AFLP技术的发展及其应用

扩增片段长度多态性（ＡＦＬＰ）被称为“下一代分子标记”,是检测ＤＮＡ多态性的一种新技术。该技术在农作物、蔬菜、林木、果树等植物的种质鉴定、遗传多样性分析、构建遗传图谱、基因定位和标记辅助育种等方面得到应用。     

山核桃AFLP实验技术体系的建立

以充分展开的山核桃Carya cathayensis嫩叶为材料、利用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法与CTAB裂解一硅珠吸附法提取山核桃总DNA,对适合于山核桃叶片的AFLP（扩增片段长度多态性）分析体系进行了摸索。结果表明：①改良CTAB法适用于从山核桃叶中提取高质量的DNA,提取的DNA可用于AFLP的分析;②采用EcoR I/Mse I 酶切组合,酶切连接一步法与两步法的效果没有明显的差异,但一步法操作更为简便;③适合于山核桃叶AFLP分析的引物组合为E-ACT＋M-CAT,E-ACT＋M-CTG,E-ACG＋M-CAT,E-ACG＋M-CTG。扩增产物经60g·L^-1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行银染,条带信号强度一致性好,条带分布均匀、清晰,分辨率较高。     

白菜Ogura细胞质雄性不育基因组的AFLP分析

采用AFLP( Amplified fragment length polymorphism)技术对白菜(Brassica rapa ssp.chinensis)细胞质雄性不育系Y3611A及其相应的保持系Y3611B基因组DNA进行多态性比较,64对引物中有61对引物组合在两系间扩增出5 185条带,其中有3对引物在不育系Y3611A中扩增到3个特异片段,对特异片段进行克隆、测序,其序列全长分别为187 bp、205 bp和237 bp,将其分别命名为CMS187、CMS205和CMS237.用BLAST进行同源性分析,发现它们分别与大白菜核基因组部分序列、拟南芥衰老相关蛋白mRNA序列及拟南芥线粒体部分序列有较高的同源性.     

高分辨率AFLP胶图的获得

扩增片段长度多态性(AFLP)具有灵敏性高、检测位点多等优点，获得高分辨率的胶图是AFLP的关键技术之一。本文借助BioRad公司出品的SequL—GenGT／3000PAC电泳系统，发展了一套分段点样技术，并对银染操作细节及电泳过程中的关键参数进行了一些改进，使AHLP胶图分辨率得到显著提高，泳道及标记带型读取简便、可靠，有效地增加了单板胶的样品数。AHLP的检测效率得到明显提高。     

我国野生大豆与栽培大豆AFLP指纹图谱研究

 利用 Mse 和 Eco R 酶切 ,筛选了适宜大豆 AFL P指纹分析的引物组合 ,并利用 17对引物组合 ,建立了我国 92份代表性野生大豆和栽培大豆的 AFL P指纹图谱 ,分析了野生大豆与栽培大豆指纹图谱的特点与差别 ,发现了具有大豆种间特异性的带纹 M- CG/E- CGA- 4、M- CG/E- CGA- 12和 M- CGG/E- GGC- 14 ,并探讨了应用 AFL P指纹图谱鉴别野生大豆与栽培大豆种质的可行性     

辣椒细胞质雄性不育恢复基因的AFLP标记

采用AFLP技术对辣椒细胞质雄性不育系21A及其相应的恢复系湘紫基因组DNA进行多态性比较,筛选了64对AFLP选择性引物PstⅠ-NNN+MseⅠ-NNN组合,有58对引物组合在两系间扩增出5156条带,多态性位点为4个,主要表现为条带数目、条带位置和条带强弱的差异。其中在恢复系材料中仅有3个多态性片断,找到了辣椒细胞质雄性不育恢复系湘紫基因组DNA特异的AFLP片段ACA/CGC300、AGT/GGT375和AGC/CGC380,并对这些特异片段的来源及其在细胞质雄性不育恢复系中的作用进行了讨论。     

枸杞属AFLP分析体系优化与建立

以枸杞属种质资源为试材,对AFLP分析过程中包括DNA的提取质量和浓度、Mse I/EcoR I以及T4 DNA连接酶的浓度、反应时间等影响因素进行了研究.建立了一种适于枸杞AFLP银染技术的优化体系.该体系中各优化因素为:模板DNA的用量为300～400 ng,酶切体系中Mse I和EcoR I各加入3 U,T4 DNA连接酶加入2.0U,采用酶切与连接在同一体系中一步完成,其酶切温度为37℃,反应时间为5 h.与22℃连接过夜.并对预扩增、选择性扩增和银染的效果进行了检测,以引物M+CAC/E+AGG构建了枸杞种质资源的AFLP指纹图谱,该图谱扩增带多,多态性强,且质量好.     

