,验证PSP片段的功能。【结果】所获得的豆荚特异性启动子PSP大小为1 270bp,与已报道序列的同源性为98%,具有多种典型的启动子表达调控元件,如A/T-rich core、CAATBOX、TATABOX、GATABOX等。将pPSP-GUS质粒转化烟草后,经PCR和Southern blot检测结果显示,成功获得了转基因阳性烟草植株。GUS活性检测结果显示,在转pPSPGUS质粒的烟草根和叶片中均未检测到GUS活性,在萼片中可检测到低水平的GUS活性;而在花荚中可检测到高水平的GUS活性,且明显高于转pBI121质粒的对照植株。【结论】克隆得到的豆荚特异性启动子PSP片段具有启动基因在豆荚中特异性表达的功能。     

百合花药和雌蕊特异启动子功能分析

【目的】从"索邦"百合(Lilium orential"Sorbonne")中克隆查尔酮合成酶基因启动子相似序列PCHS2,并对其进行表达模式分析。【方法】从"索邦"百合中PCR扩增PCHS2启动子序列,与GUS报告基因融合,构建植物表达载体,通过农杆菌介导法转化模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana var.Columbia)和矮牵牛(Petuniahybrida "Dreams Midnight"),抗性筛选和PCR检测鉴定转基因植株,GUS组织化学检测分析启动子在转基因植株中的表达模式。【结果】转基因拟南芥和矮牵牛的抗性筛选和PCR检测结果显示,成功地获得了转基因阳性植株。GUS活性分析表明,在PCHS2的驱动下,仅能在花药和雌蕊中检测到GUS活性,茎、叶和其他花组织中都没有发现GUS活性的表达。【结论】PCHS2启动子具有花药专一性。     

烟草MARs的分离及功能鉴定

【目的】研究烟草MARs序列对外源基因表达的影响,从中筛选出能明显提高目的基因表达水平的强MARs序列。【方法】用PCR方法从烟草基因组中克隆得到3个MARs序列(TM1、TM2和TM3),将这3个MARs序列分别顺向构建到植物表达载体pBI121 GUS基因表达盒两端,经农杆菌介导转化烟草,对获得的转基因植株体内的GUS酶活性进行了定量检测,分析MARs对GUS酶活性的影响。【结果】(1)序列分析表明,TM2和TM3是两个新的MARs序列;(2)GUS酶活性的定量检测表明,TM1、TM2、TM3可以使GUS基因的平均表达活性分别提高1.4,5.1和1.3倍,但不同转化个体之间的表达水平有明显差异。【结论】虽然克隆到的3个MARs序列均可提高外源基因GUS的表达,但其并未降低转基因植株个体间外源基因表达水平的差异。     

水稻启动子OsN1p的克隆与功能分析

将OsN1基因上游881 bp启动子(OsN1p)序列取代pBI121中gus基因上游的35S启动子,构建植物表达载体pBIN1p,经农杆菌介导转化水稻品种‘日本晴’,获得转基因植株。GUS组织化学染色结果表明,由该启动子驱动的gus基因能在愈伤组织中较低水平地表达;稻瘟病菌接种转基因植株24 h后,GUS活性为未接种前的4.2倍;5 mmol.L-1水杨酸(SA)和0.5 mmol.L-1茉莉酸甲酯(MeJA)分别喷施转基因植株叶面6 h后,GUS活性分别为处理前的5.9和2.4倍。表明,OsN1p启动子具有启动活性,同时明显具有受稻瘟病菌、SA和MeJA诱导表达的特性。     

大豆种子特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】从大豆中克隆得到β-伴球蛋白α亚基基因的启动子序列7αP,并对其进行功能分析。【方法】利用PCR技术从大豆基因组DNA中分离β-伴球蛋白α亚基基因启动子序列7αP,将其与GUS基因融合,构建种子特异性表达载体p7αP-GUS,通过根癌农杆菌介导法转化烟草(Nicotiana tabacum)NC89,对再生植株进行PCR、Southern blot检测和GUS组织化学分析。【结果】序列分析表明,7αP长度为1 382 bp,其中含有多种种子特异性启动子的序列元件,如RY重复序列元件、E-box、SEF1-motif、SEF4-motif(、CA)n、Dc3启动子结合因子和ACGT序列元件及一些诱导物应答元件。转基因植株的PCR和Southern blot结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,仅能在种子中检测到GUS活性,而在根、茎和叶等其他组织中均未检测到GUS活性。【结论】大豆β-伴球蛋白α亚基基因上游1 382 bp片段具有种子特异性启动子功能,7αP为种子特异性启动子。     

