用显微注射法将绿色荧光蛋白基因导入金鱼受精卵中表达

采用显微注射法将绿色荧光蛋白（GFP）基因重组表达质粒导入金鱼受精卵中，以期获得能发绿色荧光的金鱼。结果显示，在注射的3批金鱼受精卵中（第一批4310粒，第二批3952粒，第三批4056粒），分别孵出鱼苗543、282和266尾，出苗率为17.02%、12.53%和13.52%，其中表达绿色荧光的金鱼分别为23、24和18尾，表达率为4.24%、8.51%和6.77%。荧光表达检测发现，从肌肉效应期就开始检测得到绿色荧光。     

全鱼基因在鲤鱼体内整合行为的研究

应用直接显微注射的方法将全鱼融合基因导徼鲤鱼受精卵的动物极，进行卵化，我们共注射１８８８粒鲁鱼受精卵，孵出鱼苗（平游期）１１１０尾，孵化率为５８．８％，通过斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交文检测该基因的整合情况，结果表明，整合率为２２．７％（１０／１４），本文为外漂基因整合机理的研究提供理论和实验依据。     

北移大鲵人工繁殖研究

[目的]研究北移大鲵人工繁殖成功的可能性及大鲵进行异地保护的可行性。[方法]通过温度、营养调控进行亲鲵培育,采用促黄体素释放激素类似物（LHRH-A2）与绒毛膜促性腺激素（HCG）组合对人工驯养的性成熟的北移大鲵进行人工繁殖。[结果]繁殖亲鲵共产卵41468粒,平均催产率83.0%,受精卵总数为24507粒,受精率平均为56.4%,在17.5～19.5℃经35～40d孵化,合计出苗5036尾,受精卵平均孵化率为23.9%,苗种培育30d后共成活4482尾,成活率平均为91.3%。[结论]大鲵可以在北方进行人工繁殖。大鲵的异地保护是可行的。     

PiggyBac转座元件的构建及其在团头鲂基因组中的转基因效率

鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的PiggyBac(PB)转座子已用于模式生物小鼠的转基因及插入诱变研究,目前,该转座子在养殖鱼类中的转基因效率如何还不清楚。构建了带PiggyBac转座子左臂、右臂、EF1α启动子和绿色荧光蛋白(eGFP)编码框的pPBs-EF1α-eGFP供体质粒。以50 ng/μL供体质粒和100 ng/μL体外转录的PB转座酶mRNA共同显微注射入团头鲂(Megalobrama amblycephala)1~2细胞期受精卵中,团头鲂eGFP的荧光表达率可达58.26%,PCR检测结果显示,该转座系统在团头鲂成鱼基因组中的整合效率为53.04%。表明PiggyBac转座子可高效介导基因在团头鲂基因组中的插入,为进一步开展团头鲂插入诱变研究奠定了基础。     

短须裂腹鱼规模化人工繁育技术研究

2012—2013年,为提高短须裂腹鱼人工繁育能力,以刚涌出的清澈无致病菌和虫的地下泉水为水源,采用水流培育亲鱼、流水孵化受精卵、活体饵料培育鱼苗等关键技术,进行短须裂腹鱼规模化人工繁育技术研究。结果表明:2年共采捕野生短须裂腹鱼亲鱼403尾,在水流速度0.1~0.3 m/s、水温12~16℃、pH值6.5~7.0、溶氧6 mg/L以上的流水池中培育,平均驯养成活率49.4%,获成熟亲鱼234尾次;共催产亲鱼224尾次,产卵雌鱼133尾次,总产卵量127.3万粒,平均每尾雌鱼产卵0.957万粒;获受精卵93.8万粒,平均受精率为73.7%;受精卵在水温12.5~14.0℃的流水孵化槽中孵化199 h开始出膜,共孵出幼体85.5万粒,平均孵化率91.2%;共获2 cm仔鱼55.1万尾,平均出苗率58.7%;共获3.5 cm鱼苗45.2万尾,鱼苗培育成活率为82.0%。     

