秋季罗非鱼及其养殖环境中食源性致病菌菌相分析

[目的]为罗非鱼食源致病微生物的预警和防治提供理论基础。[方法]对秋季广东省不同区域3个养殖场的正常罗非鱼体及其养殖环境中食源性致病菌种类进行调查分析。[结果]罗非鱼及其养殖环境受致病微生物不同程度的污染，分离到的致病菌经初步鉴定为10个菌属，其中以埃希菌属最多，鱼体检出率为67％，养殖环境检出率为100％；沙门氏菌属在罗非鱼体中的检出率（52％）比养殖环境中检出率（39％）高；其次为克雷伯氏菌属、假单胞菌属、链球菌属、变形杆菌、肠杆菌属、金色单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属等。[结论]秋季罗非鱼体及养殖环境正受各种致病菌不同程度的污染。     

贵阳市市售猪肉中食源性致病菌分离鉴定

为了解贵阳市市售猪肉中食源性致病菌的污染情况,采集贵阳市市售猪肉样品60份,按照相关国家标准分离鉴定样品中的沙门氏菌、志贺氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠杆菌。结果表明:样品中食源性致病菌总检出率为13.33%,其中沙门氏菌检出率为6.67%,金黄色葡萄球菌检出率为3.33%,志贺氏菌检出率为1.67%,单核细胞增生李斯特菌检出率为1.67%,肠出血性大肠杆菌未检出。说明贵阳市市售猪肉中沙门氏菌的污染率最高,金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌也存在一定污染情况。     

春夏季养殖罗非鱼体内食源性致病菌分析

[目的]为罗非鱼食源性致病菌的预警和防治提供理论基础。[方法]以2008年2～7月广东省不同区域罗非鱼养殖场为调查对象,定期采样分析罗非鱼体内及养殖环境中食源性致病菌的分布情况。[结果]春季罗非鱼养殖环境中共鉴定出8种致病菌,鱼体内共鉴定出6种致病菌;夏季罗非鱼养殖环境中共鉴定出13种致病菌,鱼体内共鉴定出12种致病菌;致病性嗜水气单胞菌、致泻大肠埃希菌、霍乱弧菌是养殖罗非鱼体内的主要食源性致病菌;夏季食源性致病菌的种类与数量多于春季。[结论]罗非鱼食源性致病菌的分布与养殖区域、水温及溶氧量等具有密切关系。     

鲢鱼嗜水气单胞菌PCR检测方法的建立

根据基因库中嗜水气单胞菌16SrRNA基因序列,设计并合成一对特异性引物,用PCR方法对从病死鲢鱼体内分离到的1株嗜水气单胞菌进行扩增,并对PCR反应条件进行优化,同时测试了该方法的特异性和敏感性.特异性试验结果显示,该引物能扩增出680bp的嗜水气单胞菌特异基因片段,与鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、温和气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、[HT5",7"]鱼[KG-*3]回[HT5"]爱德华氏菌及海豚链球菌无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法最低检测量为10pg嗜水气单胞菌基因总DNA.表明该实验所建立的PCR检测方法可用于鲢鱼嗜水气单胞菌的快速诊断,对有效治疗和控制鱼类嗜水气单胞菌病的流行具有重要意义.     

