拟南芥At3g28220基因抗寒功能初步分析

采用RT-PCR分析、基因克隆、转化等方法对At3g28220基因功能进行了研究.结果发现At3g28220基因在拟南芥受到低温及盐胁迫时才会在拟南芥中表达,且在不同生长期不同器官中的表达量无明显差异.通过构建35s:At3g28220基因正反向表达载体转化拟南芥,T1植株经卡那霉素抗性筛选,RT-PCR检测,结果表明At3g28220基因已经整合到拟南芥基因组中,并在转录水平表达.正常生长条件下,转基因拟南芥与野生型拟南芥的生长未见明显区别,而经过低温胁迫研究发现,正向表达转基因拟南芥的冷冻耐受能力明显高于野生型植株.说明拟南芥hos10-1冷驯化能力的丧失是与At3g28220基因的表达下调有直接的关系.     

盐胁迫下转 DcCIPK24 拟南芥的转录组比较分析

【 目 的】 探 究 铁 皮 石 斛（Dendrobium catenatum Lindl.）DcCIPK24 的 下 游 响 应 基 因， 为 研 究DcCIPK24 提高耐盐性的分子调控途径提供指导。【方法】利用 Illumina NovaSeq 6000 测序平台对 200 mmol/L NaCl 处理和对照组的转 DcCIPK24 拟南芥、野生型拟南芥进行测序，分析差异表达基因的富集通路，并对通路中的差异基因进行荧光定量 PCR 验证。【结果】盐胁迫下，从 2 个转基因拟南芥株系与野生型拟南芥的比较组合中共鉴定出 96 个差异表达基因；GO 注释分析发现 96 个差异基因主要被富集在分子功能相关通路；KEGG 富集分析发现差异基因主要被注释在氨基糖和核苷酸糖代谢、植物 MAPK 信号通路和甘油酯代谢通路中，选取上调表达的差异基因 AtGPAT5、AtSIRK、AtMEE25、AtUGE5 和下调表达基因 AtAMT1-2、AtATTI3、AtCYP71A25、AtLHCB4.3 进行实时荧光定量 PCR 验证，结果表明盐胁迫下 8 个差异基因表达趋势与转录组数据基本一致。【结论】盐胁迫下，DcCIPK24 主要通过氨基糖和核苷酸糖代谢途径、植物 MAPK 信号途径和甘油酯代谢通路响应耐盐。     

cDNA芯片筛选亚洲棉短绒分化发育相关基因

 【目的】筛选亚洲棉短绒分化发育相关基因。【方法】利用cDNA芯片技术在棉纤维发育前期开花前3天(-3DPA)、开花当天(0DPA)、开花后3天(+3DPA)、5天(+5DPA)、7天(+7DPA)筛选野生型DPL971与其短绒突变体DPL972的差异基因。通过与模式植物拟南芥数据库相结合,找到与棉纤维起始发育相关基因,并通过RT-PCR和Real-Time PCR（QRT-PCR）验证部分侯选基因。【结果】筛选出与亚洲棉纤维起始分化发育相关基因8个,其中相对应的与拟南芥同源性较高的蛋白有7个,分别为KAK（DR461366）、MYB5（ES812048）、TTG1（ES811600）、MYB23（DR453866）、CSLD3（DR459646）、RHD2（DR461821）和ZWI（ES791383）,这些基因在拟南芥的表皮毛起始发育过程中都起着重要的作用。RT-PCR和QRT-PCR结果表明MYB23、MYB5、TTG1、CSLD3、RHD2这5个基因在短绒突变体DPL972与其野生型DPL971的+3DPA胚珠中表达差异都有差异。【结论】上述结果表明这5个基因可能与短绒分化发育相关,第1个基因可能抑制短绒分化和发育,后4个则促进短绒分化和发育。     

