临床型奶牛乳房炎乳腺组织的比较蛋白质组研究

 【目的】采用比较蛋白质组学技术分析、检测了临床健康与乳房炎奶牛乳腺组织中的差异表达蛋白，以寻找药物治疗目标，探讨奶牛乳房炎的发生机理。【方法】采用二维凝胶电泳分离临床健康与乳房炎奶牛的乳腺组织蛋白，考马斯亮蓝染色，PDQuest7.4软件自动匹配检测差异表达蛋白斑点，高效液相色谱串联离子阱质谱分析鉴定。【结果】凝胶图谱中检测出15个差异蛋白斑点，串联质谱分析后有12个蛋白斑点可搜索到相应的结果，对应于10种蛋白质，主要涉及结合、运输和催化活性等分子功能，参与细胞、代谢及生物调节等生理过程。【结论】临床健康与乳房炎奶牛的乳腺组织中蛋白的表达模式存在差异，表达差异蛋白与奶牛乳房炎的发生相关，对其分析有利于探索机体的生理病理状态，还可为揭示奶牛乳房炎的发生机理提供直接依据。     

奶牛乳房炎乳腺膜蛋白的比较蛋白质组学研究

【目的】通过分析临床健康和乳房炎奶牛乳腺组织膜蛋白的差异表达,以期在蛋白质水平探索奶牛乳房炎的发生机理。【方法】采用二维凝胶电泳技术分离了临床健康和乳房炎奶牛的乳腺组织膜蛋白,经考马斯亮蓝染色后PDQuest 7.4软件匹配、检测凝胶中差异表达的蛋白点,对12个差异蛋白点采用高效液相色谱串联离子阱质谱分析,SEQUEST软件搜索NCBInr数据库。半定量RT-PCR分析差异表达蛋白的mRNA水平。【结果】12个差异蛋白点鉴定为11种蛋白质,其中9个蛋白点在临床型乳房炎奶牛乳腺组织膜蛋白中表达量上调而3个蛋白点表达量下调,主要涉及细胞膜骨架系统、信号转导、物质结合和传递等生物学功能。半定量RT-PCR分析表明,乳房炎奶牛乳腺组织中钙粒蛋白B的mRNA表达水平是健康奶牛的1.6倍。【结论】推测这些差异蛋白的表达变化与奶牛乳房炎发生相关,为从蛋白质水平揭示奶牛乳房炎的发生机理以及发现潜在的治疗目标蛋白提供了理论依据。     

临床型乳房炎奶牛乳清差异蛋白质的双向电泳图谱分析

采用双向凝胶电泳技术和计算机辅助图象分析方法,对临床型乳房炎奶牛和健康奶牛的乳清蛋白质进行分析和比较,结果表明:在等电点为4~8,相对分子量为15 000-75 000 kD的区域内,临床型乳房炎奶牛乳清中有(128±8)个蛋白斑点,而健康奶牛乳清中有(122±4)个蛋白斑点.对临床型乳房炎奶牛与健康奶牛乳清蛋白质图谱匹配比较发现,有31个蛋白质点表达存在明显差异,其中乳房炎乳清中有7个蛋白点表达发生明显上调,6个蛋白点表达发生明显下调,4个蛋白点没有表达,并且乳房炎乳清新出现了10个蛋白点.     

不同体细胞数牛乳中乳蛋白的比较蛋白质组学研究

 【目的】分析不同体细胞数牛乳中乳蛋白的表达变化。【方法】采用二维凝胶电泳技术分离了低体细胞数、中体细胞数、高体细胞数和临床乳房炎的牛乳蛋白，考马斯亮蓝G-250溶液染色，液相色谱串联质谱检测表达变化的蛋白点。【结果】在中体细胞数和高体细胞数乳中酪蛋白水解产物和白蛋白增加，在临床乳房炎牛乳中 α-、β-和κ-酪蛋白几乎全部水解，而白蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原β链和结合珠蛋白等乳清蛋白表达量增加。【结论】展示了不同体细胞数牛乳中乳蛋白的凝胶表达图谱，同时表明牛乳酪蛋白的水解程度随着体细胞数的增加而增加，至严重临床乳房炎时牛乳中酪蛋白几乎全部水解而乳清蛋白急剧增加。     

