猪Ghrelin基因真核表达载体构建(英文)

[目的]为研究转生长相关基因对猪的作用。[方法]采用RT-PCR方法,从13/17罗伯逊易位杂合子猪小肠组织中提取总RNA,将其纯化后作为PCR扩增模板,参考GenBank公布的猪Ghrelin的mRNA序列设计合成具有Nhe I和Hind III双酶切位点引物,扩增获得Ghrelin基因cD-NA全长序列。将准确的Ghrelin基因片段克隆于 pMD19-T simple Vector后进行序列分析,获得猪Ghrelin基因cDNA全长基因片段。经Nhe I和Hind III双酶切,将 Ghrelin基因cDNA片段连接到真核表达载体pEGFP-N1,获得真核表达载体的重组质粒pEGFP-Ghrelin。重组质粒转染猪成纤维细胞,观察标记基因荧光蛋白的表达。[结果]13/17罗伯逊易位杂合子猪的Ghrelin基因与已发表的序列相同,并成功获得具备猪Ghrelin基因全长cDNA序列的真核表达载体pEGFP-Ghrelin。[结论]构建的真核表达载体可以用于转基因猪的进一步试验,同时也为研究Ghrelin的调节机制奠定基础。     

梅山猪Ghrelin和Motilin基因克隆、结构分析及组织表达谱

分析克隆梅山猪Ghrelin和M otilin基因全编码序列并分析其核苷酸和氨基酸序列,系统研究它们的组织表达分布;用RT-PCR方法克隆梅山猪M otilin和Ghrelin基因全编码序列,并利用生物信息学和分子生物学技术相结合的方法分析它们的核苷酸和氨基酸序列;采用半定量RT-PCR技术检测梅山猪不同组织M otilin和GhrelinmRNA的相对丰度;显示,梅山猪Ghrelin和M otilin基因具有编码区cDNA单核甘酸多肽性(cSNPs);Gh-relin和M otilin基因呈广泛分布,在所取组织中均有不同程度的Ghrelin和M otilinmRNA表达。     

去势对公猪生殖轴上Ghrelin和功能性Ghrelin受体mRNA的影响

【目的】探讨手术去势(阉割)、免疫去势对公猪下丘脑-垂体-睾丸轴上Ghrelin mRNA和功能性Ghrelin受体1a mRNA表达的影响。【方法】将21头公猪随机均分为免疫去势组、未去势组和手术去势组,免疫去势组于9周龄初次接种免疫去势疫苗,17周龄加强免疫;手术去势组在仔猪出生7d内进行阉割去势;未去势组不作任何处理。25周龄时屠宰所有公猪,取下丘脑、垂体和睾丸组织,以β-actin为内参基因,采用实时荧光定量PCR法检测公猪下丘脑-垂体-睾丸轴Ghrelin及其受体mRNA基因的相对表达量。【结果】手术去势、免疫去势和未去势公猪下丘脑Ghrelin及其功能性受体mRNA基因相对表达量的差异不显著(P0.05),未去势公猪垂体Ghrelin mRNA的相对表达量显著低于手术阉割去势公猪(P0.05),免疫去势公猪睾丸中Ghrelin受体mRNA的相对表达量显著高于未去势公猪(P0.05)。【结论】公猪生殖轴存在Ghrelin mRNA和功能性Ghrelin受体mRNA,且手术阉割去势导致垂体中Ghrelin mRNA的相对表达量增加,免疫去势增加了睾丸Ghrelin受体mRNA的相对表达量,提示Ghrelin可能对生殖轴有调节功能。     

Ghrelin基因在藏猪胃底组织中的mRNA表达

为分析Ghrelin基因在藏猪与长白猪胃底组织中mRNA的表达差异,运用实时荧光定量PCR技术,对Ghrelin基因在藏猪与长白猪胃底组织中mRNA的表达水平进行相对定量检测分析。结果显示,藏猪胃底组织中mRNA的表达量(0.495 8±0.023 1)显著低于长白猪(0.741 7±0.026 6)。说明Ghrelin基因在藏猪胃底组织中mRNA的低表达可能是藏猪生长缓慢的原因之一,这将为提高藏猪生长速度的进一步研究奠定基础。     