3个罗非鱼种群对4种病原菌的抗病力差异比较

[目的]比较吉富罗非鱼F5代(以下简称吉富F5代)、吉富罗非鱼F0代(以下简称吉富F0代)及奥尼罗非鱼对4种病原菌的抗病力差异,为罗非鱼苗种推广养殖提供参考依据.[方法]检测吉富F5代无乳链球菌(Ia和Ib血清型)、海豚链球菌和嗜水气单胞菌对吉富F5代的半致死浓度(LC50),并对3个罗非鱼种群进行人工腹腔注射感染4种病原菌,根据感染后的累计死亡率评估其抗病力差异.[结果]无乳链球菌Ia血清型对吉富F5代的LC50为2.14×105 CFU/mL,无链球菌Ib血清型对吉富F5代的LC50为2.14×106 CFU/mL,海豚链球菌对吉富F5代的LC50为2.14×107 CFU/mL,嗜水气单胞菌对吉富F5代的LC50为5.62×107 CFU/mL.3个罗非鱼种群感染病原菌后连续观察168 h发现,感染无乳链球菌Ia血清型菌株(HN016)的累计死亡率排序为吉富F0代>吉富F5代>奥尼罗非鱼;感染无乳链球菌Ib血清型菌株(GX26)的累计死亡率排序为吉富F0代>吉富F5代>奥尼罗非鱼;感染海豚链球菌菌株(GX05)的累计死亡率排序为吉富F0代>奥尼罗非鱼>吉富F5代;感染嗜水气单胞菌菌株(GX03)的累计死亡率排序为吉富F0代>吉富F5代>奥尼罗非鱼.方差分析结果显示,吉富F5代感染HN016、GX26、GX05和GX03后的累计死亡率均显著低于吉富F0代(P<0.05),与奥尼罗非鱼差异不显著(P>0.05).[结论]经过连续5代选育后,吉富罗非鱼对无乳链球菌(Ia和Ib血清型)、海豚链球菌及嗜水气单胞菌的抗感染能力均得到显著提高,并已接近奥尼罗非鱼的抗病水平.     

PCR检测诊断罗非鱼荧光假单胞菌病技术的建立

根据基因库荧光假单胞菌的16S-23S rDNA基因序列设计一对特异性引物,用PCR对4株鱼荧光假单胞菌进行扩增。特异性结果显示该对引物对4株荧光假单胞菌均扩增出与预期大小相一致的428bp的扩增产物,而对罗非鱼嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、罗非鱼迟缓爱德华氏菌、斑点叉尾鮰钻鱼爱德华氏菌、柱状嗜纤维菌、链球菌、葡萄球菌、河弧菌、大肠杆菌和沙门氏菌等10种病原体的扩增,结果全为阴性。该PCR敏感性结果表明可以检测到1pg的荧光假单胞菌DNA模板。     

PCR检测诊断罗非鱼荧光假单胞菌病技术的建立

根据基因库荧光假单胞菌的16S-23S rDNA基因序列设计一对特异性引物,用PCR对4株鱼荧光假单胞菌进行扩增.特异性结果显示该对引物对4株荧光假单胞菌均扩增出与预期大小相一致的428 bp的扩增产物,而对罗非鱼嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、罗非鱼迟缓爱德华氏菌、斑点叉尾鮰钻鱼爱德华氏菌、柱状嗜纤维菌、链球菌、葡萄球菌、河弧菌、大肠杆菌和沙门氏菌等10种病原体的扩增,结果全为阴性.该PCR敏感性结果表明可以检测到1 pg的荧光假单胞菌DNA模板.     

食源性致病菌基因组DNA的高效提取方法

研究高效提取食源性致病菌DNA的方法,以适用于变性高效液相色谱基因分型法的高通量快速检测.试验采用沸水浴法、酚/氯仿-CTAB法、chelex100法和酶解吸附膜法分别提取沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、空肠弯曲菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、肠出血性大肠杆菌O157∶ H7、创伤弧菌中主要的食源性致病菌基因组DNA.并对基因组DNA的纯度和产量进行测定,通过定性、定量分析,确定了适用于食源性致病菌快速检测的DNA提取方法--酶解吸附膜法.     

孟加拉进口黄鳝中致病性嗜水气单胞菌的分离与鉴定

[目的]了解致病性睹水气单胞菌的存在状况和风险水平.[方法]采用分离培养、生化鉴定、序列测定和动物试验等方法,对2批孟加拉进口黄鳝进行致病性睹水气单胞菌检测.[结果]从孟加拉进口黄鳝体内分离出4株高度致病性的嗜水气单胞菌.嗜水气单胞菌对孟加拉黄鳝本身致病性不明显,但是对小鼠的致病性却高达10 000～ 100 000 CFU/ml.[结论]孟加拉进口黄鳝存在致病性睹水气单胞菌的感染,且对我国的食品和卫生安全存在一定的风险.     