AFLP分子标记技术及其应用

扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)是一种在PCR技术和RFLP标记技术基础上产生的一种新的分子标记技术。简述了该分子标记技术的原理和优缺点,综述了该技术在遗传连锁图谱的构建、遗传多样性研究、基因定位、分子辅助育种等方面的应用情况,并对其发展前景进行了展望。     

AFLP荧光标记和银染技术的比较分析

为了建立准确、高效、实用的AFLP体系和方法,采用改进的CTAB-DNA提取方法从披碱草的嫩叶中提取降解少、样品纯度高、蛋白去除干净、不含PCR反应抑制剂及其他酶反应抑制剂的总DNA.选取3对引物扩增,采用AFLP荧光标记和银染法对披碱草全基因组多态性进行了分析,其中荧光标记法得到231条条带,银染法得到75条条带,平均每条引物荧光标记技术比银染法多得到52条条带,多态比率是银染法的1.8倍.据此认为荧光标记法检测效果较为理想,适于进行披碱草遗传多样性的分析和研究.     

厚朴AFLP分子标记体系的建立

以厚朴 Magnolia officinalis为材料,通过对扩增片段长度多态性（AFLP）反应体系中的酶切模板用量、扩增条件等几个方面进行优化,建立了较为理想的厚朴AFLP反应体系。结果表明：①采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）硅珠法提取的DNA质量较好,适用于AFLP分析。②酶切的基因组DNA以400 ng为宜;预扩增产物的稀释倍数以30倍为宜;20.00 μL选扩反应体系中Mg²⁺最佳浓度为2.00 mmol·L^－1,三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）最佳浓度为0.225 mmol·L^－1,Taq DNA 聚合酶最佳用量为16.67 nkat时,扩增带清晰且稳定,扩增效果较好。旨在为研究厚朴天然种群的遗传多样性及遗传结构分析、新品种选育及鉴定和遗传图谱构建等奠定理论基础。图7表1参12     

两个鹅观草与披碱草属间杂种的染色体配对分析

通过人工远缘杂交,成功获得老芒麦(Elymus sibiricusL.,2n=4x=28)与大鹅观草(Roegneria grandisKeng,2n=4x=28)及鹅观草(R.kamojiOhwi,2n=6x=42)与Wawawai披碱草(E.wawawaiensisJ.R.Carlson&Barkworth,2n=4x=28)属间杂种F1植株。分析杂种减数分裂染色体配对行为显示:E.sibiricus×R.grandis染色体配对构型为17.90Ⅰ+4.90Ⅱ+0.10Ⅲ;R.kamoji×E.wawawaiensis的构型为11.02Ⅰ+11.96Ⅱ+0.02Ⅲ。结果表明:老芒麦与大鹅观草存在一个染色体组的部分同源关系(St),鹅观草与Wawawai披碱草具有2对同源的染色体组(St和H)。本试验结果与前人细胞学报道一致,支持大鹅观草具有StY染色体组。鹅观草属与披碱草属具有不同的染色体组组成,应为两个独立的属。     

悬铃叶苎麻AFLP反应体系的建立

【目的】建立悬铃叶苎麻植物AFLP反应体系,为其无融合生殖的分子标记及构建遗传图谱提供技术支持。【方法】以悬铃叶苎麻叶片为材料,采用改良CTAB法提取基因组DNA,并对酶切与连接体系、预扩和选扩程序进行探索,建立一套优化的AFLP反应体系。【结果】通过对EcoRⅠ+NNN/MseⅠ+NNN的64对引物组合的筛选,获得了清晰的选择性扩增图谱和多态性较高的引物组合。【结论】经多次重复验证,建立的优化体系可用于悬铃叶苎麻的AFLP分析。     