梅花鹿Ghrelin全长cDNA克隆及其序列分析

为获得梅花鹿Ghrelin cDNA全序列,以梅花鹿皱胃黏膜上皮组织提取的总RNA为模板,通过RT-PCR和RACE法克隆了梅花鹿皱胃中Ghrelin基因cDNA的全序列。结果表明梅花鹿Ghrelin cDNA序列全长为539bp,其中5’非翻译区(5’UTR)为46bp,3’UTR为128bp,开放阅读框(ORF)为351bp,该ORF编码116个氨基酸残基。将梅花鹿Ghrelin基因的cDNA与人和其他动物的Ghrelin相比,发现:梅花鹿Ghrelin与驯鹿、山羊、绵羊和牛的同源性达90.4%~99.1%;与恒河猴、人、猪、犬的同源性达76.6%~66.9%;与鸡和野鸽的同源性分别为36.4%和35.4%。研究表明Ghrelin的结构具有明显的种属特异性,因此Ghrelin在反刍动物体内可能有着重要的生理功能。     

兔神经肽S及其受体基因的克隆、组织表达及热应激对其表达的影响

 【目的】研究神经肽S(NPS)及其受体（NPSR）mRNA在兔全身各组织的表达情况，以及热应激对兔下丘脑、垂体和肾上腺轴NPS及NPSR mRNA表达的影响。【方法】利用基因克隆方法克隆出兔神经肽S及其受体的cDNA序列，以GAPDH为内参基因，采用相对定量RT-PCR方法检测NPS及NPSR mRNA在兔体内各组织中的表达情况以及热应激对NPS及NPSR mRNA在下丘脑-垂体-肾上腺轴表达的影响，【结果】克隆出兔NPS及其NPSR cDNA序列，兔NPS cDNA全序列为270 bp，NPSR的部分序列为847 bp，GenBank登录号分别为EU978456和FJ713102；经DNAStar软件分析，不同物种之间NPS及其受体基因序列的同源性较高，进化树分析显示NPS与大鼠和小鼠亲缘性最近，符合物种之间的进化关系。NPS及其受体在兔各组织广泛分布，主要集中在中枢神经系统、甲状腺、唾液腺和乳腺。持续热应激处理后，下丘脑和肾上腺中NPS mRNA的表达均为先升高后降至对照组水平，且分别在热应激1 h和0.5 h时表达丰度达到最高，与对照组差异极显著（P＜0.01）；垂体中试验组NPS mRNA均呈下降趋势，与对照组差异极显著（P＜0.01）；NPSR与NPS mRNA在下丘脑、垂体和肾上腺中的表达模式相似。【结论】兔NPS及其受体基因在进化上是保守的；NPS及其受体在兔体内广泛表达，具有组织特异性；热应激时NPS及其受体mRNA在HPA轴上的表达发生了变化。     

马鹿生长素Ghrelin全长cDNA的克隆及序列分析

为获得马鹿(Cervus elaphus)Ghrelin全长cDNA序列并进行序列比较和分析,本试验以马鹿皱胃黏膜组织内提取的总RNA为模板,通过RT-PCR、RACE和基因克隆等技术进行克隆。结果表明:获得长度为539bp的马鹿cDNA全序列(GenBank accession no.KX857494),其中包括46bp的5′非编码区(5′UTR),351bp的开放阅读框(ORF),编码116个氨基酸残基的前原Ghrelin(preproghrelin),128bp的3′非编码区(3′UTR)和poly(A)14;Ghrelin的氨基酸同源性分析表明,马鹿Ghrelin cDNA全序列与驯鹿、梅花鹿、山羊、绵羊、牛等物种间的同源性较高,进化树分析与其亲缘关系远近一致。     