热激因子AtHsfA1a突变对热胁迫中拟南芥抗坏血酸过氧化物酶的影响

【目的】探讨热激因子AtHsfA1a突变对热胁迫中拟南芥抗坏血酸过氧化物酶的影响。【方法】以T-DNA插入AtHsfA1a基因突变拟南芥及野生型植株为材料,采用分光光度法比较热胁迫下不同基因型植株的抗坏血酸过氧化物酶(APX,EC1.11.1.7)活性的变化,RT-PCR法研究AtHsfA1a对APX表达的影响,染色质免疫沉淀技术和凝胶阻滞电泳分析体内外研究AtHsfA1a与APX基因启动子区的结合情况。【结果】在热胁迫下AtHsfA1a基因突变拟南芥植株中的APX的活性低于野生型,且AtHsfA1a基因突变拟南芥植株中的APX的mRNA的相对量低于野生型;体内研究发现在热胁迫下AtHsfA1a基因突变拟南芥植株中未筛选出APX基因启动子区片段,而野生型筛选出APX基因启动子区片段,体外研究发现AtHsfA1a与APX基因启动子区的结合是直接的。【结论】热激因子AtHsfA1a突变对热胁迫中拟南芥APX的影响是从转录调控水平直接影响APX的表达。     

拟南芥热激转录因子AtHsfA6a的克隆与细胞定位分析

【目的】研究拟南芥热激转录因子AtHsfA6a在植物细胞中的定位及其作用机制。【方法】用RT-PCR方法从野生型拟南芥总RNA中,扩增获得了849 bp的拟南芥热激转录因子AtHsfA6acDNA片段,经过测序,结果与公布的序列完全相同。将该片段与绿色荧光蛋白(GFP)基因的cDNA重组,并克隆到表达载体pCHF3上,经PCR与酶切检测表明构建的表达载体正确。按照Clough等的方法转化拟南芥,经Kanamycin筛选和PCR检测,得到转基因植株;用激光共聚焦扫描荧光显微镜观察转基因植株幼苗的根部。【结果】在正常条件下,融合蛋白存在于细胞质中。【结论】在正常条件下拟南芥热激转录因子AtHsfA6a在细胞质中表达。     

Ath-miR169d介导的拟南芥叶片发育的分子调控机制

【目的】探究ath-miR169d在拟南芥叶片发育过程中的作用,明确其调控的分子机制,为增强叶菜类植物的光合效率以及增加生物量和提高作物产量提供理论依据。【方法】选取ath-miR169d过表达和降低表达的拟南芥转基因株系以及野生型拟南芥,在22℃、相对湿度60%、16 h/8 h光周期条件下培养,观察不同生长阶段叶片发育表型的差异;同时构建pmiR169d::GUS表达载体,转化农杆菌EHA105,并利用蘸花法转化野生型拟南芥(Columbia,Col-0),获得转基因拟南芥,利用GUS染色对ath-miR169d在拟南芥不同组织器官中的表达模式进行研究;选取8周龄的过表达材料和野生型对照株系,对其叶片表皮细胞形态进行扫描电镜分析;对4周龄过表达材料和野生型对照株系的幼苗顶端分生组织和叶片中总IAA进行定量分析,并进行基因芯片表达谱分析,筛选差异表达基因;通过实时荧光定量PCR对生长素信号途径部分差异表达关键基因的表达情况进行分析。【结果】Ath-miR169d过表达拟南芥株系莲座叶数目较野生型少,叶片小,而ath-miR169d降低表达的拟南芥株系的莲座叶较野生型多,叶片大,且在抽薹和种子成熟之后还持续长出新叶,而野生型莲座叶则在种子成熟之后逐渐衰老干枯;扫描电镜观察到ath-miR169d过表达拟南芥株系叶片中表皮细胞小于野生型;表达模式分析表明,ath-miR169d主要在顶端分生组织(shoot apical meristem,SAM)和叶片维管系统中表达,且新叶中表达强。SAM是产生生长素的部位,IAA测定结果表明ath-miR169d过表达拟南芥株系中IAA含量显著降低,为野生型植株的38.6%,同时基因芯片表达谱分析也验证了ath-miR169d参与调控植物体内激素信号转导途径。进一步研究发现,ath-miR169d过表达株系中生长素合成关键基因YUC2和转运体蛋白基因PIN1均显著下调表达,而具有转录抑制功能的生长素响应因子1和2基因(ARF1和ARF2)表达上调;STTM miR169d低表达株系中这4个基因的表达则为相反趋势,该结果与观察到的表型相一致。【结论】Ath-miR169d通过介导生长素信号途径参与了拟南芥叶片发育的调控,ath-miR169d表达量发生变化会影响叶片的数量和大小,最终影响整个植株的生物量。     

