SA、MeJA、ACC和苹果轮纹病病原菌诱导湖北海棠MhWRKY1基因的表达

 【目的】从湖北海棠叶片中克隆MhWRKY1转录因子的全长cDNA序列,分析该基因在各种组织中(叶、茎、根)的表达特性,并分析SA、MeJA、ACC在叶、茎、根中诱导MhWRKY1基因的表达模式以及苹果轮纹病病原菌诱导条件下湖北海棠叶片中该基因的表达特性。【方法】利用电子克隆技术和RT-PCR验证相结合的方法,从SA诱导的湖北海棠全长cDNA文库中,克隆MhWRKY1转录因子的全长序列;利用生物信息学的方法对其进行结构和功能的初步分析;利用实时荧光定量RT-PCR技术分析该基因在不同组织中的表达以及在SA、MeJA、ACC和苹果轮纹病病原菌诱导下的表达特性。【结果】克隆了MhWRKY1基因的全长cDNA序列为1 338 bp,GenBank数据库登录号为FJ598139。生物信息学分析表明,该基因最大开放阅读框为993 bp,编码330个氨基酸。推导的氨基酸序列与杨树WRKY26、杨树WRKY20、大豆WRKY,马铃薯WRKY2、烟草WRKY、拟南芥WRKY7、水稻WRKY53的同源性分别为68%、68%、66%、60%,59%,49%和43%。该转录因子含有1个WRKY结构域,其N端含有1个WRKYGQK结构域,C端含有1个C2H2锌脂结构,属于第Ⅱ类型的转录因子。表达分析结果表明,MhWRKY1在叶和茎中的表达量较大,分别是根的4.81和3.75倍。在湖北海棠叶、茎、根中,SA、MeJA、ACC都可以诱导该基因的表达。另外,在所研究的72 h内,苹果轮纹病病原菌可以诱导该基因表达,且表达量在12 h达到最大,是未处理之前的9倍左右。【结论】MhWRKY1转录因子可能参与SA、MeJA和ET介导的植物抗病防卫反应的基本信号通路,并且参与对苹果轮纹病病原菌引起的防卫反应,在湖北海棠的的抗病过程中可能起着非常重要的作用。     

湖北海棠病程相关蛋白MhPR8基因的克隆与表达

【目的】从湖北海棠叶片中克隆植物第Ⅲ类几丁质酶基因PR8的cDNA序列和基因组DNA序列,研究化学试剂SA、MeJA、ACC、ABA,非生物胁迫NaCl和低温（4℃）,生物胁迫苹果轮纹病病原菌和苹果蚜虫诱导下MhPR8基因的表达特性。【方法】利用PCR技术分别从SA诱导的湖北海棠全长cDNA文库和基因组DNA中克隆MhPR8基因全长序列;利用生物信息学方法对其进行结构和功能的初步分析;利用实时荧光定量RT-PCR技术分析该基因的表达特性。【结果】该基因编码区为897 bp,编码298个氨基酸,蛋白质分子量为31.67 kD,等电点为4.77,命名为MhPR8。该基因在其编码区内部没有内含子。MhPR8蛋白含有保守的结构域GH18_hevamine_XipI_class_III,属于第III类几丁质酶。该蛋白含有6个保守的半胱氨基酸残基,含有植物第III类几丁质酶起催化作用的天冬氨酸和谷氨酸,分别位于第151和153位氨基酸。qRT-PCR分析结果表明,该基因在湖北海棠根中的表达量最大;SA、MeJA和ACC明显诱导该基因的表达,ABA略微诱导该基因的表达;低温诱导该基因的表达,而NaCl诱导该基因的表达不明显;生物胁迫苹果轮纹病病原菌和苹果蚜虫诱导该基因的表达。【结论】湖北海棠MhPR8可能参与SA、JA/ET介导的信号通路中,在湖北海棠抵抗生物胁迫和非生物胁迫中起着非常重要的作用。     