猪下丘脑促生长激素释放激素(GHRH)基因克隆及序列分析

从杜长大杂交猪的下丘脑中提取基因组RNA，根据报道的猪GHRH cDNA序列设计引物1和引物2，用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）进行cDNA扩增，获得一条132 bp的片段，克隆于pGEM-T Easy载体后进行序列分析表明，该片段为GHRH基因的cDNA，它由132个核苷酸组成，编码44个氨基酸组成的多肽，即GHRH。本研究扩增得到的基因片段与报道的猪GHRH基因编码区序列完全一致。     

Ghrelin对奶山羊下丘脑神经肽Y(NPY)和刺鼠相关蛋白(AGRP)mRNA表达的影响

研究Ghrelin对奶山羊下丘脑神经肽Y(NPY)和刺鼠相关蛋白(AGRP)mRNA表达的影响。10只泌乳期莎能奶山羊随机分为试验组和对照组,每组5只。试验组静脉注射Ghrelin(3.0μg/kg),3h后宰杀,迅速取下丘脑,检测下丘脑脑神经肽Y和刺鼠相关蛋白mRNA的表达。结果表明,一定剂量的Ghrelin对NPY mRNA的表达具极显著上调作用(P0.01);对AGRP mRNA的表达也有显著促进作用(P0.01)。以上结果提示Ghrelin可能通过对这些神经肽的作用参与对奶山羊摄食和能量代谢等生理活动的调节。     

Ghrelin和GHS-R1a mRNA在牛卵母细胞体外成熟过程中的表达

【目的】探讨Ghrelin和GHS-R1a mRNA在牛卵母细胞体外成熟过程中的表达及二者表达与FSH之间的关系。【方法】 利用实时定量RT-PCR技术检测体外成熟进程中牛卵母细胞Ghrelin和GHS-R1a mRNA水平表达变化,观察不同浓度FSH对Ghrelin和GHS-R1a mRNA表达的作用以及FSH与FSH受体抑制剂的组合对Ghrelin和GHS-R1a基因表达的影响。【结果】 实时定量RT-PCR结果揭示牛卵母细胞Ghrelin和GHS-R1a mRNA的相对表达量随着成熟过程的延长而呈现一定变化规律,即Ghrelin和GHS-R1a mRNA在卵母细胞体外成熟过程中从8 h开始显著下降并持续此低表达水平到24 h;不同浓度FSH 显著抑制卵母细胞Ghrelin及GHS-R1a mRNA的表达,而FSH 受体抑制剂明显减弱FSH的抑制作用而促进二者表达。【结论】Ghrelin和GHS-R1a mRNA在卵母细胞体外成熟过程中的表达可能随着培养液中FSH升高而降低。     

正常孕妇与妊高症患者胎盘中Ghrelin、GHS-R mRNA的表达研究

[目的]通过比较正常孕妇与妊高症患者胎盘中Ghrelin及其受体GHS-RmRNA水平的变化，探讨Ghrelin及其受体与妊高症的发病是否相关。[方法]采用实时荧光定量RT-PCR技术检测了正常孕妇胎盘和妊高症患者胎盘中Ghrelin及其受体GHS-RmRNA水平相对表达量的变化。[结果]正常孕妇胎盘组织中mRNA水平与妊高症患者胎盘组织中mRNA水平无显著性差异，但Ghrelin受体GHS-R在两者之间的mRNA水平有显著性差异（P〈0．05）。[结论]Ghrelin及其受体在妊高症患者和正常孕妇胎盘中表达的相对变化表明，Ghrelin受体缺乏可能成为妊高症发病的因素之一。     