MaASR1基因通过乙烯途径提高拟南芥抗旱性的作用机制

香蕉MaASR1基因在植物响应逆境胁迫时发挥着重要作用,为了进一步研究MaASR1基因转入拟南芥后增强其抗旱性的分子机制,运用DNA芯片技术来筛选野生型拟南芥和转MaASR1基因拟南芥在不做任何胁迫处理和干旱胁迫处理条件下的差异基因。发现MaASR1提高拟南芥抗旱性与乙烯信号途径有密切的关系,对基因芯片中与乙烯途径相关的上调和下调大于2倍的差异基因进行了荧光定量PCR的验证。结果表明在干旱胁迫条件下,MaASR1的转入通过提高At ACS6和At ACO1的表达水平提高了拟南芥体内的乙烯合成水平。MaASR1的转入可以通过正调控乙烯反应和提高ERF类基因的表达来赋予植物抗旱性。以上结果为解析MaASR1基因作为转录因子通过乙烯途径提高植物抗旱能力的分子机制奠定了基础。     

FaGST基因过量表达获得拟南芥转基因植株

【目的】探明FaGST基因的功能和分子调控机制,为其后期的抗性利用与研究提供科学依据。【方法】利用前期构建的pCAMBIA1300-35S空载体和pCAMBIA1300-35S-FaGST过表达载体,将其转化感受态(DH5α)细胞后导入农杆菌GV3101,利用花序侵染法转化拟南芥,通过潮霉素(Hyp)进行筛选、PCR鉴定,并利用实时荧光定量PCR检测其表达量。【结果】FaGST基因成功导入拟南芥中,获得6株空载体转基因拟南芥植株和8株转FaGST基因拟南芥植株;8株转基因拟南芥植株的FaGST基因表达量为1.31～2.06,较野生型拟南芥植株表达量（1.00）显著或极显著提高。【结论】成功获得拟南芥转基因纯合植株,FaGST基因在拟南芥植株中已过量表达。     

拟南芥缺失突变体at14a的比较转录组分析

以at14a相关基因型(野生、缺失)拟南芥植株为试验材料,利用转录组学和生物信息学等方法,分析野生型(col)、缺失突变体(at14a)拟南芥差异基因表达状况,初步探讨拟南芥AT14A的功能。结果表明:at14a在拟南芥植株根、茎、叶和花中均有表达,尤其在叶片中的表达量较高;相较于野生型,缺失突变体at14a中有194个差异基因,其中上调基因122个,下调基因72个;通过GO富集分析发现,2种基因型植株差异基因主要参与了应答胁迫过程,这表明at14a可能通过调控AT5G39610、AT1G53240、AT4G32770、AT1G02920、AT1G10760这些逆境胁迫相关基因的表达来参与应答胁迫。差异分子主要定位于细胞核,具有绑定的分子功能。通过pathway分析发现,2个基因型植株差异基因主要参与了核糖体代谢、碳水化合物代谢、光合等代谢途径。研究结果为深入研究at14a作用的分子机理奠定了基础。     

拟南芥木聚糖合成关键酶基因的调控研究

【目的】从目前已知的参与拟南芥Arabidopsis thaliana次生壁加厚生长的转录因子着手,分析这些次生壁相关的转录因子是否能够调控木糖合成关键酶基因FRA8、IRX9、IRX10、IRX14、F8H、IRX9-L、IRX10-L和IRX14-L的表达,并且观察KNAT7基因显性抑制植株的表型.【方法】通过Gateway技术构建效应器和报告器,进行瞬时转录激活试验,同样构建pCAMBIA1304-p35S∷KNAT7-SRDX重组质粒,用农杆菌Agrobacterium tumefaciens花序浸染法将此质粒转化到野生型拟南芥植株中.【结果和结论】瞬时转录激活试验表明,转录因子KNAT7、MYB46、ERF72、SND1、NST2能够激活多个拟南芥木聚糖合成关键酶基因的表达,其中KNAT7能促进基因FRA8、IRX9和IRX14-L的表达.KNAT7基因显性抑制能显著影响拟南芥的生长.试验结果表明KNAT7基因可能在木聚糖的合成中起着重要的调控作用.     