病原诱导的小麦转录因子TaERF1b基因的分离和表达

 【目的】研究一个病原诱导的小麦ERF转录因子基因在对纹枯病菌、赤霉病菌防御反应中的作用。【方法】应用生物信息学、RT-PCR、RACE方法，从赤霉病菌诱导的小麦中，分离ERF转录因子基因的全长cDNA序列；利用半定量RT-PCR方法，分析该基因对小麦纹枯病菌、赤霉病菌及MeJA、ET和SA处理的应答表达情况。【结果】从赤霉病菌诱导的抗赤霉病小麦品种苏麦3号cDNA中，分离出1个编码ERF转录因子基因的全长cDNA序列。该基因暂被命名为TaERF1b，编码由280个氨基酸组成的蛋白质TaERF1b。TaERF1b具有保守的ERF/AP2结构域，但TaERF1b蛋白全长氨基酸序列与已克隆的ERF蛋白同源性较低（＜36.5%）。TaERF1b基因表达分析的结果表明，纹枯病菌、赤霉病菌侵染可快速诱导抗病小麦中TaERF1b基因的上调表达，该基因转录表达水平在防卫相关激素乙烯、茉莉酸处理早期显著增强，而且TaERF1b对外源乙烯、茉莉酸处理的响应时期早于对纹枯病菌、赤霉病菌的响应时期。【结论】分离出一个受病原诱导的小麦ERF新基因TaERF1b，其编码蛋白TaERF1b为植物ERF转录因子家族的一个新成员，可能通过茉莉酸、乙烯信号途径介导小麦对纹枯病菌、赤霉病菌的防御反应。     

水稻WRKY80转录调节蛋白基因的分离与表达模式

【目的】分离水稻WRKY80,分析其编码蛋白的序列结构特征,了解其在各器官中以及病原接种、激素处理下的表达模式,为阐明其生物学功能奠定基础。【方法】基于水稻基因组数据库注释的Loc_Os03g63810基因的编码序列设计特异引物,用RT-PCR法从茉莉酸甲酯（MeJA）处理的水稻叶片中克隆WRKY80 cDNA 序列,运用生物信息学手段对推定的蛋白和启动子序列进行分析,用Northern杂交或实时荧光定量PCR方法研究基因的表达模式。【结果】 获得了WRKY80 cDNA序列,长1 392 bp,包含1个长1 164 bp 的完整开放读码框,编码387个氨基酸。WRKY80具有1个典型的WRKY 保守结构域,锌指类型为C2H2,归类于WRKY 第Ⅱ组;C-端为酸性结构区,且含连续的6个谷氨酰胺和8个丝氨酸,提示具有转录激活活性;预测其定位于细胞核。WRKY80与玉米和高粱等单子叶植物WRKY 的氨基酸序列同一性较高。WRKY80在各器官中组成性表达,在叶、根和穗中表达丰度较高,花中次之,在茎和颖果中丰度较低,且表达具有发育阶段相关性,在成熟叶、根中的表达分别高于幼叶和幼根;受稻瘟病菌、纹枯病菌、MeJA和乙烯利诱导表达,而水杨酸对其表达无影响。其表达模式与启动子顺式元件预测分析的结果基本一致。【结论】WRKY80具有转录因子的结构特征,推测其可能通过茉莉酸/乙烯介导的信号途径参与水稻的防御反应,也可能参与发育调控。     