棉花花粉中高效转录U6启动子的克隆及功能分析

【目的】以棉花品种新海16基因组DNA为模板,克隆海岛棉(Gossypium barbadense L.)Gb U6启动子,筛选出能在棉花生殖细胞中(花粉)高效转录的Gb U6启动子,为利用基因组编辑技术进行棉花分子育种奠定重要基础。【方法】采用两轮PCR方法克隆完整的Gb U6启动子。根据网上公布的棉花基因组数据库序列,利用Primer5.0软件设计5对引物,进行第一轮能覆盖完整Gb U6启动子的PCR扩增,产物克隆测序正确后,再利用transfer PCR法将Gb U6启动子精确亚克隆到CRISPR/Cas9基因组编辑载体中;第二轮扩增产物测序正确后,运用DNAMAN软件对克隆成功的5个Gb U6启动子序列中具有转录功能的必要元件进行分析;然后以p BI101质粒DNA为模板,PCR扩增并克隆GUS报告基因,经酶切鉴定、测序正确后,用BbsⅠ酶切GUS,连入经同样酶切后的5个Gb U6启动子对应的CRISPR/Cas9基因组编辑载体中,转化、酶切鉴定,获得对应的5种Gb U6::GUS的表达载体。将含有Ca MV35S启动子驱动的GUS表达载体作为棉花花粉瞬时转化的阳性对照,以上述6种表达载体DNA为模板,采用高保真酶的PCR扩增法获得高浓度DNA片段,利用基因枪轰击法将5种Gb U6::GUS和阳性对照的DNA片段分别转化棉花花粉,并进行GUS染色,最后用体式显微镜观察染色情况。每个启动子的基因枪转化重复3次,最后根据染色深浅筛选出在棉花生殖细胞中高效转录的Gb U6启动子。【结果】经两轮PCR扩增后获得5种Gb U6启动子,启动子长度分别为1 166、1 119、1 134、1 214和1 176 bp,并构建获得了相应的5种CRISPR/Cas9基因组编辑载体;对拟南芥和克隆的5个Gb U6启动子序列进行序列比对,结果表明,Gb U6启动子区与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的-60 bp位置的USE元件和-30 bp位置的TATA框,而且这两个元件之间的距离也非常固定;用Gb U6::GUS的DNA片段瞬时转化棉花花粉,发现基因枪瞬时转化的3次重复结果显示克隆得到的5个Gb U6启动子有4个能驱动GUS在棉花花粉中表达,棉花花粉被染成蓝色。其中Gb U6-5P::GUS的染色相对较深,接近于Ca MV35S启动子。【结论】成功克隆了棉花生殖细胞中高效转录的Gb U6启动子,为构建棉花CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统提供了有效的启动子。     

番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立

【目的】从番茄中克隆高效转录的SlU6启动子,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,并在番茄中建立CRISPR/Cas9系统,为番茄功能基因组学和分子育种研究提供技术基础。【方法】采用PCR方法从‘中蔬四号’番茄品种中克隆4种SlU6启动子,利用Transfer PCR方法分别对4个启动子进行两种不同长度的截短,分别构建8个截短的SlU6启动子驱动GUS的植物融合表达载体。利用农杆菌瞬时转化法分别转染番茄叶片,通过GUS染色筛选出在番茄叶片中转录活性较高的SlU6-2启动子。采用DNA重组技术构建以SlU6-2为启动子驱动sg RNA,以番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体。载体构建成功后,采用PEG法转化番茄原生质体,提取基因组DNA,采用酶切/PCR法分析内源基因突变情况;采用测序法分析内源基因突变的类型。利用突变位点频率分布图来验证番茄内源启动子在番茄CRISPR/Cas9系统中的有效性。【结果】经过两轮PCR,共获得4种8个不同长度的番茄U6启动子,其长度分别是452、202、448、206、433、190、448和218 bp,启动子序列比对分析发现番茄U6启动子与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的两个元件,USE和TATA框。成功构建了8个SlU6启动子分别驱动GUS的植物融合表达载体。番茄叶片染色结果显示转化后的番茄叶片均被染成蓝色,表明克隆的番茄8个SlU6启动子均具有转录活性。选择SlU6-2P4为启动子驱动sg RNA,成功构建番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,验证结果表明番茄内源启动子SlU6-2P4能有效地驱动sg RNA的转录,并成功实现对番茄内源基因的编辑。内源基因突变的类型都为碱基替换,突变热点仅存在于内源基因靶序列区。【结论】成功克隆了4种在番茄叶片中高效转录的SlU6启动子;基于SlU6-2启动子的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,在番茄中成功实现对内源基因的编辑。     