拟南芥TUA2参与ABA胁迫下的种子萌发过程

 【目的】利用反向遗传学研究拟南芥TUA2与ABA途径相关基因的相互关系以及对种子萌发的影响。【方法】采用PCR、Tail PCR和RT-PCR技术对来自ABRC的T-DNA插入TUA2突变体进行插入位点的鉴定和转录活性的分析;利用转基因技术获得TUA2超表达植株;检测了含不同浓度ABA的MS培养基中各突变体和TUA2超表达植株的种子萌发;通过RT-PCR检测了突变体中ABA途径相关基因HAB、ABI1、RD22和P5CS的表达变化。【结果】突变体tua2-1和tua2-2的T-DNA插入位点均位于TUA2的启动子区,且二者的TUA2表达量均升高。在含有ABA（0.8 μmol•L-1）的MS培养基中,突变体和转基因等5个株系的种子萌发延迟,播种第5天萌发率在6%—18%,相同条件下的野生型种子萌发率为76%;ABI1和HAB在TUA2超表达体中的表达明显低于野生型,受ABA诱导后被诱导表达的程度也远低于野生型。【结论】TUA2可能参与了ABA信号途径对种子萌发过程的调节。     

不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的克隆及其在拟南芥中的转化

 【目的】克隆不结球白菜硝酸还原酶基因（BcNR ），并转化拟南芥做初步的功能鉴定。【方法】采用分段RT-PCR及3′RACE和5′RACE技术克隆了BcNR基因的全长cDNA,利用生物信息学方法进行序列分析和蛋白结构分析。构建pCAM-BcNR植物过量表达载体，通过农杆菌介导的真空渗透法将其转入野生拟南芥中，经抗性筛选及PCR验证获得T0代转基因植株，用Real-time PCR方法对30 mmol?L-1 KNO3溶液处理的转基因拟南芥的硝酸还原酶基因表达进行检测，并测定转基因植株的硝酸还原酶活性。【结果】获得了编码不结球白菜硝酸还原酶基因(BcNR )的cDNA全序列3 049 bp，包含有2 733 bp的开放阅读框，编码910个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、烟草、甘蓝型油菜、马铃薯等编码的氨基酸序列具有较高同源性。蛋白质结构域分析表明，所推导的氨基酸序列具有完整的硝酸还原酶结构，同时证明从不结球白菜中克隆的这条基因属于NADH-NR型。GenBank登录号为EU662272。转基因拟南芥T0代植株进行GUS基因PCR检测，证明重组质粒已整合到转基因植株基因组中。硝酸盐处理后的转基因植株硝酸还原酶基因的表达比野生型显著提高，且硝酸还原酶活性有不同程度的提高。【结论】本研究首次从不结球白菜中克隆获得BcNR基因的全长cDNA序列，揭示了其序列特征并对其进行了初步的功能鉴定，为进一步利用该基因开展蔬菜硝酸盐含量的基因调控研究奠定了基础。     

水稻直立短穗突变体esp的转录组研究

【目的】克隆水稻直立短穗基因Erect and Short Panicle（ESP）,分析其参与的基因调控途径,解析ESP控制株型、穗长等农艺性状的分子机理。【方法】以直立短穗突变体esp及其野生型为材料,成熟期进行株高、穗长、粒长等表型测定;构建籼粳杂交F₂定位群体,挑选与突变表型一致的F₂单株,利用与突变性状连锁的分子标记对目的基因进行定位;对野生型和突变体进行基因组测序,结合定位结果,找到突变位点,克隆ESP;利用生物信息学软件进行进化树和基因表达分析;提取野生型和突变体幼穗中的RNA并建库,GO（gene ontology）聚类分析表达差异基因,同时根据KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库,分析野生型和突变体中植物激素信号转导和内质网蛋白加工相关基因的表达变化,并通过qRT-PCR验证。【结果】通过表型观察和农艺性状调查,与野生型相比,直立短穗突变体esp株高降低,穗长变短,穗型由弯曲变为直立,每穗粒数减少,粒长变短,粒宽和千粒重增加;有效穗数无显著差异。利用突变体esp与PA64构建籼粳F₂定位群体,将目的基因定位于水稻第7染色体长臂标记C7-11和C7-14之间7.58 Mb区间内,基因组测序发现LOC_Os07g42410第6内含子与第7外显子连接位点由碱基G变异为A,导致第6内含子不能被剪切,蛋白翻译提前终止;该基因与已报道的OsDEP2/OsEP2为等位基因。进化分析显示该基因广泛存在于单子叶和双子叶植物中;表达分析表明ESP在茎秆、花序、雌蕊、内外稃和子房中高度表达,其表达水平随着子房变大而逐渐降低。利用转录组分析突变体和野生型幼穗中的基因表达,结果表明,与野生型相比,esp突变体中表达差异显著（差异>1.5倍）的基因630个,其中235个表达上调,395个表达下调。GO分析显示植物激素信号转导和内质网蛋白加工相关基因受到不同程度地调控,利用qRT-PCR进行验证,结果与转录组数据一致。【结论】直立短穗基因ESP与已报道的直立穗基因OsDEP2/OsEP2为等位基因,其突变导致株高降低、穗长变短等多个表型;ESP可能通过调节植物激素信号转导、内质网蛋白加工过程中的基因表达,进而影响植株的发育。     

