科技短波

<正>猪流行性腹泻防控获新突破最近,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪消化道传染病创新团队克隆表达了猪源三型干扰素,可有效抑制流行性腹泻病毒感染,为猪流行性腹泻病防控提供了新思路。科研人员首次克隆表达了具有活性的猪源三型干扰素,并系统研究了该干扰素在抗猪流行性腹泻病毒感染中的作用及机制。表达的猪源三型干扰素对猪流行性腹泻病毒具有较强的抗病毒作用,无论对经典     

PEDV ps420片段乳酸乳球菌表达及免疫中和活性检测

将猪流行性腹泻病毒LJB/03株S基因上编码中ps420(1 495～1 916 bp)基因片段插入乳酸乳球菌pNZ8112中,构建了重组表达载体pNZ8112-ps420,将其电转化入乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000,获得了表达猪流行性腹泻病毒S基因ps420的重组乳酸乳球菌,经乳链菌肽(...     

猪流行性腹泻病毒COE基因的原核表达和免疫原性分析

为研究猪流行性腹泻病毒中COE基因的原核表达情况及免疫原性,从感染猪流行性腹泻病毒的猪体内采集肠内容物、肠段及肠系膜淋巴结,参照GenBank中所收录的猪流行性腹泻病毒（PEDV）CV777株的COE基因序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增出COE基因,克隆到原核表达载体pET-32α上,并构建重组表达质粒pET-32α-COE,在大肠杆菌Rosetta中进行表达,并进行Western blot检测。结果显示,重组蛋白获得了高效的表达,并能与多抗血清发生特异的免疫印迹反应。COE基因是猪流行性腹泻病毒的中和抗原位点,具有良好的免疫学活性。     

猪流行性腹泻病毒FJ-11A株的分离与ORF3基因序列分析

从福建省某疑似流行性腹泻病毒感染的猪场采集腹泻粪便样品和小肠组织,利用Vero细胞连续传代后,分离到猪流行性腹泻病毒福建株(FJ-11A株).根据GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒ORF3基因特征设计特异性引物,采用RT-PCR方法对猪流行性腹泻病毒福建株ORF3基因进行扩增,将扩增目的片段经胶回收后进行克隆测序....     

猪流行性腹泻病毒检测技术研究进展

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪急性高度接触性肠道传染病,主要临床症状表现为呕吐、水样腹泻、脱水等。近年来,PED在全球范围内暴发流行,使养猪业遭受巨大的经济损失。对猪流行性腹泻的检测方法(病毒的分离和鉴定、免疫电镜法、免疫学检测法、分子生物学检测等)进行了综述,以期对猪流行性腹泻病毒的防控提供理论依据。     

猪流行性腹泻与猪圆环病毒2型混合感染的诊断与分析

猪流行性腹泻病毒是引起猪腹泻的主要病原,近几年来,国内猪流行性腹泻呈高发态势,山西省多个地区规模化猪场发生哺乳仔猪腹泻,死亡率高达80%～100%。猪圆环病毒2型是我国目前感染率最高的疫病,可引发断奶仔猪多系统衰竭综合征,损害免疫系统,造成免疫抑制。山西省农业科学院畜牧兽医研究所猪病研究室从各地规模化猪场采集因腹泻病死哺乳仔猪肠道内容物及肠系膜淋巴结各53份进行分子学检测诊断。结果发现,猪流行性腹泻病毒阳性率为90.6%;猪圆环病毒2型阳性率为69.8%。认为当前猪流行性腹泻严重发生与猪圆环病毒2型混合感染有密切关系。因此,在预防猪流行性腹泻的同时,要重视猪圆环病毒2型的免疫工作,并采取相关的综合防控措施,控制猪流行性腹泻的发生。     

