氯霉素残留检测竞争ELISA试剂盒的研制及其性能测定

应用抗氯霉素单克隆抗体(CAP mAb)杂交瘤细胞株建立竞争ELISA(ciELISA)分析方法,研制出CAP残留快速检测试剂盒(CAP-Kit),并对其性能进行了测定。结果表明,CAP-Kit标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,相关系数R2=0.9955,检测范围为0.1~128.0μg.L-1,半数抑制浓度(IC50)为2.4μg.L-1,灵敏度为0.053μg.L-1,检测限为0.1μg.L-1;奶样、肉样的平均添加回收率为88.5%、82.7%,平均批内和批间变异系数均<15%;CAP-Kit与氯霉素琥珀酸钠的交叉反应(CR%)为150%,与其他酰胺醇类和抗菌药物无CR;基质对CAP-Kit的检测结果影响不大;CAP-Kit在4℃可保存6个月以上。     

土壤中克百威残留检测直接竞争ELISA试剂盒的研制

研制了一种用于检测土壤中克百威残留量的直接竞争ELISA(酶联免疫分析技术)试剂盒,研究结果表明:该试剂盒的最低检测限为0.01 mg/L,线性检测范围为0.01～10 mg/L,4种水样的批内、批间、整体变异系数均低于7.72%,回收率的范围在93.97%～97.92%.试剂盒在4 ℃或-20 ℃下至少可保存6个月以上.     

氟罗沙星残留检测间接竞争ELISA试剂盒的研制

【目的】利用蛋白质连接技术合成氟罗沙星（FLE）人工抗原,制备FLE高亲和力抗体,通过建立、优化FLE的icELISA检测方法研制出快速、灵敏的FLE残留检测间接竞争ELISA试剂盒。【方法】用DCC法偶联FLE和载体蛋白BSA合成免疫原FLE-BSA,用混合酸酐法偶联FLE和载体蛋白OVA合成包被原FIE-OVA,通过紫外扫描法（UV Scan）和聚丙烯凝胶电泳法（SDS-PAGE）鉴定人工合成抗原。选择经初步鉴定成功合成的FLE-BSA免疫SPF级6-7周龄Balb/c雌性小鼠5只,采用多点免疫法,对小鼠背部皮下4-6点注射免疫,免疫剂量为30 μg/只,初免,用FLE-BSA PBS溶液与等体积FCA混合乳化后免疫;20 d后用FLE-BSA PBS溶液与等体积FIA混合乳化后免疫,免疫间隔3周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠多克隆血清,建立、优化FLE的icELISA检测方法,确定其包被浓度、包被时间、封闭液选择、封闭时间、抗体工作浓度、二抗稀释度、底物显色时间等条件,制备出FLE快速检测试剂盒,同时测定该试剂盒的灵敏度、精密度、准确度以及特异性等指标,并与高效液相色谱法做相关性比较,同时对市场上购买4个批次的氟罗沙星药品含量进行了实际测定,以确证试剂盒在实际应用中的质量。【结果】通过上述蛋白质连接技术所制备的免疫原经紫外扫描法和聚丙烯凝胶电泳法鉴定,结果显示BSA与FLE偶联后,FLE-BSA波峰整体出现右移且凝胶上BSA的泳动速度大于FLE-BSA,初步证明人工合成抗原偶联成功。通过间接ELISA和间接竞争ELISA方法测定5号小鼠多抗血清得到其效价大于2.5×104,抑制价为162.18 ng•mL-1。通过优化FLE icELISA检测方法,其工作条件：包被浓度：5 μg•mL-1;抗体工作浓度：1﹕6400;二抗稀释度：1﹕1000;底物显色时间：10 min。所制备的试剂盒灵敏度为16.22 ng•mL-1,标准曲线回归方程为y=－0.3627x + 1.3517（R2 = 0.9956）,与同系药物及其它药物均无明显交叉反应,阳性猪肝样的回收率在67.5%-87.9%,平均78.7%,变异系数在9.34%-10.7%,平均10.0%;阳性猪肉样的回收率在74.0%-88.2%,平均81.42%,变异系数在8.3%-10.4%,平均9.48%;平均变异系数均小于15%;在500、250、150、75、30 ng•mL-1 5个标准浓度 B/B0的批内变异系数在3.39%-6.68% ,批间变异系数在4.69%-9.67%。批内和批间平均变异系数分别为5.07%和7.44%,且与HPLC方法具有良好的一致性(R2=0.9988),通过实际测定其结果基本符合2010年版《中国药典》中所规定的含量要求(90%-110%),进一步说明二者具有良好的相关性以及FLE-Kit的准确性。【结论】首次利用两种方法分别合成FLE免疫原和包被原,利用所制备的抗FLE血清建立并优化FLE残留icELISA检测方法,制备出FLE快速检测试剂盒。该试剂盒具有灵敏、准确、简便、快速的特点,为氟罗沙星免疫学快速检测方法的建立奠定了坚实的基础。     