万寿菊番茄红素β-环化酶基因及其启动子克隆和功能分析

【目的】克隆万寿菊番茄红素β-环化酶基因和其启动子,进行生物学信息分析,并预测启动子功能,为万寿菊类胡萝卜素的代谢机制和叶黄素含量的调控提供参考依据。【方法】通过RT-PCR技术从万寿菊总RNA中克隆得到TeLCYb的cDNA序列;应用生物学方法分析其DNA序列及其编码蛋白质序列特征,使用DNAMAN和在线软件Box Shade对其氨基酸序列同源性比对分析,并利用MEGA6.0构建进化树,分析其亲缘关系;根据其cDNA序列利用FPNI-PCR法克隆其启动子序列,利用Plant Care在线数据库分析万寿菊TeLCYb启动子调控元件,构建启动子缺失表达载体pTeLCYb(-1969)∷GUS和pTeLCYb(-1140)∷GUS,利用农杆菌介导法侵染烟草,以GUS为报告基因研究不同调控元件的活性。【结果】从万寿菊中成功克隆TeLCYb,生物信息学分析发现,其全长共1 865 bp,开放阅读框为1 527 bp,编码508个氨基酸,氨基酸序列同源比对结果表明其与西洋蒲公英和菊花的同源性最高,且具有LCYb蛋白质特有的保守功能位点和特征多肽序列,在进化上与菊科单独聚为一枝。在已知基因序列的基础上获得长度为1 806 bp的TeLCYb启动子序列,生物学信息分析表明:该启动子除包含核心启动子元件TATA-box、CAAT-box外,还含有多种光应答元件和激素响应元件,其中光响应元件有13个,激素响应元件有5个,此外还具有MYBHv1结合位点元件、耐热响应元件、生理调控作用元件等顺式调控元件。GUS化学组织染色结果显示不同长度启动子均能够驱动GUS在茎、叶、花药及柱头中表达,但不同组织GUS染色蓝色斑点深度不同,其中花器官中花药和柱头中GUS酶活性最强;相对于启动子pTeLCYb(-1969),pTeLCYb(-1140)启动子还能够驱动GUS在根、叶和花萼中特异性表达,且各组织中GUS酶活性明显强于启动子pTeLCYb(-1969)的GUS化学组织染色结果。【结论】不同长度TeLCYb启动子均能驱动下游GUS的表达,但启动子的作用部位和作用强度存在差异,推测在ATG上游1 140 bp和164 bp区间的光响应元件可能具有增强子的功能,而全长启动子特有的激素响应元件和热响应元件可能具有抑制或降低启动子功能的作用。     

毛白杨抗坏血酸过氧化物酶启动子克隆与分析

【目的】研究毛白杨抗坏血酸过氧化物酶（APX）的基因启动子在转录调控中的作用，为进一步探讨抗坏血酸过氧化物酶启动子在植物抗逆中的应用奠定基础。【方法】依据毛白杨与毛果杨基因的高度同源性，以毛果杨LG-IX染色体上抗坏血酸过氧化物酶启动子序列为模板设计引物，从毛白杨总DNA中克隆一段启动子序列。【结果】克隆出的抗坏血酸过氧化物酶启动子序列长1234 bp，与毛果杨同源基因的同源性高达81.96%。该启动子包含多种可能与胁迫相关的顺式作用元件保守序列，这些顺式作用元件参与光调节转录、激素信号和植物防御信号的应答，PpAPX-IX基因在老叶叶肉和老叶叶脉中表达较多，老叶中表达较多,在新叶中表达较少；在生长旺盛的部分比如根和形成层表达量很低或不表达。【结论】该启动子能为组织特异性启动子，受多种逆境胁迫产生的化学信号的诱导在成熟细胞中特异性表达，可以构建该启动子连接PBI101的表达载体。     