渔用抗生素类药物(2)

正(续第1期第27页)氟苯尼考预混剂[主要成分]氟苯尼考。本药为氟苯尼考与乳糖等配制而成。[性状]为白色粉末。[规格]50%。[作用与用途]酰胺醇类抗生素。用于防治嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、链球菌等引起的感染。如鱼类细菌性败血症、溶血性腹水病、肠炎、赤皮病等,也可治疗虾、蟹类弧菌病,罗非鱼链球菌病等。     

奶牛子宫内膜炎病原菌的分离·鉴定及药敏试验

[目的]了解奶牛子宫内膜炎的病原菌感染情况与耐药现状.[方法]随机采集库尔勒地区某牛场患子宫内膜炎奶牛的子宫黏液20份,进行实验室细菌学的分离、生化鉴定及药敏试验.[结果]共分离出89株菌,其中链球菌45株,占50.56％;葡萄球菌24株,占26.97％;大肠杆菌13株,占14.60％;蜡样芽胞杆菌7株,占7.87％.分离出的单一菌株的检出率为80％ （16/20）.引起该地区奶牛子宫内膜炎的主要病原菌是链球菌、葡萄球菌.对链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌这4种菌抑菌效果最好的药物依次分别为奥复星、氟苯尼考、甲氧苄啶、氟苯尼考.[结论]该研究可为指导子宫内膜炎的临床用药和预防提供理论依据与技术支持.     

2011~2016年广西罗非鱼源无乳链球菌的耐药谱型分析

[目的]了解广西罗非鱼源无乳链球菌耐药谱的变迁规律,为罗非鱼无乳链球菌病的有效防控和科学用药提供参考.[方法]采用K-B纸片扩散法对分离自广西南宁、玉林、柳州、河池、北海和百色等市养殖患病罗非鱼的48株无乳链球菌株进行抗生素耐药性分析;并以抗生素的抑菌圈直径为变量,采用SPSS 18.0对无乳链球菌株进行聚类分析,以平方Euclidean距离表示菌株间的耐药性同类关系.[结果]48株广西罗非鱼源无乳链球菌的耐药谱型共有19种,谱型丰富度为39.6%.所有耐药谱型均为多重耐药谱型,耐药种数至少有3种.从采样地点来看,南宁市、玉林市、柳州市、河池市、北海市和百色市的分离株分别包含5、9、8、2、1和2种耐药谱型.2011~2016年各年份的菌株耐药谱型为:2011年10种(A、B、F、J、K、N、O、P、Q和S耐药谱型),2012年4种(B、H、N和S耐药谱型),2013年2种(L和M耐药谱型),2014年3种(B、D和S耐药谱型),2015年9种(B、C、D、E、G、H、J、R和S耐药谱型),2016年3种(B、I和J耐药谱型).聚类分析将48株广西罗非鱼源无乳链球菌分成2个组群(Group I和Group II)和6个亚群(i~vi),其中Group I和Group II组群均含有11种耐药谱型,耐药谱型丰富度分别为37.9%和57.9%;Group I和Group II两组群无乳链球菌株的抗生素敏感性差异主要取决于其对恩诺沙星、氟苯尼考和环丙沙星的敏感率或耐药率.[结论]2011~2016年广西罗非鱼源无乳链球菌的耐药谱型呈多样性,谱型丰富度较高,且因来源地不同和年际变化存在一定差异性.此外,通过聚类分析可根据无乳链球菌的耐药情况对其进行有效分型,建议作为无乳链球菌流行病学分型方法给予推广应用.     