苎麻BnbZIP1转录因子基因的克隆与表达特征分析

【目的】克隆苎麻转录因子基因BnbZIP1,分析其序列及表达特征,同时进行原核表达以及亚细胞定位分析。【方法】根据苎麻转录组测序中的Unigene48047片段序列,采用RT-PCR结合RACE技术克隆该基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用Real-time PCR分析该基因在不同组织和不同胁迫条件下表达特征;构建原核表达载体,进行原核表达;构建含EGFP的融合表达载体,观察其亚细胞定位情况。【结果】苎麻BnbZIP1的cDNA全长为2 071 bp,开放读码框为1 407 bp,编码468个氨基酸,推导该多肽的等电点和分子量为7.12和51.57 kD,与毛果杨（XP_002307972）的bZIP基因氨基酸序列的相似性最高,达到93%;IPTG诱导产生的重组蛋白相对分子量约为52 kD,与理论值一致;亚细胞定位分析表明其定位在细胞核中;荧光定量PCR分析表明,该基因在苎麻根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达,其中,在雄花中表达最高,在根中表达最低,且该基因受ABA、干旱和高盐诱导上调表达。【结论】获得了BnbZIP1的全长cDNA序列,其编码蛋白具有植物bZIP转录因子典型的结构域,且该基因响应ABA、干旱和高盐逆境胁迫,预示该基因可能在植物抗逆反应中发挥着重要的调控作用。     

番茄WRKY转录因子基因片段的克隆及序列分析

【研究目的】本研究以番茄苗为实验材料，克隆出番茄WRKY转录因子的一个基因片段并对其核酸序列进行分析。【方法】根据本课题组已经克隆出的番茄特异的WRKY基因片段和番茄EST序列设计特异引物，利用RT-PCR技术获得番茄WRKY转录因子的一个基因片段并连接到pMD19-T载体中，转化DH5α，，筛选阳性克隆，用双酶切分析法对其进行鉴定并进一步对核酸序列进行测序分析。【结果】结果表明，克隆获得的WRKY转录因子基因片段约为680bp，用GenBank中的Blastn程序分析表明，其与CaWRKY（AY789641.1）、WIZZ（wizz mRNA）（AB028022.1）的相似性分别为86％和84％。【结论】WRKY转录因子在番茄中受JA诱导，这为克隆番茄WRKY基因全长，进而为番茄抗病育种奠定基础。     

月季MYB基因cDNA全长克隆和表达分析

 【目的】克隆月季花色代谢相关新基因的全长cDNA序列，并分析其表达功能。【方法】根据月季花色突变体SSH文库分析得到的差异表达EST序列设计引物，采用RACE技术进行全长cDNA克隆。【结果】克隆到1 125 bp的cDNA全长，GenBank登录号为Eu082130。这一cDNA序列编码1个包含294个氨基酸的前体蛋白，它与小金海棠MxMYB1和大豆的GmMYB176 蛋白的保守区同源性分别为70%和58%，都是只有1个MYB结构;而与具有两个MYB结构域的棉花GhMYB26、拟蓝芥AtMYB305和金鱼草AmMYB340同源性很低。该蛋白的分子量为32.33 kD，等电点为9.65，分子式为C1387H2201N435O440S10 。半定量PCR 分析证实了该RhMYB1基因与CHS基因在红花突变体中比在黄花亲本中表达量高。【结论】推测该基因是一个转录因子，参与调控花青苷的合成。     

高粱SbNAC1基因克隆及初步分析

【目的】在植物抗逆信号转导途径中,NAC转录因子处于承上启下的关键位置,通过调控靶基因的表达发挥抗逆功能。本研究克隆高粱SbNAC1基因全长cDNA,并对其进行序列比对、进化分析,为深入研究其在作物抗逆反应中的生物学功能奠定基础。【方法】RT-PCR扩增SbNAC1全长cDNA,并对其进行基因序列比对和系统进化分析等生物信息学分析。【结果】SbNAC1cDNA全长966bp,编码321个氨基酸。氨基酸序列比对结果表明高粱SbNAC1与水稻SNAC1同源性达到83.69%。     