水中花——长乐漳港大自然金鱼场观鱼记

“皇冠尽权媚，丹顶亦风流。金玉水中仙，四季美情柔．”近期记者慕名来到长乐漳港大自然金鱼场采访，见识到一批目前顶级的“福州金鱼”，在面积近60亩的大小鱼池里，游弋着品种各异的巨型金鱼，它们宛如散落在水中的花朵般五彩缤纷，异彩纷呈。据鱼场场长孙宝陵介绍，大自然金鱼场主要饲养2至3年龄段巨型顶级金鱼，主要品种有：兰寿，熊猫（又称黑白蝶尾）．皇冠珍珠鳞等，不触普通的商品金鱼。所属的两个鱼场经过每蒯筛选淘汰，每年只养出200尾左右的巨型顶级金鱼。     

奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体的构建与鉴定

【目的】构建奶牛气管抗菌肽（TAP）基因乳腺特异性表达载体。【方法】根据GenBank中牛TAP基因cDNA序列（GenBank号:NM₁74776）设计引物,从奶牛乳腺组织中RT-PCR扩增TAP基因编码序列,将其克隆到pMD19-T（simple）载体中测序。重组质粒pMD-TAP经EcoRⅠ+KpnⅠ双酶切回收目的基因片段,亚克隆到携带增强型绿色荧光蛋白的通用型乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP中,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞（bMEC）、COS-7细胞,并注射泌乳家兔乳腺组织,荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达,半定量RT-PCR检测家兔乳腺组织中TAP mRNA的表达。【结果】成功构建了乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-TAP,该载体可在bMEC中特异性地表达绿色荧光蛋白;半定量RT-PCR检测发现,转染pBLG-EGFP-TAP可显著提高家兔乳腺组织中TAPmRNA的表达水平。【结论】成功构建了乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-TAP,为进一步研究奶牛TAP基因的表达特性及利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供了重要材料。     

巨核酸酶I-SceI转基因元件的构建及其在斑马鱼中转基因效率的评估

巨核酸酶I-SceI是由酿酒酵母线粒体中的核糖体大亚基上的I型内含子编码的一种核酸内切酶,近年已被应用于转基因研究中。I-SceI介导的转基因大多是将I-SceI蛋白和带有其识别位点的质粒共注射于动物的受精卵,但注射酶蛋白前期处理耗时长且工作量大,直接用I-SceI的mRNA代替蛋白进行注射可更为简捷。本研究应用I-SceI mRNA介导荧光蛋白基因在斑马鱼中的转植,进一步了解其转基因效率。首先设计合成带有巨核酸酶I-SceI编码序列的辅助质粒,pCS2-I-SceI,并分别构建了带有巨核酸酶I-SceI识别位点、EF1α启动子和荧光蛋白基因（eGFP/RFP）编码序列的供体质粒pI-SceI-EF1α-eGFP/RFP。辅助质粒pCS2-I-SceI体外转录成mRNA, 以50ng/μl供体质粒和100ng/μl的I-SceI巨核酸酶mRNA共注射到斑马鱼（Danio ririo）受精卵中,注射后48 h时的斑马鱼eGFP的平均荧光表达率可达75.86%。在斑马鱼的头部、躯干到尾部均可观察到荧光蛋白的表达,且随着胚胎发育,荧光信号逐渐增强。结果表明I-SceI系统在斑马鱼中可介导较高效率的转植,具有在经济鱼类转基因研究中应用的潜力。     

绿色荧光蛋白基因原核表达质粒pET32a-AcGFP1的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

 为了构建绿色荧光蛋白AcGFP1基因的原核表达载体pET32a AcGFP1,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达,本研究以pIRES AcGFP1质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增绿色荧光蛋白AcGFP1基因,通过酶切和连接使其与原核表达载体pET32a（+）构成重组子,经PCR、酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达绿色荧光蛋白,经15% SDS PAGE鉴定,结果显示：重组质粒pET32a AcGFP1中的AcGFP1序列与Clontech公司的pIRES AcGFP1质粒的AcGFP1序列完全一致,表明本实验已成功构建了含有绿色荧光蛋白基因AcGFP1的原核表达质粒。此外,pET32a AcGFP1转化Rosetta（DE3）,经不同浓度的IPTG诱导,SDS PAGE检测均获得高效表达,为今后构建pET32a(+) TAT AcGFP1融合表达载体以及深入研究TAT的细胞膜穿透作用的机制奠定基础。     