绵羊精子冻融前后差异蛋白质组学研究

 【目的】检测和分析绵羊精子冻融前后的差异蛋白质。【方法】用二维凝胶电泳分离精子蛋白，凝胶用考马斯亮蓝染色，用PDQuest8.0软件检测分析差异蛋白质斑点并经液相色谱串联离子阱质谱鉴定。【结果】鲜冻精凝胶图谱分析后得到 14个差异蛋白斑点，在国际生物信息学中心数据库搜索到相对应的5种蛋白质：推定的热休克蛋白70.1、转录因子AP-2α蛋白、烯醇酶、烯醇酶1和血清白蛋白前体。在解冻精子中，推定的热休克蛋白70.1、烯醇酶和烯醇酶1含量减少，转录因子AP-2α蛋白含量增加，血清白蛋白前体来源于精浆。【结论】绵羊精子经冷冻、解冻后,蛋白质存在差异，对差异蛋白质的研究有利于探索绵羊精子在冷冻过程中的生理状态，为进一步研究绵羊精子蛋白质组学及揭示精子冻伤机理提供依据。     

‘荷斯坦奶牛’产后期乳汁差异蛋白质组学研究

【目的】为了比较‘荷斯坦奶牛’产后期乳汁中蛋白质组表达的差异.【方法】应用双向电泳(2-DE)技术构建荷斯坦奶牛分娩当天,分娩后7d,分娩后15d,分娩后28d和分娩后35d乳汁二维凝胶电泳图谱,凝胶经考马斯亮蓝染色后,以3倍以上的表达变化用PDQuest 8.0分析.【结果】在这5个不同的时期共发现了8种差异蛋白,经MADIL-TOF-TOF串联质谱法分析发现这8种蛋白分别是:α-S2酪蛋白前体、β-酪蛋白、κ-酪蛋白前体、免疫球蛋白重链前体、白蛋白、血清白蛋白前体、cGMP磷酸二酯酶的α亚基、角蛋白I型细胞骨架10.【结论】根据这几种蛋白质的已有文献研究和蛋白含量在不同时期的变化趋势,表明这些蛋白可能与初乳的被动免疫、物质运输和泌乳有关.     

运输前后奶牛血清蛋白质组的变化

【目的】从血清蛋白组研究运输对奶牛机体的影响,充分理解运输对奶牛的生理病理影响及其潜在的作用机制提供理论依据。【方法】采用二维凝胶电泳（2-DE）结合MADIL-TOF-TOF串联质谱的方法对运输前第7天、运输后3 h和第7天奶牛的血清进行蛋白质组分析鉴定。【结果】运输可引起奶牛血清中14个蛋白点的表达丰度发生变化,有12个蛋白点得到有效鉴定。与运输前第7天相比,血清白蛋白、IgG1 重链恒定区、类型II细胞骨架I和转甲状腺素蛋白在运输后3 h表达量降低,而α1-酸性糖蛋白、结合珠蛋白、nesprin-2、微管微丝交联因子1、酪氨酸蛋白激酶Fps85D、输出蛋白5和一个未知蛋白点在运输后3 h的表达量升高;在运输后第7天,除α1 酸性糖蛋白外,上述蛋白的表达量与运输前第7天无显著差异。【结论】运输引起变化的蛋白主要涉及机体急性期应答和免疫反应、物质运输以及细胞内多个代谢途径,表明运输引起了奶牛应激。     