南方根结线虫诱导辣椒基因CaRKNIF2的克隆与分析

 【目的】明确辣椒(Capsicum annuum L. HDA149)中与南方根结线虫(Meloidogyne incognita)不亲和互作过程中抗性相关WRKY转录因子的基因结构及其表达模式。【方法】采用RACE结合RT-PCR方法克隆cDNA序列,并根据cDNA序列设计特异引物扩增DNA序列,Southern杂交确定基因拷贝数,实时荧光定量PCR方法分析该基因在线虫侵染后辣椒的不同组织和不同时间点的表达。【结果】从辣椒中克隆到一个WRKY转录因子基因CaRKNIF2(GenBank登录号：GQ253367),该基因编码区全长1 662 bp,编码553个推定的氨基酸,为单拷贝基因。CaRKNIF2基因编码区全长DNA序列2 530 bp,包含5个内含子和6个外显子。在线虫接种诱导处理时,该基因表达具有组织特异性,根尖组织中的表达量最高;接种3 h后在根尖组织中的表达量开始升高,12 h最高,此时相对表达量约为3.1倍。【结论】CaRKNIF2在线虫接种处理后的表达上调,表明该基因参与了抗性基因Me3介导的辣椒与根结线虫的不亲和互作,可能在此过程中具有重要功能。     

基于转录组分析苹果水杨酸特异响应基因MdWRKY40的启动子鉴定

【目的】探明水杨酸(SA)对苹果叶片基因转录调控的影响,鉴定SA信号途径及其调控基因,为研究SA介导的抗病分子机制提供理论依据。【方法】生长30 d的‘嘎啦’组培苗叶片用2 mmol·L-1水杨酸(SA)处理12 h,以CTRL(0.2%乙醇)处理作为对照,利用Illumina Hi Seq TM 2000进行转录组测序,通过综合的生物信息学分析(差异基因筛选、条件特异性分析、GO分类及KEGG富集分析等)筛选SA信号途径的调控基因。克隆受SA特异性诱导表达基因的启动子,利用苹果细胞原生质体转化技术,进行启动子活性鉴定,确定对SA进行特异性响应的核苷酸序列。【结果】CTRL和SA处理分别获得750 439 459 bp和751 596 153 bp的原始数据,分别有44.77%和43.88%与‘金冠’苹果基因组完全匹配。获得3 329个显著性差异基因,包括苯丙烷类、类黄酮等次生代谢物生物合成途径的相关基因(如木质素合成关键酶CAD、细胞色素P450、真菌抗性相关的β-1,3-葡聚糖酶等),调控植物病原菌互作途径重要功能基因(钙调蛋白Ca M、抗病蛋白RPM1、热激蛋白HSP90、WRKY转录因子等)以及33个条件特异性诱导表达基因(NAC转录因子、NIMIN1、WRKY40、ERF转录因子等)。其中1 085个基因上调,2 244个基因下调。差异基因主要涉及细胞过程、代谢过程和基因绑定、催化活性等;根据转录组学的结果,将SA响应基因Md WRKY40的启动子序列克隆到含有荧光素酶基因的表达载体中,置于荧光素酶基因的上游,转化苹果原生质体细胞。SA处理的原生质体细胞,荧光素酶的活性为未经SA处理的20.6倍,而脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、1-氨基环丙烷羧酸(ACC)对荧光素酶的活性没有影响,说明该启动子为苹果中对SA进行特异性响应的启动子序列。不同区段的启动子片段对SA响应能力不同,从Md WRKY40翻译起始位点ATG向上游500—1 000 bp只能响应高浓度SA,而对低浓度SA不具有响应能力,1 500 bp片段对高浓度SA响应能力进一步显著增强,对低浓度SA响应也有微弱提高;而长度为2 000 bp的核苷酸片段无论对高浓度SA还是对低浓度SA都具有显著响应能力,且达到最强。与2 000 bp片段相比,2 500 bp的核苷酸片段没有进一步增强启动子片段对SA的响应能力。超表达Md WRKY40蛋白对其自身的转录具有抑制作用。【结论】2 mmol·L-1 SA处理所影响的基因主要参与了苯丙烷类、类黄酮的生物合成,植物病原菌互作及植物激素信号转导途径。位于Md WRKY40开放阅读框上游的2 500 bp核苷酸序列,为对SA进行特异性响应的核苷酸启动子序列。在1 000—1 500 bp及1 500—2 000 bp具有显著提高启动子对SA敏感性的未知核苷酸序列,另外,Md WRKY40转录调控存在反馈抑制机制。     