猪流行性腹泻和猪圆环病毒病混合感染的诊治

猪流行性腹泻病和圆环病毒病属于两种病毒性传染性疾病,致病原分别为猪流行性腹泻病毒和猪圆环病毒。猪流行性腹泻病毒是仔猪群中很容易出现的一类病毒性腹泻疾病,而圆环病毒属于典型的免疫抑制疾病。两种疾病混合感染发生,会导致猪临床症状加剧,死亡率升高。本文主要结合实际情况分析的猪流行性腹泻和猪圆环病毒病混合感染的诊断与防治过程。     

猪白细胞干扰素对猪流行性腹泻病毒的干扰试验

现如今,健康对于人们来说是至关重要的,所以不管对于那一方面,都需要注意一下。猪白细胞是一种免疫细胞,它的免疫力的情况还是很强的。而对于猪而言,流行性腹泻病毒的感染能力也是极强的,所以猪流行性腹泻病毒对于动物猪的破坏能力还是特别强的。猪白细胞干扰素对猪流行性腹泻病毒是有一定免疫能力的,所以研究猪白细胞干扰素对猪流行性腹泻病毒的干扰试验还是很必要的。     

猪病毒性腹泻病的主要特征及治疗方法

正猪病毒性腹泻疾病是由多种病毒致病原感染引起的一种腹泻疾病的通称,临床上致病原主要有轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性肠胃炎病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、肠病毒株腺病毒、诺瓦克病毒。病毒性腹泻的发病原因十分复杂,其中以猪传染性肠胃炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒引起猪发生腹泻的最为严重,也最为常见,日常养殖过程中,做好猪病毒性腹泻的治疗工作,对确保猪养殖产业健康发展     

加拿大暴发猪流行性腹泻病毒

<正>猪流行性腹泻病毒已经成为猪肉产业最近需要面对的一个主要问题。加拿大的Doug MacDougald博士已经开始研究该病毒的预防。根据2014年Banff猪肉研讨会上一名加拿大兽医的发言,美国母猪30%~40%已经感染猪流行性腹泻病毒(PED)。在这名兽医发言后,加拿大报道了在安大略省一个母猪存栏500头的育肥猪场中发现     

猪流行性腹泻病毒Nsp5基因的原核表达及生物信息学分析

旨在对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)Nsp5基因进行原核表达,利用生物信息学软件,预测其编码蛋白的结构和功能,为了解PEDV致病机理奠定基础。本研究克隆PEDV/LY/2014/04毒株的Nsp5基因,亚克隆进pET-28a(+)原核表达载体,PCR和酶切验证重组质粒的构建,重组质粒pET-28a(+)-Nsp5转入E.coli BL21(DE3)中,SDS-PAGE检测Nsp5的表达和His band Ni+纯化情况,Vector NTI Advance等软件对Nsp5蛋白氨基酸组成、抗原表位、二级和三级结构进行预测和分析。结果表明,成功克隆并构建了重组质粒pET-28a(+)-Nsp5,表达重组蛋白大小约22 ku,且主要以包涵体形式存在,His band Ni+纯化后获得高纯度重组蛋白。Nsp5蛋白是由196个氨基酸残基组成的多肽,其分子质量的理论值为21 820.07 u,理论等电点(pI)为8.734,略偏碱;二级结构骨架中α-螺旋(h)占55.61%,β-折叠(t)占7.65%,无规则卷曲(c)占20.92%,延伸链(e)占15.82%;Nsp5蛋白质的三级结构中,中间段以α-螺旋为主作为骨架,C端多个复杂二级结构构成该蛋白的酶活性中心;B细胞抗原表位的预测,表明有15个潜在的B细胞优势表位。本研究为猪流行性腹泻病毒Nsp5蛋白质的生物学功能相关研究提供数据支持。     