乳房炎奶牛乳汁体细胞数与乳汁HP、SAA和AGP水平关系的研究

对8头正常奶牛和22头自发性乳房炎奶牛的混合乳汁中血清淀粉样蛋白(SAA)、结合珠蛋白(HP)、α1-酸性糖蛋白(AGP)水平和乳汁体细胞数(SCC)的关系进行了研究.结果表明:乳房炎奶牛与正常奶牛乳汁中HP水平差异显著(P<0.05),与乳汁SCC存在极显著正相关关系(P=0.000,r=0.406);乳房炎奶牛与正常奶牛乳汁中SAA和AGP的差异不明显(P>0.05),而且与乳汁SCC的相关性也均不显著,说明乳汁HP水平能反映奶牛乳腺感染的严重程度.     

奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体的构建与鉴定

【目的】构建奶牛气管抗菌肽（TAP）基因乳腺特异性表达载体。【方法】根据GenBank中牛TAP基因cDNA序列（GenBank号:NM₁74776）设计引物,从奶牛乳腺组织中RT-PCR扩增TAP基因编码序列,将其克隆到pMD19-T（simple）载体中测序。重组质粒pMD-TAP经EcoRⅠ+KpnⅠ双酶切回收目的基因片段,亚克隆到携带增强型绿色荧光蛋白的通用型乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP中,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞（bMEC）、COS-7细胞,并注射泌乳家兔乳腺组织,荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达,半定量RT-PCR检测家兔乳腺组织中TAP mRNA的表达。【结果】成功构建了乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-TAP,该载体可在bMEC中特异性地表达绿色荧光蛋白;半定量RT-PCR检测发现,转染pBLG-EGFP-TAP可显著提高家兔乳腺组织中TAPmRNA的表达水平。【结论】成功构建了乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-TAP,为进一步研究奶牛TAP基因的表达特性及利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供了重要材料。     

广西某奶牛场乳房炎病原菌的流行调查

【目的】探索奶牛乳房炎的流行情况,分析病原菌的分布、变化及其规律,进一步阐明其引发病因,为本病的防治提供参考。【方法】通过临床诊断、加州乳房炎测试法(CMT)、革兰氏染色、菌液PCR、基因测序等方法,对某奶牛场奶牛乳房炎的发病率、及病原菌种类况以药物治疗情进行分析。【结果】临床型奶牛乳房炎的年平均发病率为8.3%,其隐性乳房炎乳占总乳区的40%。奶牛场长期使用头孢噻呋钠,林可霉素,庆大霉素,青霉素,链霉素等抗生素进行治疗,治疗效果不明显。乳房炎中分离得到的假丝酵母菌和毕赤酵母菌分别占真菌中的73.1%和25%,其中热带念珠菌占38.5%;大肠杆菌和链球菌分别占细菌中的22.7%和9.1%。【结论】该奶牛场的奶牛乳房炎的年发病率及隐性乳房炎乳较高,真菌比细菌感染率要显著,这可能与长期使用抗生素治疗、气候和牛场环境等因素密切有关。     

Comparative Proteomic Analysis of Plasma from Clinical Healthy Cows and Mastitic Cows

The current research presents the protein changes in plasma from healthy dairy cows and clinical mastitic cows using two- dimensional gel electrophoresis （2-DE）. After staining with silver nitrate and Coomassie Blue, differential expression proteins were detected by PDQuest 7.4 software, and then subjected to ion trap mass spectrometer equipped with a Surveyor HPLC System, differential spots of protein were identified. Three protein spots that originated from preparation gels were identified to be two proteins. Overall, haptoglobin precursor was up-regulated in cows infected with clinical mastitis and could be a mastitis-associated diagnostic marker, whereas SCGB 2A1 （secretoglobin, family 2A, member 1） was down-regulated protein. Plasma protein expression patterns were changed when cows were infected with mammary gland inflammation; it suggests that analysis of differential expression protein might be useful to clarify the mechanisms involved in the pathophysiology, and find new diagnostic markers of mastitis and potential protein targets for treatment.     