A Multiplex PCR Assay for the Detection of Pathogenic Genes of EPEC, ETEC and EIEC

A multiplex polymerase chain reaction (PCR) was developed to detect three pathogenic genes of en-teropathogenic, enterotocigenic and enteroinvasive Escherichia coli.. In this study three different sets of oligonu-cleotide primer were simultaneously used, and in this way, specific fragments of 880, 600, 150 bp for EPEC eaeA, EIEC ipaH and ETEC ST genes were amplified, respectively. The best condition of the multiplex PCR was: after an initial heat denaturation step at 95℃ for 5 min, followed by 30 cycles of denaturation at 94℃ for 40 s, primer annealing at 51.3 ℃ for 40 s and extension at 72 ℃ for 1 min, final extension at 72 ℃ for 10 min. The detection limit of the eaeA, ipaH and ST primers was 38.7423, 3.60519, 29.9448 ng·mL-1 (4.3×104, 1.5×103, 2.6×104 CFU·mL-1), respectively. It may be a good way for the detection and identification of Diarrhea-causing E. coli. .     

磨盘柿叶片、果实及萼片中酚类物质的动态变化初报

磨盘柿(DiospyroskakiL.f.cv.Mopan),是中国北方主要栽培的涩柿品种。在此,对其叶片、果实及萼片中的酚类物质含量在多个发育时期进行了测定,结果表明:在生长期内,柿萼片中的酚类物质含量呈上升趋势,与果实酚类物质含量变化规律完全不同;叶片的酚类物质含量均高于果肉的酚类物质含量;结果梢叶片与营养梢叶片酚类物质的含量变化不同,8月下旬以前,结果梢叶片的值大于营养梢叶片的,8月下旬以后,前者又小于后者。     

小麦抗白粉病优质高产T1BL.1RS易位系的鉴定与分析

本文从创制的８０ 个新选系中鉴定出１２ 个抗白粉病品系,应用醇溶蛋白Ａ－ ＰＡＧＥ 检测发现其中９ 个为１ＢＬ／１ＲＳ易位系。麦谷蛋白亚基ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 分析表明,有３ 个含５ ＋ １０ 优质蛋白质亚基。综合农艺性状表现评定出９８ －１２３６ 和９８－ １２６６ 两个品系表现优异。进一步对籽粒主要品质性状检测表明,这两个品系均优于对照品种川麦２８ 号。     

落花生,扁豆,黑大豆,绿豆和豇豆的生药学显微鉴定

本文记述了落花生、扁豆、黑大豆、绿豆、豇豆的显微特征,结果表明,5种药材的显微特征清楚,差异也比较明显。     

栾树不同部位总黄酮的提取及含量测定

通过微波辅助提取的L9(34)正交实验方法与索氏回流提取法,分别提取栾树果实、枝叶中总黄酮,确定微波辅助提取法较适宜,并得到其最佳提取工艺参数是:微波处理1min、水浴10min、固(原料)液(提取溶剂)比为1:20。以微波助提最佳工艺提取栾树总黄酮,通过NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色体系的510nm分光光度法测定其含量,得栾树果实、枝、叶中总黄酮含量分别为1.78%、0.27%、0.45%。对2003年9月、10月、11月分别采集的栾树果实进行提取及测定,3个采集时间的栾树果实中总黄酮含量分别为0.71%、1.78%、2.70%,总黄酮含量随果实趋向成熟而显著递增。     