黄颡鱼体表溃疡病病原菌分离鉴定及药敏试验

[目的]对广西永福县某养殖场患溃疡病的黄颡鱼进行病原菌分离鉴定和药敏试验,为有效防治该病提供科学依据.[方法]用常规方法从患典型溃疡病的濒死黄颡鱼的心脏、肝脏及病灶等处取样分离病原菌,通过人工感染试验确定分离菌株的致病性,用API 20NE生化鉴定系统对其进行鉴定,药敏试验采用纸片扩散法.[结果]分离获得的4株细菌(YFHS01、YFHS02、YFHS03和YFHS04)对健康黄颡鱼均有很强的致病性,都是黄颡鱼体表溃疡病病原菌,其中YFHS01为温和气单胞菌(Aeromonas sobria),YFHS02、YFHS03和YFHS04为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila).4株病原菌对青霉素和氨苄青霉素均不敏感;对复达欣、先锋霉素Ⅵ、菌必治、庆大霉素、新霉素、氟哌酸、恩诺沙星、环丙沙星、多粘菌素B、左氟沙星、先锋必、特治星、氟苯尼考、盐酸沙拉沙星、复方磺胺嘧啶等15种药物高度敏感.[结论]广西永福县某养殖场黄颡鱼体表溃疡病是由嗜水气单胞菌与温和气单胞菌混合感染引起,可选用复达欣、先锋霉素Ⅵ、菌必治、庆大霉素、新霉素、氟哌酸、恩诺沙星、环丙沙星、多粘菌素B、左氟沙星、先锋必、特治星、氟苯尼考、盐酸沙拉沙星、复方磺胺嘧啶等15种药物进行防治.     

无乳链球菌感染吉富品系尼罗罗非鱼的病理学研究

[目的]确定无乳链球菌侵染吉富品系尼罗罗非鱼的途径及靶器官,为罗非鱼抗病育种及无乳链球菌病疫苗的研发提供理论依据.[方法]分别采用腹腔注射、经口灌胃及体外浸泡3种方式对吉富品系尼罗罗非鱼进行无乳链球菌感染,然后采集感染罗非鱼的鳃、脾脏、肝脏和小肠组织进行病理形态学观察,并利用家兔抗无乳链球菌血清进行免疫组织化学定位,明确不同感染途径下无乳链球菌在鱼体内各组织中的分布规律及其浸染的靶器官.[结果]3种人工感染方式均能促使吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌,其中,腹腔注射和经口灌胃在感染2h后即出现病理变化,而体外浸泡感染方式出现病理变化的时间约在感染5h后,且病变程度较腹腔注射和经口灌胃的感染方式轻.免疫组织化学定位发现,腹腔注射组吉富品系尼罗罗非鱼的病原菌信号出现顺序为脾脏→肝脏和鳃→小肠,经口灌胃组的病原菌信号出现顺序为小肠→鳃和脾脏→肝脏,体外浸泡组的病原菌信号出现顺序为鳃→脾脏→肝脏和小肠.[结论]采用腹腔注射、经口灌胃及体外浸泡3种方式均能促使吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌,其对应的病原菌信号分别优先在脾脏、肠道和鳃组织出现.因此,自然养殖条件下防止养殖水体和食源被无乳链球菌污染是防控罗非鱼无乳链球菌病暴发的有效措施.     

致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法的建立

[目的]建立一种基于PCR的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。[方法]采用平板划线法从患病鲫鱼病灶部位分离、纯化获得嗜水气单胞菌,采用CTAB法提取DNA,根据GenBank已经登录的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因保守序列设计引物P1和P2,并以P1、P2为引物对其进行PCR扩增,将测序结果在Blast上进行比对分析。[结果]PCR扩增得到一条约540 bp的条带,Blast分析表明该基因与GenBank登录的气溶素基因的同源性达95.67%。[结论]试验建立的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法简单、可行。     

锯缘青蟹黄水病病原菌的分离与鉴定

[目的]确定锯缘青蟹黄水病致病菌的病原。[方法]对从患黄水病的锯缘青蟹体内分离出的28株致病菌株进行培养、形态鉴定、生理生化鉴定和人工感染等试验。[结果]分离出的菌株均为弧菌科细菌,其中嗜水气单胞菌12株、辛辛那提弧菌8株、副溶血弧菌5株、温和气单胞菌3株。[结论]4种菌株均为青蟹黄水病的病原菌,其中嗜水气单胞菌为优势种群。     