乳腺炎奶牛乳腺组织损伤的原因及防治

乳腺炎作为一种乳腺炎症反应,是奶牛场“最昂贵”的疾病。乳腺炎奶牛的乳腺组织在细菌因子和宿主免疫等作用下其上皮组织受到损伤,其相关机制有待深入研究。本文拟从细胞凋亡或坏死、细菌感染、中性粒细胞、血浆蛋白等方面总结奶牛乳腺炎乳腺组织损伤的原因,并提出防治措施,以期为有效防控奶牛乳腺炎提供科学理论基础和技术参考。     

茶树油对LPS诱导的奶牛乳腺炎的作用及其机制

【目的】奶牛乳腺炎一直是奶牛养殖业和奶制品行业最大的挑战之一,制约着奶业的健康发展。有效进行奶牛乳腺炎的防治,可以为奶牛的健康、生产优质乳制品提供良好保障。探究茶树油对LPS诱导的奶牛乳腺炎作用效果,探索茶树油替代抗生素治疗奶牛乳腺炎的可行性,为茶树油治疗奶牛乳腺炎提供参考。【方法】在牛乳腺上皮细胞的培养中分别添加50、100、200、500、1 000μg·mL^-1的LPS进行相关指标的检测。通过CCK-8法检测细胞增殖活性、流式细胞仪检测细胞凋亡、实时荧光定量检测细胞因子表达量以及ELISA检测相关蛋白的表达量等方法检测乳腺上皮细胞的相关指标。研究构建了LPS诱导的奶牛乳腺炎模型。在200μg·mL^-1 LPS诱导12h的奶牛乳腺炎细胞模型中分别添加0.0002%、0.0004%、0.0006%、0.0008%、0.001%、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.01%的茶树油进行相关指标的检测。【结果】CCK-8法检测细胞增殖活性,结果显示100μg·mL^-1的LPS攻毒情况下,细胞已开始出现不同程度的活性下降情况。进一步使用流式细胞术检测细胞凋亡情况,结果显示在诱导12h的情况下,100μg·mL^-1的LPS并未出现大量的细胞凋亡,而200μg·mL^-1的LPS诱导情况下约有46%左右的细胞出现了早期凋亡和晚期凋亡。以上结果表明：试验中,200μg·mL^-1 LPS诱导12h为构建奶牛乳腺炎模型的最佳条件。添加茶树油浓度为0.0004%、0.0006%、0.0008%时细胞的凋亡比例会有所下降,其中添加茶树油浓度为0.0006%的这一组保护效果最为明显,其活细胞比例71.95％,早期凋亡细胞比例22.15％,晚期凋亡细胞比例5.11％,与未添加茶树油的乳腺炎模型组活细胞相比提高了约22%。之后对有保护效果的3组进行qPCR检测细胞因子与凋亡因子表达量,结果显示随着加入茶树油的浓度上升,TNF-α表达量下调的较多,IL-6的表达量下调的较少（P<0．01）,STAT1的表达量在加入0.0004%浓度茶树油时有轻微的上调,在0.0006%和0.0008%浓度时表达量略微下调,其中添加0.0006%浓度茶树油表达量最低（P<0.05）。进一步使用ELISA法检测炎症蛋白和凋亡蛋白表达量,结果显示3组浓度的茶树油添加组均极显著降低了NF-κB、MAPK和Caspase-3的表达量,其中,0.0006%浓度茶树油组较其余浓度组的炎症反应蛋白的表达量最低,约为空白对照组的50%（P<0.05）,而这3组的凋亡反应相关蛋白表达量则几乎持平,约为空白对照组的55%（P<0.05）。【结论】茶树油对于奶牛乳腺炎有一定的拮抗作用,可以降低细胞凋亡比例,提高正常细胞的存活比例,并下调炎症因子与凋亡因子以及相应蛋白的表达量。     