粘液繁殖体植物抱茎独行菜TTG1基因转化拟南芥的表型研究

[目的]将过量表达典型粘液繁殖体植物抱茎独行菜TTG1基因(LpTTG1)的转基因拟南芥株系表型与野生型和突变体进行比较,为深入研究LpTTG1基因的功能提供参考依据。[方法]在体视显微镜下,通过对拟南芥野生型、ttg1突变体及LpTTG1基因过表达转基因株系的植株表型,幼苗叶表皮毛、下胚轴和根毛以及种子形态进行观察比较。[结果]拟南芥ttg1突变体与野生型和LpTTG1过表达转基因型的幼苗在下胚轴的颜色、根毛着生方式、真叶表皮毛等方面有显著差异,但后两者表型间无显著差异。[结论]缺失TTG1基因可导致拟南芥幼苗形态发生显著变化,但此基因过量表达不一定对拟南芥形态产生影响。     

苎麻谷氨酰胺合成酶BnGS2等位基因的克隆及其转基因烟草特性

【目的】克隆谷氨酰胺合成酶BnGS2等位基因,分别构建其超量表达载体,并探讨其在转基因烟草中对氮代谢的影响。【方法】依据苎麻转录组unigenes和RT-PCR技术克隆苎麻BnGS2等位基因,利用内切酶TaqⅠ对目的等位基因在中苎1号自交F1和亲本中进行酶切鉴定,并利用生物信息学对基因序列和结构特征进行分析;通过同源重组技术分别构建BnGS2等位基因的超量表达载体,并在农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404的介导下,通过叶盘法将超量表达载体转入烟草中,通过Kan筛选、转化植株基因组DNA PCR验证获得转基因T0植株;利用qRT-PCR分析BnGS2等位基因在转基因T1植株中的相对表达水平,并测定植株叶片中的GS活性、株高、鲜重、可溶蛋白及总氮含量。【结果】首次从苎麻中克隆了一对GS2等位基因,命名为BnGS2-1和BnGS2-2,等位基因序列全长1 340 bp,含有一个1 293 bp的ORF区,编码430个氨基酸残基多肽;等位基因核苷酸序列在11个位点上存在差异,导致编码的多肽在195、382位点上的氨基酸残基存在替换现象（BnGS2-1为脯氨酸和天冬酰胺,BnGS2-2为苏氨酸和丝氨酸）;NCBI BLASTP分析表明苎麻BnGS2与Pisum sativum、Vigna radiata、Glycine max、Phaseolus vulgaris、Medicago truncatula具有很近的亲缘关系;构建了能分别超量表达BnGS2-1和BnGS2-2的载体,并获得能分别超量表达BnGS2-1和BnGS2-2转基因烟草植株;与野生型烟草植株相比,超量表达BnGS2等位基因（BnGS2-1和BnGS2-2）都能显著性提高转基因植株叶片GS活性、鲜重和可溶性蛋白的含量,株高和总氮含量也有增加,但没有达到显著性水平。另外,超量表达不同BnGS2等位基因（BnGS2-1和BnGS2-2）的转基因烟草植株,在株高、鲜重、叶片可溶性蛋白及总氮含量上并没有显著性差异。【结论】在烟草中分别超量表达来源苎麻的BnGS2等位基因（BnGS2-1或BnGS2-2）均能显著提高转基因植株的生物产量和氮利用效率,并且所克隆的2个等位基因BnGS2-1和BnGS2-2在功能上并无显著差异。     