鹅观草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属物种的醇溶蛋白分析

应用酸性聚丙烯胺凝胶电泳(A-PAGE)对鹅观草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属19个物种进行醇溶蛋白电泳分析,19份材料电泳分离出75条相对迁移率不同的条带,均为多态性带。结果表明:①19个物种具有很显著的醇溶蛋白遗传差异;②聚类分析显示鹅观草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属物种各自聚为一类;猬草属的模式种Hystrix patula与披碱草属物种聚类在一起,而H.duthiei和H.longearistata单独聚为一类;③本研究结果与形态学、细胞学、RAPD和RAMP分析结果基本一致,鹅观草属、披碱草属和仲彬草属分别作为属分类等级处理是恰当的,猬草属的系统地位还有待于进一步的研究。     

梅花基因组AFLP银染反应体系的建立和优化

采用改进的SDS DNA提取方法从梅花的嫩叶和老叶中提取获得总DNA .所得DNA样品的OD2 6 0 OD2 80 值在1 7～ 1 9之间 ,琼脂糖凝胶上主带清晰、较少降解、样品纯度高、蛋白去除干净且得率高 .该体系对原提取程序作了多处简化 ,使操作简便、快捷、高效 ,适合于梅花DNA提取 ,所提取的DNA样品不含PCR反应抑制剂及其他酶反应抑制剂 ,可被限制性内切酶MseⅠ和EcoRⅠ完全酶切 ,适合AFLP PCR反应应用 ,得到清晰的指纹式样 .     

2种方法银染的AFLP片段再扩增效果比较及改进

Bassam银染法和Sanguinetti银染法是AFLP标记最常用的检测方法.本研究比较这2种方法银染的AFLP条带再扩增效果的差异,发现Bassam法银染的AFLP片段再扩增效率达到100%,而用同样的PCR条件,sanguinetti法银染的AFLP片段不能被扩增,限制了Sanguinetti法在AFLP标记分析中的应用.为提高Sanguinetti法银染的AFLP片段再扩增效率,对Sanguinetti法银染的AFLP片段回收和再扩增条件进行了改进.通过增加Sanguinetti法显色后的胶板漂洗次数、延长漂洗时间、改变AFLP条带浸泡溶液、增加浸泡液体积和增加PCR循环次数,成功地将Sanguinetti法银染的AFLP条带的再扩增效率提高到100%,从而解决了San-guinetti银染法应用的限制因素.     

银杏AFLP反应体系的建立及优化

以6个银杏种质为试材,通过对影响AFLP技术的多种因素进行研究,建立了一套适合银杏的AFLP技术优化体系。优化的关键因素为:①模板DNA的质量:经多次抽提纯化,将DNA沉淀挑出,而不采用离心方法,获得高纯度的DNA;②酶切时DNA模板为300 ng,反应时间为6 h;③连接最适反应时间为10 h;④预扩模板即连接产物最佳用量为1μl;⑤预扩增产物最适稀释倍数为70倍。     

野百合AFLP反应体系的建立及优化

以重庆市巫山和巫溪两地的野百合为实验材料,对实验中涉及的各个重要试剂,如接头浓度、预扩和选扩模板稀释倍数及dNTP等的用量进行梯度比较,确定最佳用量.结果表明：①改良的CTAB法提取的野百合基因组DNA经过纯化后符合AFLP实验要求;②接头浓度为50pmol/μL较好;③酶切连接产物稀释20倍,dNTP用量为1.0μL（50μL体系）,72℃开始扩增较好;④预扩增产物稀释30倍最佳.⑤从64个引物组合中筛选出符合野百合AFLP反应的20对引物组合.因此,优化后的体系适合野百合遗传多样性研究.     

悬铃木AFLP反应体系优化及引物筛选

以三球悬铃木为试验材料,通过对影响AFLP反应体系的各主要因素的研究,建立了悬铃木AFLP分析技术的体系.结果表明,悬铃木AFLP最佳酶切体系(20 μL)为模板DNA 1 000 ng,PstⅠ和MseⅠ各为3U,在37℃下双酶切3h;在20 μL最佳连接体系中,15 μL酶切产物为3U,T4连接酶,0.25 μmo...     

辣椒AFLP技术体系的建立与优化

以辣椒细胞质雄性不育系21A及其相应的保持系21B为材料,通过对影响辣椒AFLP技术体系的若干关键因素,如提取DNA的方法、酶切与连接、预扩增和选择性扩增以及电泳和染色条件等的研究,建立了经优化的适合于辣椒的AFLP分子标记技术体系。采用该体系,对辣椒进行AFLP分析,能够得到清晰稳定的分子标记图谱,为今后利用AFLP技术进行辣椒细胞质雄性不育基因的定位奠定了技术基础。