β-氨基丁酸诱导马铃薯对晚疫病的抗性组织化学及信号传导途径分析

【目的】β-氨基丁酸（BABA）田间或离体叶片喷洒能够有效诱导马铃薯防卫反应,增强对晚疫病的抗性。研究从组织化学层面进一步探究BABA诱导马铃薯晚疫病抗性过程中诱发的防卫反应及相关信号途径,为深入研究BABA诱导马铃薯产生晚疫病抗性的可能机制奠定基础。【方法】用4 mmol?L-1 BABA或蒸馏水（对照,Mock）喷洒马铃薯植株叶片,3 d后取离体叶片接种晚疫病菌（Phytophthora infestans）,接种后不同时间用打孔器取接种点叶盘用于织化学染色和过敏反应（HR）观察。采用二氨基联苯胺（DAB）组织化学染色方法检测接种点周围活性氧（H2O2）累积情况;叶盘用苯胺蓝（aniline blue）染色,然后在荧光显微镜下观察接种点周围胼胝质积累和表皮细胞HR发生情况;利用干涉了StCOI1（阻断了茉莉酸JA信号传导途径）和超量表达细菌水杨酸羟化酶基因NahG（阻断了水杨酸SA信号传导途径）的转基因马铃薯株系为材料,通过研究BABA能否在这些特殊马铃薯材料上有效诱导晚疫病抗性,进而推断BABA诱导马铃薯晚疫病抗性可能参与的信号途径。【结果】用清水作为空白接种时,Mock和BABA预处理叶片各时间点均未观察到H2O2积累,而病原菌接种处理24 h后,Mock和BABA预处理叶片接种点周围都出现H2O2积累,随着病原诱导时间的延长,H2O2积累增强。但是,BABA预处理叶盘中接种点周围H2O2累积比对照提前12 h,且累积量显著强于对照。苯胺蓝染显示Mock和BABA预处理叶片在接种清水时检测不到胼胝质的沉积,而接种晚疫病菌24 h后,Mock和BABA预处理叶片上均观察到胼胝质的沉积,BABA预处理叶片在侵染点及其附近胼胝质积累量要显著高于对照。荧光显微观察结果显示,BABA预处理和Mock叶片晚疫病接种点周围表皮细胞均有HR发生,BABA预处理叶片早在接种24 h后,接种点周围就已出现HR反应;接种48 h时,BABA预处理85%叶盘的接种点周围表皮细胞出现HR,而Mock叶片只有30%叶盘上观察到HR,BABA预处理叶片HR发生频率比Mock叶片高出55%。BABA不能在超量表达NahG的马铃薯叶片上有效诱发抗性,但能够在干涉了StCOI1的马铃薯叶片上正常诱导产生抗性。【结论】BABA能够从H2O2和胼胝质累积以及HR发生多个层面有效诱发马铃薯基础防御反应,BABA预处理能够在病原菌侵染点周围显著提高胼胝质和H2O2积累水平,诱发接种点发生较高频率的HR,从而提高马铃薯对晚疫病的抗性;BABA诱导马铃薯对晚疫病的抗性依赖水杨酸信号传导途径,但不依赖茉莉酸信号传导途径。     

基于转录组分析苹果水杨酸特异响应基因MdWRKY40的启动子鉴定

【目的】探明水杨酸(SA)对苹果叶片基因转录调控的影响,鉴定SA信号途径及其调控基因,为研究SA介导的抗病分子机制提供理论依据。【方法】生长30 d的‘嘎啦’组培苗叶片用2 mmol·L-1水杨酸(SA)处理12 h,以CTRL(0.2%乙醇)处理作为对照,利用Illumina Hi Seq TM 2000进行转录组测序,通过综合的生物信息学分析(差异基因筛选、条件特异性分析、GO分类及KEGG富集分析等)筛选SA信号途径的调控基因。克隆受SA特异性诱导表达基因的启动子,利用苹果细胞原生质体转化技术,进行启动子活性鉴定,确定对SA进行特异性响应的核苷酸序列。【结果】CTRL和SA处理分别获得750 439 459 bp和751 596 153 bp的原始数据,分别有44.77%和43.88%与‘金冠’苹果基因组完全匹配。获得3 329个显著性差异基因,包括苯丙烷类、类黄酮等次生代谢物生物合成途径的相关基因(如木质素合成关键酶CAD、细胞色素P450、真菌抗性相关的β-1,3-葡聚糖酶等),调控植物病原菌互作途径重要功能基因(钙调蛋白Ca M、抗病蛋白RPM1、热激蛋白HSP90、WRKY转录因子等)以及33个条件特异性诱导表达基因(NAC转录因子、NIMIN1、WRKY40、ERF转录因子等)。其中1 085个基因上调,2 244个基因下调。差异基因主要涉及细胞过程、代谢过程和基因绑定、催化活性等;根据转录组学的结果,将SA响应基因Md WRKY40的启动子序列克隆到含有荧光素酶基因的表达载体中,置于荧光素酶基因的上游,转化苹果原生质体细胞。SA处理的原生质体细胞,荧光素酶的活性为未经SA处理的20.6倍,而脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、1-氨基环丙烷羧酸(ACC)对荧光素酶的活性没有影响,说明该启动子为苹果中对SA进行特异性响应的启动子序列。不同区段的启动子片段对SA响应能力不同,从Md WRKY40翻译起始位点ATG向上游500—1 000 bp只能响应高浓度SA,而对低浓度SA不具有响应能力,1 500 bp片段对高浓度SA响应能力进一步显著增强,对低浓度SA响应也有微弱提高;而长度为2 000 bp的核苷酸片段无论对高浓度SA还是对低浓度SA都具有显著响应能力,且达到最强。与2 000 bp片段相比,2 500 bp的核苷酸片段没有进一步增强启动子片段对SA的响应能力。超表达Md WRKY40蛋白对其自身的转录具有抑制作用。【结论】2 mmol·L-1 SA处理所影响的基因主要参与了苯丙烷类、类黄酮的生物合成,植物病原菌互作及植物激素信号转导途径。位于Md WRKY40开放阅读框上游的2 500 bp核苷酸序列,为对SA进行特异性响应的核苷酸启动子序列。在1 000—1 500 bp及1 500—2 000 bp具有显著提高启动子对SA敏感性的未知核苷酸序列,另外,Md WRKY40转录调控存在反馈抑制机制。     