牛病毒性腹泻病毒Core蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的Core蛋白及其多克隆抗体,根据Core蛋白的编码基因序列,设计合成一对特异性引物,利用RT-PCR扩增BVDV Core基因并定向插入Pet30a载体中,构建重组质粒Pet30a-Core,经酶切鉴定后转化大肠埃希菌TOP 10感受态细胞,筛选获得阳性重组菌,以IPTG进行诱导后成功表达出分子质量为20 ku的重组Core蛋白。将诱导表达的蛋白产物经融合蛋白的Ni柱亲和法进行纯化,利用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并利用间接ELISA法测出多克隆抗体效价达到1∶512 000。蛋白质印迹法(Western blot)和间接免疫荧光试验(IFA)证实,多克隆抗体可与细胞中的BVDV抗原发生反应,具有良好的免疫原性和特异性。本实验成功制备了BVDV重组Core蛋白的兔源多克隆抗体,为BVDV的检测及其Core蛋白功能研究奠定了基础。     

猪Ⅲ型干扰素原核表达及其抗病毒效果研究

Ⅲ型干扰素(IFN-λ)具有较好的广谱抗病毒能力和免疫功能调节能力,一般在肠道等黏膜部位呈现高表达。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是引起仔猪腹泻的重要肠道病原,严重困扰生猪产业健康发展。研究构建了携带猪PoIFN-λ3基因的重组表达质粒,转化大肠埃希菌Rosetta感受态细胞原核表达后,经SDS-PAGE和Western blotting检测分析,重组PoIFN-λ3蛋白成功表达,大小约为27 ku,且以包涵体形式存在。变性、纯化、复性后的PoIFN-λ3重组蛋白刺激IPEC-J2细胞,ISG-15、OAS1、Mx-1、IFIT1、IFIT3、IFITM1和IFITM3等干扰素刺激基因(ISGs)表达均显著上调,且在12 h达到峰值(P<0.001)。IPEC-J2细胞分别感染PEDV和PDCoV病毒时,用PoIFN-λ3重组蛋白预处理、同时处理和感染后处理这3种方式处理后观察病毒增殖情况,与对照组相比,PEDV和PDCoV病毒拷贝数均显著下降(P<0.05)。上述结果表明,变性、纯化、复性后的PoIFN-λ3重组原核表达蛋白具有较好的生物活性,不仅可以诱导IPEC-J2细胞免疫刺激基因表达上调,在体外也可以抑制PEDV和PDCoV在IPEC-J2细胞中的复制,为防治仔猪病毒性腹泻提供了基础。     

PEDV N蛋白的原核表达纯化及B细胞抗原表位预测分析

本研究旨在对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)N基因进行克隆构建、表达与其B细胞抗原表位性质的预测。将PEDV的N基因进行PCR扩增,克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,经酶切验证获得阳性克隆,将阳性克隆在表达菌E. coli BL21(DE3)中表达。通过对表达条件及纯化条件的优化,获得高纯度表达蛋白。利用生物信息同源模型化软件Swiss-Pdb Viewer建立PEDV-N蛋白的3D结构,并根据生物信息学软件DNA-Star预测PEDV-N蛋白的二级结构、抗原性、亲水性和表面可及性分析,综合分析预测其B细胞抗原表位。经预测PEDV-N蛋白氨基酸序列中存在13个B细胞优势抗原表位区域。研究结果将进一步为PEDV-N蛋白体外表达产物的应用及研制基因工程疫苗提供理论基础。     

禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白的哺乳动物细胞表达系统表达及鉴定

利用哺乳动物细胞表达系统对禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白进行表达,并检测所表达融合蛋白的抗原性。首先将N基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组真核表达载体,然后将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,通过倒置荧光显微镜和共聚焦显微镜检测N蛋白的表达,并用Western blot检测表达蛋白的抗原性。结果显示,禽偏肺病毒核衣壳N蛋白主要表达在细胞浆中,在转染后48h后表达量最高;与抗N蛋白抗体有抗原性,所表达核衣壳N融合蛋白大小为72kDa左右,与预期结果一致。结论,本试验成功应用哺乳动物表达系统表达了禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白,表达蛋白具有抗原性,为与禽偏肺病毒核衣壳N蛋白的相关研究奠定了基础。     