一个短季棉芽黄基因型的鉴定及生理生化分析

 【目的】鉴定新的早熟棉花芽黄突变体，为揭示航天诱变机理和芽黄突变体的利用提供理论基础。【方法】以中棉所58芽黄突变体为材料与野生型、棉花中期库17份芽黄材料进行正、反交，通过遗传学分析、叶绿体的超微结构观察和抗氧化系统酶活性测定，比较中棉所58芽黄突变体Vsp与野生型的各性状差异。【结果】中棉所58芽黄突变体Vsp和野生型中棉所58正、反交F2叶色表现符合绿叶﹕黄叶为3﹕1的分离结果，说明该突变体的芽黄性状由隐性核基因控制，中棉所58芽黄突变体Vsp和其它17份芽黄材料正、反交，虽有材料杂交后代有极个别表现芽黄表型，但绝大部分（95%以上）都表现为正常绿色，说明控制中棉所58芽黄突变体Vsp芽黄性状的基因和其它17份已经鉴定的芽黄材料控制该性状的基因不等位。叶绿体的超微结构表明，芽黄突变体叶绿体发育存在一定的缺陷，发育比较滞后，基粒类囊体和基质类囊体垛叠数较少，排列比较混乱，但随着叶片的不断发育，之后逐渐达到野生型的发育水平。芽黄材料的株高、果枝数、大铃、小铃、产量和纤维品质显著低于对照，芽黄突变体的SOD和CAT活性低于对照，POD活性高于对照，说明其抗氧化能力远低于对照。【结论】利用航天诱变技术，经过多代连续自交，获得芽黄性状稳定遗传且不同于棉花中期库17份已有芽黄材料的芽黄突变体中棉所58Vsp，该芽黄性状受一对隐性核基因控制；该芽黄突体的抗氧化系统酶活性、色素含量、叶绿素合成前提物质及叶绿体的超微结构均受到一定的影响。     

水稻矮化并花发育异常突变体dwarf and deformed flower 2(ddf2)的基因定位与候选基因分析

【目的】对一个同时导致营养和生殖器官发育异常的水稻突变体进行表型鉴定、基因定位和候选基因分析,为下一步的基因克隆与功能分析奠定基础。【方法】在水稻籼型恢复系602组织培养后代中,发现一个矮化并花发育异常突变体dwarf and deformed flower 2(ddf2)。抽穗期,以野生型为对照,对ddf2株高、主穗长、节间和功能叶的长宽等性状进行统计分析;同时利用冷冻切片等技术对茎、叶和花器官进行详细的形态和组织学分析。分别以西农1A和中花11为母本,以DDF2/ddf2杂合株系为父本构建2个F2群体进行遗传分析和基因定位,并对候选基因进行实时荧光定量PCR(real-time PCR)分析。【结果】相较于野生型,突变体各节间的长和茎粗均极显著降低,叶片极显著变短、变窄,同时花序也极显著变短。组织细胞学分析发现,突变体大叶脉数目和相邻2个大叶脉之间的小叶脉数都没有明显的变化,但相邻2个大叶脉之间的宽度明显减小,进一步比较2个小叶脉之间的叶肉细胞,发现在突变体中细胞数目和尺寸均显著降低;突变体茎秆维管束的数目与野生型相比没有明显的变化,但统计发现2个大维管束之间基本组织细胞的数量和细胞的大小都显著小于野生型,表明ddf2突变体茎、叶细胞分裂和膨胀都受到了抑制;此外,ddf2突变体的花器官特征发育受到了严重干扰:第一轮外稃顶部弯曲、内稃不同程度退化,第三轮雄蕊器官严重退化,部分甚至转化为雌蕊状器官,另外部分ddf2小穗的护颖过度发育,转变成稃片状,一些小穗还表现分生组织确定性的丢失,发育出2个以上的小花。遗传分析表明该突变性状受1对隐性基因控制。利用中花11/ddf2的1 024株F2分离群体,最终将DDF2精细定位在第11染色体短臂近着丝粒位置处,位于insertion/deletion(in/del)标记S-11和S-14之间,遗传距离分别为0.049和0.098c M,物理距离为90.295 kb,并与标记S-24共分离。分析定位区间的基因,发现共有MSU注释基因12个,其中一个编码Sec3_C蛋白的LOC_Os11g17600内部包含共分离标记S-24,进一步对该基因进行表达分析,发现该基因在突变体的叶、茎和穗中都表现出明显的下调,初步将LOC_Os11g17600作为DDF2候选基因。【结论】DDF2是一个同时控制水稻茎/叶和花器官发育的新基因。     