森林草莓FveD27的表达特性和功能

【目的】新型植物激素独脚金内酯是调控植物分枝发育的关键因子,但独脚金内酯在草莓生长发育中的作用尚不清楚。揭示森林草莓（Fragaria vesca）中独脚金内酯生物合成关键基因DWARF27（D27）的表达特性及主要功能,探索FveD27在草莓分枝以及生长发育过程中的作用,为研究草莓植株构型奠定理论基础。【方法】本研究选用森林草莓作为试验材料,利用RT-PCR方法克隆FveD27的编码区序列,利用MEGA 6.0分析草莓FveD27与苹果、拟南芥等物种中D27的系统进化关系;构建FveD27与GFP的融合载体,利用注射烟草叶片的方法对FveD27进行亚细胞定位分析;通过qRT-PCR技术对FveD27在森林草莓不同器官的表达水平进行定量分析,同时构建FveD27启动子与GUS融合表达载体并通过农杆菌介导法将其转化到森林草莓中,利用GUS染色进一步分析FveD27的表达特性;构建FveD27过表达载体并通过农杆菌介导的叶盘法进行稳定遗传转化,获得FveD27过表达草莓株系。【结果】从森林草莓中克隆出编码区长度为789 bp的FveD27序列;烟草的亚细胞定位结果表明FveD27定位在叶绿体;FveD27在森林草莓组织器官中的表达量由高至低依次为幼叶、茎尖、叶柄、成熟叶、根;克隆出长度为1 670 bp的FveD27启动子序列,GUS活性分析结果显示转pFveD27::GUS融合基因草莓植株的幼叶和芽等部位GUS活性较强,而成熟叶与叶柄部位GUS活性较弱,根部几乎无GUS活性,GUS染色分析揭示的基因表达结果与qRT-PCR结果相符;构建了FveD27过表达载体并通过农杆菌介导获得了过表达FveD27的草莓转基因株系,表型调查结果表明过表达FveD27能够显著抑制新茎分枝的形成,同时增加花序数量。【结论】FveD27具有调控森林草莓新茎分枝发育、花序数量等功能。研究结果可为调控草莓新茎分枝数量和产量等提供新思路。     

甘蔗可溶性酸性转化酶（SoSAI1）基因的克隆及表达分析

【目的】克隆甘蔗可溶性酸性转化酶基因（SoSAI1）全长cDNA序列和5?侧翼启动子序列,并分析其序列特征和基因表达模式。【方法】利用RACE技术克隆SoSAI1的全长cDNA序列,应用生物信息学软件分析SoSAI1预期编码蛋白特征;采用Genome Walking技术克隆SoSAI1的启动子序列;采用实时荧光定量PCR分析不同生长期SoSAI1在甘蔗叶和茎中的表达,以及PEG 6000、100 mmol•L-1 NaCl和6℃胁迫下,SoSAI1在甘蔗苗期根和叶中表达模式。【结果】SoSAI1的cDNA序列全长为2 387 bp,ORF长2 058 bp,编码685个氨基酸,预测其分子量和等电点分别为74.44 kD和5.6,GenBank登录号为JQ406875。5?侧翼启动子序列长417 bp,含有胚乳特异表达顺式作用元件和参与干旱诱导的MYB结合位点,GenBank登录号为KC862314。SoSAI1表达在生理成熟期的花序和花序轴中较高,而在成熟茎和老茎中较低。15%PEG和6℃能诱导叶中SoSAI1表达,而15%PEG和NaCl能诱导根中SoSAI1表达。【结论】获得SoSAI1全长cDNA序列和部分启动子序列,SoSAI1在甘蔗生长发育和蔗糖积累,并在应对环境胁迫中发挥作用。