应用SELDI-TOF-MS技术对患脂肪肝奶牛血浆差异蛋白的分离鉴定及生物学分析

【目的】脂肪肝是围产期奶牛主要代谢性疾病之一，50%产后奶牛受其影响。产后奶牛生产力降低、繁殖性能低下、免疫功能减弱、肝功能衰竭和过早死亡都与脂肪肝有关。表面增强激光解析/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）是一种对生物样本蛋白质研究的新型高敏感性蛋白质组学方法，文章旨在探讨脂肪肝奶牛血浆蛋白质组学特征。【方法】于黑龙江某集约化养牛场选择产后7—28d，1—2胎次荷斯坦奶牛40头。清晨空腹尾静脉采血10mL，应用肝素抗凝（150U）迅速离心（3 000 r/min，5 min）分离血浆,置于-80℃冰箱冷冻保存。依据血浆甘油三酯（TG＞0.20 mmol·L^-1）, 血浆β-羟丁酸（BHBA＞1.2mmol·L^-1）浓度和临床症状，将其分为试验组（T）20头和健康对照组（C）20头。应用SELDI-TOF-MS技术测得血浆蛋白质谱，利用Ciphergen Protein Chip Software (Version 3.1.1)对在试验组和对照组所有样品中得到的峰图进行分析，得到原始数据。将两组之间的数据峰值做wilcoxon sum rank test统计检验，用计算出的P值判断峰在两组中是否有显著差异。以0.01作为P值的阈值，筛选出P值小于0.01的差异峰。在得到的差异峰中，将差异峰的m/z值与Swissport蛋白数据库中多肽的理论荷质比 (mass to charge ratio，m/z)进行比较，找到最相似的蛋白作为差异峰可能检测蛋白的预测结果。【结果】与对照组相比，试验组奶牛血浆蛋白质谱存在39个差异峰，在得到的39个差异峰中，将差异峰的m/z值与Swissport蛋白数据库中多肽的理论荷质比值进行比较，最终获得26个可预测的差异峰，预测蛋白11种。结果显示，相对于C组，11种预测蛋白在T组中均表达下调。通过生物信息学（Network，GO，Pathway）分析，应用Cytoscape软件对获得的11种蛋白进行牛类基因网络搜索，得到Networks分析结果图。在数据库中搜索到了试验结果中的淀粉样肽前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)和纤维蛋白原α链(fibrinogen alpha chain, FGA)两种差异蛋白，并得到其相关的Networks分析结果。应用Cytoscape软件中BinGO插件对11种蛋白进行GO分析，并得到GO分析结果。对这些蛋白质经软件搜库得到已经注释的差异蛋白有9种，分别为FGA、血清淀粉样蛋白A (serum amyloid A protein, SAA)、血浆蛋白酶c1抑制剂（plasma protease c1 inhibitor, SERPING1 or C1INH）、血清载脂蛋白-CⅢ（apolipoprotein c-Ⅲ，ApoCⅢ）、海帕西啶（hepcidin, HAMP）、骨桥蛋白（osteopontin, OPN or SPP1）、 甲状腺素运转蛋白（transthyretin, TTR）、胱蛋白酶抑制剂C （cystatin-c, CysC or CST）、神经分泌血管生长因子蛋白（neurosecretory protein, VGF）。应用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）pathway数据库搜索。搜索结果显示只有6种蛋白质可在数据库中搜到，分别是FGA、SERPING1、APO-CⅢ、APP、CysC、SPP1。并得到其相关的Pathway分析结果。这些蛋白可能是与奶牛脂肪肝发病机制相关的物质。【结论】应用SELDI-TOF-MS技术有效的分离了健康牛与患病牛之间的血浆差异表达蛋白，均在肝脏代谢或脂肪肝疾病发生发展过程中起重要的调节作用，对探究奶牛脂肪肝发病机理及其对机体生物学功能的影响具有重要的理论价值。差异蛋白对奶牛脂肪肝的发病机理的影响尚待进一步研究。     