微量元素肥料对紫花苜蓿草产量的影响

采用完全试验设计研究硼、钼、锌对紫花苜蓿草产量和植株高度的影响．结果表明,微量元素硼、钼、锌单独施用可以显著提高苜蓿干草产量和植株高度,其配合施用存在互作,其中钼和硼为正互作,可以显著提高苜蓿干草产量和植株高度;苜蓿植株高度和干草产量存在显著的正相关（r=0．8792）,即苜蓿干草产量的提高可以通过植株高度的增加来实现．     

Genetic Diversity and Evolutionary Tendency Detected by Isozyme, RFLP and RAPD Markers in the Wild and Cultivated Soybean in China

A large numbers of samples of wild soybean accessions and cultivated soybean landraces from various areas in China were analyzed by isozyrme, cytoplasmic DNA RFLP and nuclear DNA RAPD markers in order to reveal their genetic diversity. Greater comprehensive genetic diversity was detected in wild soybean than in cultivated soybean. The genetic plentifulness and the genetic dispersion of wild soybean were 180 (95. 2％) and 0. 2891 while those of cultivated soybean were 154(81.5％) and 0. 2091,respectively. On the most loci, especially on isozyme loci Idh1, Aph, Idh2,and Dia, cytoplasmic DNA RFLP loci cp Ⅰ , cp Ⅲ, mt Ⅳ a and mt Ⅳ b, and nuclear RAPD loci OPAP4-8, OPAP5-1, OPAP9-8 and OPAP20-8, the wild soybeans djffered remarkably from the cultivated ones in allele frequency. These markers could be used in further study on the evolution and origin of the cultivated soybean.     

利用小麦SSR标记追踪大赖草染色体Lr.2、Lr.7、Lr.14及其片段

定位于小麦7个部分同源群上的337对SSR引物中有113对SSR引物可检测到大赖草与普通小麦基因组间多态性，对小麦一大赖草Lr．2、Lr．7和Lr.14的异附加系和易位系的进一步分析表明，小麦7BL上的SSR引物gwm112在大赖草染色体Lr．2上具有特异扩增位点，可用来追踪Lr．2；5AS上的SSR引物gwm205、5AL的gwml56和5DL上的gwm212在Lr．7和Lr．14中均有特异扩增产物，可用于追踪Lr．7和Lr．14；而7AL上的SSR引物gwm63仅在大赖草染色体Lr．7上具有扩增位点。这不仅揭示了Lr．7可能存在第5和第7部分同源群染色体重排，而且也表明将引物gwm205、gwm156、gwm212与gwm63相结合可分别追踪大赖草Lr.7和Lr．14染色体及其片段。利用这些SSR引物可追踪同一植株中不同的大赖草染色体；与簇毛麦染色体6V上的SCAR标记相结合，能追踪同一植株中的大赖草和簇毛麦染色体片段。     

人参茎叶总皂苷对小菜蛾取食、解毒酶及乙酰胆碱酯酶的影响

以人参(Panax ginseng C.A.Mey)茎叶总皂苷为试验材料,以小菜蛾(Plutella xylostella(L.))为试验昆虫,测定小菜蛾取食、解毒酶及乙酰胆碱酯酶活性。结果表明:人参茎叶总皂苷对小菜蛾取食有明显抑制作用;低质量浓度人参茎叶总皂苷能够激活小菜蛾体内多功能氧化酶系(MFO)活性,而高质量浓度人参茎叶总皂苷对小菜蛾体内多功能氧化酶系(MFO)活性具有抑制作用;人参茎叶总皂苷,能够抑制谷胱甘肽-S-转移酶及羧酸酯酶活性;低质量浓度时人参茎叶总皂苷对小菜蛾体内乙酰胆碱酯酶活性影响不大,中质量浓度能够抑制小菜蛾体内乙酰胆碱酯酶活性,而高质量浓度时抑制作用与中质量浓度相比有所减弱。