水疱性口炎病毒N基因原核表达载体的构建及表达

针对水疱性口炎病毒(VSV)N基因设计特异性引物,在引物中分别加入EcoR 和Xho 酶切位点。RT-PCR扩增后得到目的基因,将其克隆到表达载体pET30c,连接产物转化于DH5α菌株,在含Kan+的平板上37℃培养24h,然后挑取白色菌落,鉴定为阳性者,转化于BL21菌株,再经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导获得高效表达。表达融合蛋白分子质量为53ku(目的蛋白大约47ku),同预期蛋白大小相近。Westernblot检测表明,其能与本病毒阳性血清发生特异性反应,表达蛋白有望成为有价值的VSV诊断抗原。     

鸡传染性支气管炎病毒HN99株N基因在大肠杆菌中的表达及产物免疫活性检测

鸡传染性支气管炎病毒HN99株核蛋白(N)基因PCR产物经BamHⅠ、HindⅢ双酶切,克隆入大肠杆菌原核表达载体pMAL-p2X,构建重组表达质粒pMAL-p2X-N,转化大肠杆菌TB1并进行诱导表达。通过pMALTM融合蛋白纯化系统对表达产物进行非变性纯化,将纯化的N蛋白按常规方法免疫新西兰大白兔,制备兔抗鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的多克隆抗体,并用ELISA法检测其生物活性。结果表明,表达的重组核蛋门纯化后出现2条带,相对分子质量分别约为92和82 ku,与Western blot出现的2条蛋白带一致;纯化的重组蛋白经裂解因子作用后,出现2条蛋白带,相对分子质量分别为45和35 ku,与预期结果相符合;制备的多克隆抗体可与不同鸡传染性支气管炎病毒株发生反应,与亲本毒株的反应性略高于与其他毒株的反应性。以上结果表明,原核表达的可溶性N蛋白具有高度的生物活性,有望作为新的基因工程抗原用于鸡传染性支气管炎病毒的群特异性诊断。     

利用玉米作为生物反应器表达PEDV中和表位抗原蛋白

以玉米为生物反应器,将猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)主要中和抗原表位(core neutralizing epitope,COE)基因导入玉米自交系,获得了高效表达PEDV-COE的转基因玉米稳定株系。首先,根据玉米密码子的偏好性,设计合成优化的COE编码基因,构建了植物表达载体p BAC9036。然后,利用PDS1000/He基因枪转化玉米幼胚,经过愈伤组织诱导、分化再生培养,获得71株转化再生植株,进而通过田间草甘膦抗性筛选,获得2个T1代转基因玉米稳定株系。通过PCR、RT-PCR、间接ELISA和Western blot等鉴定结果显示,COE基因已成功整合到玉米基因组并进行了转录和蛋白表达。并且种子中COE蛋白占可溶性总蛋白的0.122%和0.078%。最后,提取转基因玉米稳定株系的种子可溶性蛋白,与佐剂混合皮下注射免疫小鼠并取可溶性蛋白灌胃免疫小鼠,均可产生针对PEDV抗原的特异性抗体。获得的转基因玉米可有效表达COE蛋白,表达产物具有显著的免疫原性,为进一步研制PEDV-COE转基因玉米疫苗奠定了基础。     

靶向PRRSV核衣壳蛋白N基因的siRNA表达载体的构建及鉴定

1材料与方法 1．1材料限制性核酸内切酶HindIII、BamHI、PvuII、SspI、质粒抽提试剂盒、EcoT14 DNAMarker购自TakaRa公司。T4DNA连接酶购于promega公司。大肠杆菌DH5α菌株由该实验室保存。siRNA表达载体pSilencer 4．1-CMV Nero质粒购自Ambion公司。