绵羊Ghrelin基因的克隆和生物信息学分析

根据GenBank中报道的绵羊Ghrelin基因mRNA序列设计特异性引物,以甘肃肉用绵羊新品种选育群羔羊皱胃组织RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出绵羊Ghrelin基因并克隆到pMD18-T载体中进行测序验证.用生物信息学软件预测其结构,并构建系统进化树,探讨了绵羊Ghrelin基因的生物学功能.结果表明:克隆的绵羊Ghrelin基因序列共409bp,包含完整的编码区序列,含有1个351bp的完整开放阅读框,编码116个氨基酸;Ghrelin蛋白分子质量为12 975.74u,理论等电点为4.70,信号肽切割点位于第23～24位氨基酸之间,整条多肽链表现为疏水性,是一种典型的跨膜脂溶性蛋白;Ghrelin基因编码产物的二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,主要位于胞外(包括细胞膜),作为一种激素参与机体胁迫应答、免疫应答和转录调控.     

蓝塘猪和长白猪leptin和leptin受体基因表达的变化

用实时荧光定量PCR方法研究了蓝塘猪和长白猪1、27、90、150和180日龄阶段脂肪组织中leptin基因mRNA和下丘脑中leptin受体基因mRNA的变化,并对2个品种不同生长阶段血液中leptin含量的变化规律进行了探讨。结果表明:(1)蓝塘猪180日龄时皮下脂肪中leptin基因表达量显著高于其它各阶段,而与长白猪相比,蓝塘猪除1日龄低于长白猪外,其它各个阶段均高于长白猪,180日龄两者差异极显著;长白猪各阶段间差异不显著;(2)蓝塘猪180日龄时下丘脑中leptin受体基因的表达量显著高于其它各阶段,长白猪180日龄时最高,且显著高于1日龄和27日龄,蓝塘猪与长白猪1日龄时差异显著;(3)蓝塘猪血清中leptin浓度各阶段均高于长白猪,两品种均是150日龄时最高,蓝塘猪150日龄显著高于27日龄和180日龄,长白猪各阶段差异不显著。     

Leptin长型受体与神经肽Y在猪前脑内共存

用原位杂交与免疫组织化学相结合的方法研究了 5头三元杂交仔猪前脑内leptin长型受体mRNA与神经肽Y(NPY)免疫反应阳性物质的共存关系。实验结果表明 ,leptin长型受体mRNA和NPY免疫反应阳性神经元分布于下丘脑漏斗核和前室周核、海马、杏仁核及大脑皮质。上述结构内一些表达leptin长型受体mRNA的神经元也含有NPY免疫反应阳性物质 ,即leptin长型受体与NPY共存于同一神经元内。提示leptin可能通过下丘脑漏斗核和室周核以及边缘系统的海马和杏仁核 ,甚至大脑皮质中表达leptin长型受体mRNA的NPY免疫反应阳性神经元调节动物的摄食、能量代谢、生长和繁殖等活动。     

鱼类Ghrelin的研究进展

Ghelin是1条N末端第3个氨基酸被脂肪酸链修饰含有28个氨基酸的多肽。Ghrelin的发现扩展了其在脊椎动物调节能量动态平衡中的作用。Ghrelin不仅具有刺激鱼类生长激素的释放、提高摄食量和引起肥胖等生物作用,还能影响多种激素释放以及调节GH/IGF-1轴。其生物学作用主要通过与体内的内源性配体生长激素促分泌素受体-1a(GHSR-1a)结合而实现。针对以上这些重要的生物学作用,介绍了鱼类Ghrelin的研究进展。     

松辽黑猪×野猪杂交猪H-FABP mRNA基因的组织分布研究

1材料与方法 1．1材料松辽黑猪X野猪杂交猪（含野猪血缘50％）组织样品采自吉林省农业科学院畜牧分院，采集的皮下脂肪、腹脂、乳腺、背最长肌、臂三头肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、回肠、十二指肠共计12种组织样品迅速置于液氮中，实验室-80℃保存。