羊棘球蚴(包虫)间接ELISA抗体检测试剂盒的研制

[目的]研制基于Eg95重组蛋白为检测抗原的羊棘球蚴(包虫)间接ELISA抗体检测试剂盒。[方法]以细粒棘球蚴Eg95重组蛋白为检测抗原,筛选间接ELISA的最佳反应条件,确定ELISA的判定标准,检测敏感性和重复性,组成、包装试剂盒并初步应用。[结果]建立的ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,检测阳性血清和阴性血清的准确率均为100%。[结论]研制的羊棘球蚴(包虫)病ELISA抗体检测试剂盒可用于细粒棘球蚴Eg95亚单位疫苗抗体水平的检测。     

莱克多巴胺荧光试纸的初步研制及性能测定

基于河南省动物免疫学重点实验室制备并保存的莱克多巴胺单克隆抗体(RAC McAb),采用异硫氰酸荧光素(FITC)作为标记材料对之进行荧光标记,并对荧光探针FITC-RAC McAb进行纯化和荧光光谱鉴定;应用免疫层析技术研制RAC残留荧光检测试纸,并对其敏感性、特异性、重复性进行初步测定。结果表明：荧光探针标记成功,并应用于免疫层析试纸,检测试纸的最低检测限为1 μg/L,较同抗体的胶体金试纸的敏感性提高10倍;与其他激动剂类药物无交叉反应,具有良好的特异性;以不同批次的检测试纸对猪尿样和牛奶样进行检测,结果一致,具有良好的重复性;检测试纸在10 min内可显示结果。     

链霉素快速检测试纸的研制及其性能测定

以分泌抗链霉素(SM)单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞株的建立为基础,应用胶体金免疫层析技术成功研制出SM残留快速检测试纸,并对其敏感性、特异性、重复性、符合性等特性进行了测定。结果表明,检测试纸的检测限为8μg/L;检测上线为100μg/L;与双氢链霉素的交叉反应为100%,与其他抗生素类药无交叉反应;其敏感性与ELISA试剂盒相当,与ELISA试剂盒的检测结果符合率为100%;检测试纸在10 min内显示结果。     

ELISA检测方法中最佳封闭液和样品稀释液的筛选研究(英文)

[目的]为提高酶联免疫吸附法(ELISA)的敏感性和特异性,研究分析了不同类别和不同浓度的封闭液和样品稀释液对ELISA检测结果的影响。[方法]研究采用酪蛋白(Casein)、明胶(Gelatin)、BSA、山羊血清(GS)、马血清(HS)和兔血清(RS)等不同类封闭液和同一类不同浓度封闭液进行ELISA检测试验。[结果]2%BSA较1%BSA和3%BSA封闭效果好,2%Casein和1%Casein较3%Casein封闭效果好,8%RS和10%RS封闭效果强于6%RS和7%RS;与BSA和Casein相比,RS具有更好的封闭效果,且8%RS封闭液和8%RS样品稀释液组合最佳。[结论]良好的封闭液和样品稀释液组合可有效降低非特异性反应,提高ELISA检测方法的敏感性和特异性,这为良好ELISA检测方法的建立提供了重要实践指导作用。     