奶牛乳房炎大肠杆菌分离株主要免疫原性蛋白纯化

应用奶牛乳房炎大肠杆菌分离株灭活菌苗免疫健康家兔,制备兔抗大肠杆菌高免血清。对该大肠杆菌菌体裂解产物进行SDS-PAGE并进行Westernblot分析,结果该菌株与稀释一定倍数的兔高免血清反应,产生3条特异性带,其中约33ku蛋白为主要免疫原性蛋白。对其进行电洗脱纯化,得到单一条带的目的蛋白。     

基于GC/MS技术的产后卵巢静止奶牛血浆代谢谱分析

【目的】运用代谢组学中气相色谱/质谱联用技术(GC/MS)筛选卵巢静止奶牛和正常发情奶牛的血浆差异代谢物,探究奶牛发生卵巢静止时其体内代谢的变化。【方法】在黑龙江省某集约化牛场选取产后60—90 d,年龄、胎次、体况相近的经产高产奶牛为实验动物。根据奶牛的发情表现、直肠检查、B超检查及激素检测的结果,将奶牛分为发情组(A)22头和卵巢静止组(B)20头。应用GC/MS对两组奶牛的血浆样品进行检测得到其代谢组图谱,利用Chroma TOF软件对得到的峰图进行分析,得到原始数据。将标准化的GC/MS数据矩阵导入SIMCA-P+14.0软件包中,进行多元统计分析,先进行无监督的主成分分析PCA来观察各样本之间的总体分布和整个分析过程的稳定性,然后用有监督的(正交)偏最小二乘法分析(O)PLS-DA来区分各组间代谢轮廓的总体差异,找到组间的差异代谢物。为防止模型过拟合,采用七次循环交互验证和200次响应排序检验的方法来考察模型的质量。采用多维分析(O)PLS-DA和单维分析(t-test)相结合的办法,来筛选组间差异代谢物。在(O)PLS-DA分析中,变量权重值VIP1的变量为差异变量;在t-test中,P0.05的变量为差异变量。筛选VIP1且P0.05的代谢物作为差异代谢物,最后采用KEGG途径数据库对两组奶牛血浆样本进行代谢组学差异代谢物通路富集及互作网络构建分析。【结果】与正常发情奶牛相比,卵巢静止奶牛血浆中共有20种代谢产物表现异常,其中17种差异表达代谢物与奶牛卵巢静止的发生密切相关,包括水平增加的胆酸,水平下降的香草扁桃酸、烟酸甘氨酸、6-羟基烟酸、β-丙氨酸、L-酪氨酸、苯丙酮酸等,这些代谢产物参与了苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的生物合成,并参与了丙酸乙酯、烟酸烟碱、苯丙氨酸和酪氨酸的代谢,它们通过单一途径或综合途径对奶牛卵泡的正常生长产生干扰,从而引起卵巢静止。另外3种化合物亚氨基二乙酸、N-甲基-L-谷氨酸、3-氨基异丁酸可能与氨基酸代谢和细胞能量转运有关,其在奶牛卵巢静止中的生物学作用有待进一步证实。【结论】应用GC/MS技术有效的筛选出正常发情奶牛和卵巢静止奶牛之间的血浆差异代谢物,这些差异代谢物提示奶牛产后发生卵巢静止与体内多种物质代谢紊乱有关。这为今后深入探索奶牛产后卵巢静止的发病机理以及防治策略奠定了基础。     

奶牛乳房炎的免疫预防

[目的]为了加强奶牛乳房炎免疫控制。[方法]介绍奶牛乳房炎的病理学、发病机理、免疫与防御机制及其疫苗种类和研究进展。[结果]该病病原主要为多种非特定的病原微生物,致病机制仍然不太清楚,防御机制包括先天性免疫和特异性免疫,采取综合防治,特别要注意抗生素的使用问题。[结论]该研究为奶牛乳房炎的免疫研究提供了理论依据。