石龟嗜水气单孢菌的分离鉴定及药敏特性研究

从患病石龟上分离获得1株革兰氏阴性杆菌,菌体细长、无芽孢和荚膜,在山羊血琼脂平板上能形成明显的β-溶血圈。经小白鼠致病性试验、生理生化鉴定及16SrRNA序列分析,确定该分离株为致病性嗜水气单孢菌。经同源性及遗传进化分析发现,该菌株与嗜水气单孢菌B27、HSO2（Genbank登录号：FJ494900．1、FJ562211．1）同源性高达99．5％。而药敏试验表明,该分离株除了对赛福欣（复方恩诺沙星）、肠清（复方乳酸环丙沙星）2种药物高度敏感外,对大部分抗菌素均不敏感。     

嗜水气单胞菌临床分离菌对抗菌药物的耐药性调查

摘[目的]了解嗜水气单胞菌的耐药性。[方法]从不同水生动物体内分离、鉴定出120株嗜水气单胞菌，采用纸片扩散法研究其对18种药物的耐药性。[结果]120株嗜水气单胞菌对阿米卡星和多西环素的耐药性较低，而对其他药物的耐药性均较强，其中，对p内酰胺类药物的耐药率为38％～90％；氨基糖苷类药物中，嗜水气单胞菌对阿米卡星的耐药率小于100k，而对其他药物的耐药性均较强；其他类药物中，对多西环素、环丙沙星和氧氟沙星的耐药率小于50％，而对其余药物的耐药率均在50％～77％〈之间；嗜水气单胞菌对阿米卡星、多西环素、环丙沙星和氧氟沙星的中介率较高。[结论]水生动物嗜水气单胞菌对抗菌药物具有较强的耐药性。     

罗非鱼竖鳞病病原菌的分离鉴定及药敏试验

[目的]对广西南宁市邕江(石埠段)网箱养殖患竖鳞病的罗非鱼进行病原菌分离鉴定及药敏试验,为有效防控罗非鱼竖鳞病提供参考依据.[方法]用常规方法从患病濒死罗非鱼的腹水、肝脏、心脏及脑等组织中分离病原菌,然后通过人工感染试验、氧化酶试验及API 20NE生化鉴定系统进行鉴定,并采用K-B药敏纸片扩散法进行药敏试验.[结果]从患竖鳞病的罗非鱼中分离出4株病原菌NNSB1、NNSB2、NNSB3和NNSB4,其中NNSB1和NNSB4为温和气单胞菌,NNSB2和NNSB3为嗜水气单胞菌.4株病原菌对复达欣、菌必治、氟哌酸、恩诺沙星、环丙沙星、先锋必、特治星、氟苯尼考、盐酸沙拉沙星和复方磺胺嘧啶等20种药物高度敏感,对青霉素G和氨苄青霉素不敏感.[结论]广西南宁市邕江(石埠段)网箱养殖罗非鱼的竖鳞病是由嗜水气单胞菌与温和气单胞菌共同感染引起,可选用复达欣、菌必治、氟哌酸、恩诺沙星、环丙沙星、先锋必、特治星、氟苯尼考、盐酸沙拉沙星和复方磺胺嘧啶等20种药物进行防治,若同时在网箱内吊挂三氯异氰脲酸片,其效果更佳.     

双重 PC R检测罗非鱼源无乳链球菌方法的建立

根据罗非鱼源无乳链球菌16S rRNA 基因和sip基因序列,设计、合成2对特异性引物,通过对反应体系和反应条件优化,建立快速检测无乳链球菌的双重PCR方法。该方法扩增无乳链球菌可获得1305 bp和121 bp 2个特异性片段;对6株链球菌属的菌株进行特异性分析,仅无乳链球菌能扩增出16S rRNA 基因和sip基因2条特异性条带,而海豚链球菌无条带检出;经灵敏度试验,可检测到无乳链球菌菌株070717LL的最小量为1.05＆#215;10^2 CFU ;同时,双重PCR可以检测出无乳链球菌菌株070717LL人工感染的罗非鱼脾、脑、肾组织中细菌DNA ,特别是脾脏和肾脏组织的样品检测效果好。结果证明所建立的方法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点,适用于对罗非鱼源无乳链球菌病的流行病学调查。