间接ELISA方法快速检测鲤春病毒(SVCV)的初步研究

以超速离心纯化的鲤春病毒(SVCV)免疫大白兔,制备了兔抗SVCV免疫血清,在此基础上建立了快速检测SVCV的间接ELISA方法,对40份经过细胞培养和RT-PCR方法检毕的SVC样品(8份阳性,32份阴性)进行验证,符合率100％.     

微囊藻毒素(MC-LR)ELISA检测方法的改进及误差分析

针对间接竞争ELISA检测微囊藻毒素(MC-LR)方法,利用微振荡免疫反应可缩短整个检测时间约60min.同时考察了水样中盐分、金属离子和pH值对测定结果的影响,并提出了可以利用稀释法减少甚至消除这些误差影响.     

凤果花叶病毒上海分离物(Pepino Mosaic Virus, PepMV-Sh)的初步鉴定及其ELISA检测方法的建立

对上海市引种的凤果(Solanum muricatum)植株进行的病原物调查发现有较严重的凤果花叶病发生，经研究确认系病毒感染所致。从发病植物中提取得到长度主要为100～250nm，宽度约为10nm的短杆状病毒颗粒，SDS—PAGE电泳显示其外壳蛋白的主成分是20kD的蛋白质，变性琼脂糖凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳分析均得到-RNA条带。经比对，该病毒分离物与原产地的凤果花叶病毒特性有一定的差别，暂定名为凤果花叶病毒上海分离物(Pepino Mosaic Virus，PepMV—Sh)，其植物病毒学分类地位待定。用纯化的凤果花叶病毒(PeoMV)制备了抗血清，建立了ELISA检测方法，并应用于凤果组培苗及大棚植株中病毒病的检测。     

磺胺嘧啶残留阻断ELISA试剂盒的研制及鉴定

基于1株分泌抗磺胺嘧啶(sulfadiazine,SD)高亲和力的SD单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),应用ELISA试验原理研制SD残留快速检测阻断ELISA试剂盒(SD-Kit),并对其特性进行测定。SD-Kit的标准曲线呈典型的S型,相关系数R2=0.9914,符合4参数logit曲线拟合,线性检测范围为0.02～12.92μg/L,灵敏度为0.08μg/L,半数抑制浓度(IC50)为0.54μg/L,检测限为0.08μg/L;鲜奶样和猪尿样的平均添加回收率分别为90.8%、95.8%,平均批内和批间变异系数均低于10%;基质对SD-Kit的检测结果影响不大;SD-Kit与磺胺甲基嘧啶的交叉反应率为2.7%,与其他磺胺类药几乎没有反应性;试剂盒在4℃可保存6个月。     

孔雀石绿胶体金快速检测试剂板的研制及应用

为建立孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂板,采用杭州南开日新生物技术有限公司实验室自制的包被抗原孔雀石绿-卵清蛋白偶联物(MG-OVA)、抗孔雀石绿单抗作为原料,将各组分经过调试优化后组装成试剂板。结果表明,该试剂板对阴性水产样品的检测结果与液相-串联质谱法(LC-MS/MS)完全符合,对水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的最低检出限分别为1μg/kg和3μg/kg,整个检测所需时间约30min。该试剂板具有快速、灵敏、准确的特点。     