小麦盐胁迫响应基因TaSRP的克隆及功能鉴定

【目的】土壤盐碱化是制约中国小麦生产的重要因素之一,耐盐性改良成为重要的育种目标。分析小麦TaSRP的功能,解析TaSRP的耐盐性作用机制。【方法】对小麦盐处理转录组测序结果进行分析,发现一个受盐胁迫诱导表达的小麦凝集素类基因TaSRP。根据TaSRP编码的氨基酸序列,通过在NCBI中比对得到水稻、大豆和拟南芥中与TaSRP相似的蛋白序列,利用DNAMAN和MEGA5.05软件进行多重序列比对和同源性分析。根据TaSRP的保守序列设计特异引物,利用TaSRP的实时荧光定量PCR检测TaSRP在不同胁迫处理条件下的表达模式;构建带有CaMV 35S启动子的16318hGFP-TaSRP绿色荧光表达载体,利用瞬时转染法将重组质粒和对照空载体导入拟南芥原生质体,室温黑暗培养16 h,激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光信号;扩增TaSRP启动子序列,利用植物顺式作用元件数据库PLACE（http: //www.dna.affrc.go.jp/PLACE）分析启动子区域中参与非生物胁迫响应的顺式作用元件;将TaSRP的cDNA序列连入带有CaMV 35S启动子的pBI121表达载体中构建pBI121-TaSRP表达载体,转入C5C81农杆菌中,采用蘸花法侵染拟南芥得到转基因株系,并进行耐盐性鉴定。【结果】TaSRP具有EUL保守区,属于卫矛凝集素（EUL）家族,定位在细胞质内。氨基酸序列同源性及系统发育树分析发现,TaSRP与水稻的OSR40类蛋白（OSR40g3、OSR40g2和OSR40c1）的同源性最高;与拟南芥、大豆的同源性较低。TaSRP启动子含有一系列对盐、ABA和低温等非生物胁迫响应的调控元件。实时荧光定量PCR分析显示,TaSRP受ABA和盐胁迫上调表达,对干旱胁迫无明显响应。抗性试验结果显示,在不加NaCl的条件下,野生型与过表达株系总根长基本一致,在125 mmol•L-1 NaCl和150 mmol•L-1 NaCl处理的培养基上,3个转基因拟南芥株系的总根长均大于野生型拟南芥的总根长,并达到显著性差异,表明过表达株系有较好的耐盐性,TaSRP在拟南芥中过表达能够提高拟南芥对盐胁迫的抗性。【结论】TaSRP提高了转基因拟南芥对高盐的抗性。     

甘蔗水分胁迫响应相关醛脱氢酶基因的克隆及其表达特征分析

 【目的】筛选并克隆与水分胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗旱机制,为甘蔗抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】应用消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选水分胁迫诱导的基因的EST序列,根据筛选到感兴趣的上调表达基因的EST序列,用RACE技术获得SSADH的全长cDNA序列,并通过实时荧光RT-PCR技术对该基因的表达特征进行分析。【结果】通过消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选的EST中含有4个推测为基因SSADH 的EST,其在水分胁迫处理的斑茅中均明显上调表达。通过RACE扩增获得甘蔗SSADH全长cDNA序列为1 914 bp,其中5′端非编码区25 bp,开放阅读框为1 581 bp,3′端非编码区306 bp,在1 749处有终止加A信号AATAA。克隆的甘蔗全长cDNA序列进行NCBI比对分析显示,所克隆的甘蔗SSADH全长cDNA与拟南芥（NM_106592.3）的ALDH5F1同源性为73%,表明克隆的cDNA序列可以归为甘蔗的醛脱氢酶家族基因ALDH5F1。通过荧光实时PCR分析SSADH表达表明,该基因参与干旱胁迫下的全程响应,并证明水分胁迫下该基因表达与Ca2+的存在调控关系。【结论】克隆了甘蔗基因SSADH,该基因为一个水分胁迫响应基因;SSADH的植物在体表达与Ca2+存在调控关系。克隆的基因SSADH可用于植物抗逆性调控研究。