三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体制备以及酶联免疫试剂盒的研究

[目的]探讨系统地检测水质中三甲氧苄氨嘧啶残留量的方法。[方法]通过三甲氧苄氨嘧啶与马来酸酐反应,得到三甲氧苄氨嘧啶半抗原,再通过免疫动物得到抗三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体,并将其应用于能够检测水质中三甲氧苄氨嘧啶残留量的ELISA试剂盒。[结果]试验表明,该试剂盒对水质中三甲氧苄氨嘧啶的检测限为2.34μg/kg,IC50(50%抑制浓度)为4.8μg/L,回收率为60.5%~79.7%,试剂盒的标准曲线范围为0~80μg/L,批内、批间的相对标准偏差均小于10%,三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体与二甲氧苄氨嘧啶的交叉反应率小于1%,4℃下能够保存12个月,稳定性较好。[结论]研究可为监管三甲氧苄氨嘧啶的滥用提供参考。     

诺氟沙星ELISA试剂盒研制与性能鉴定

【目的】建立诺氟沙星（norfloxacin,Nor）免疫检测试剂盒。【方法】基于所制备的诺氟沙星单克隆抗体,通过矩阵法筛选最佳抗体工作浓度和二抗工作浓度,建立诺氟沙星间接竞争ELISA试剂盒（Nor-kit）,并对其性能进行了鉴定和确证。【结果】Nor-kit的平均IC50 为5.18 μg•L-1,灵敏度为0.31 μg•L-1,检测限为1.00 μg•L-1。试剂盒除了和诺氟沙星反应外,还和同系物中的培氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、洛美沙星及恶喹酸有不同程度的交叉反应。奶样中回收率平均为103.23%,变异系数(CV)为9.33%。3个不同批次试剂盒的测定结果中,批内变异系数小于10%,且批间变异系数也小于10%;在4℃保存条件下,试剂盒可以保存6个月而质量不变。奶样添加回收试验,试剂盒与LC-MS/MS测定结果没有显著差异（P≥0.05）;而且检测实际生产中鲜奶样时,试剂盒与LC-MS/MS测定结果也无显著差异（P≥0.05）。【结论】本研究成功研制出灵敏、特异、简便的诺氟沙星残留检测ELISA试剂盒。     

三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体制备以及酶联免疫试剂盒的研究

[目的]探讨系统地检测水质中三甲氧苄氨嘧啶残留量的方法.[方法]通过三甲氧苄氨嘧啶与马来酸酐反应,得到三甲氧苄氨嘧啶半抗原,再通过免疫动物得到抗三甲氧苄氨嘧啶的单克隆抗体,并将其应用于能够检测水质中三甲氧苄氨嘧啶残留量的ELISA试剂盒.[结果]该试剂盒对水质中三甲氧苄氨嘧啶的检测限为2.34 μg/kg,IC50(50％抑制浓度)为4.8 μg/L,回收率为60.5％～79.7％,试剂盒的标准曲线范围为0～80 μg/L,批内、批间的相对标准偏差均小于10％.三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体与二甲氧苄氨嘧啶的交叉反应率小于1％.4℃下能够保存12个月,稳定性较好.[结论]研究结果为监管三甲氧苄氨嘧啶的滥用提供参考依据.     

快速检测联苯菊酯的胶体金层析试纸条研制

[目的]采用免疫胶体金技术,建立一种快速检测联苯菊酯的试纸条方法。[方法]利用有机合成方法制备了联苯菊酯半抗原,并与载体蛋白偶联得到免疫抗原,利用人工免疫的方法获得其单克隆抗体,通过酶联免疫法对制备的单克隆抗体的性能进行了验证。联苯菊酯胶体金层析试纸条是利用单克隆抗体标记胶体金,并将联苯菊酯抗原与羊抗鼠Ig G分别喷制到硝酸纤维膜上,与样品垫、吸水垫组装在PVC衬板上制备而成。[结果]联苯菊酯胶体金层析试纸条检测限为500~800μg/kg,具有速度快、简单等优点。此外,该试纸条与大部分的拟除虫菊酯没有明显的交叉反应,利用该试纸条可实现对苋菜中联苯菊酯添加试验的准确判定。[结论]胶体金试纸条方法具有前处理简单、检测速度快、可以肉眼判断结果等优点,该试纸条有望实现对果蔬中联苯菊酯残留的快速筛查。