借助mtDNA控制区序列分析金鱼与不同地域鲫的亲缘关系

用PCR法克隆测定了4个品种金鱼（草金、文种、龙种和蛋种）、6个不同水域鲫与银鲫的m tDNA控制区部分序列,并对之进行比较分析。结果表明：测得的金鱼与鲫的序列长度均为471 bp,银鲫为472bp;在所用样品中共检测到10种单倍型,金鱼4品种间序列无差异,共享1种单倍型;11尾鲫（来自6个不同水域）呈现8种单倍型,4尾银鲫（来自2个不同水域）共享1种单倍型。聚类分析结果表明,金鱼隶属于鲫的一支,银鲫呈独立的另一支。对金鱼与不同地域鲫的遗传距离测定结果表明：金鱼与嘉兴南湖的鲫亲缘关系最近（遗传距离D=0.00426）,其次为盐城射阳湖鲫（D=0.00534）、淮河鲫（D=0.00641）、鄱阳湖鲫（D=0.00749）,再次为黄河下游鲫（D=0.01073）,与闽江鲫亲缘关系较远（D=0.01291）。据此推测,金鱼起源于长江流域的鲫。     

绿色荧光蛋白在IGF2b基因慢病毒载体感染鲤受精卵中的标记效果

以水母绿色荧光蛋白基因为模板进行PCR扩增得到目的基因(Green fluorescence protein, GFP),然后加上酶切位点BamHI和NheI,构建pLenti6.3IRESEGFP载体,转染DH5α感受态细胞进行菌落PCR,取阳性进行酶切鉴定,再取呈阳性的质粒进行测序,使用浓度为1 μg/μL的质粒与慢病毒表达载体进行连接,通过荧光显微镜观察到绿色荧光,表明本实验获得的GFP和慢病毒载体整合成功;用此转染293T细胞,通过荧光显微镜同样检测到了绿色荧光。使用建鲤的组织提取RNA,然后按照Fermentas公司的MMLV操作说明书进行反转录,得到IGF2b基因后加酶切位点进行扩增,将IGF2b整合到用GFP作为标记基因的慢病毒载体上,再以此转染建鲤未分裂的受精卵,48 h后通过荧光显微镜也观察到了绿色荧光蛋白的表达。试验表明绿色荧光蛋白在IGF2b基因慢病毒载体感染鲤受精卵中的标记是成功的。这些结果为基于含有GFP慢病毒转基因鱼育种技术的开发奠定了基础。     

Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes

Transgenic rhesus monkeys carrying the green fluorescent protein (GFP) gene were produced by injecting pseudotyped replication-defective retroviral vector into the perivitelline space of 224 mature rhesus oocytes, later fertilized by intracytoplasmic sperm injection. Of the three males born from 20 embryo transfers, one was transgenic when accessible tissues were assayed for transgene DNA and messenger RNA. All tissues that were studied from a fraternal set of twins, miscarried at 73 days, carried the transgene, as confirmed by Southern analyses, and the GFP transgene reporter was detected by both direct and indirect fluorescence imaging.     

沙塘鳢室内繁殖研究

[目的]探索沙塘鳢繁育技术,为规模化养殖提供基础。[方法]采用了人工繁殖和自然繁殖两种方法对沙塘鳢天然捕捞成熟个体进行室内繁殖研究。人工繁殖分别用催产剂HCG、催产合剂LRH-A2＋DOM催产亲本;自然繁殖选择性腺成熟雌雄鱼按1.0∶1.2比例放入塑料箱中交配产卵,定期收集卵粒、统计产卵雌鱼数。[结果]注射HCG人工催产沙塘鳢雌鱼易发生流产现象,获得的受精卵在卵巢中分散粘附,孵化第2天卵粒开始发白、脱落,未孵化出鱼苗;催产合剂LRH-A2＋DOM催产亲本未获得受精卵。自然繁殖组中沙塘鳢自然产卵率70%,受精卵在鱼巢上粘附规则,经孵化获得鱼苗,孵化率50%。[结论]沙塘鳢宜采取自然繁殖方式进行繁殖。     

核定位信号肽和转运肽对斑马鱼转基因效率的影响

为了探讨核定位信号肽S413-PV和转运肽Tp10这2种融合肽对转基因效率的影响,将S413-PV和Tp10与线性化质粒分别以质量比50∶1、100∶1、200∶1混合制成转染液,注射斑马鱼单细胞期胚胎,分别检测转染24 h、120 h后胚胎的阳性率和成活率。结果表明:与对照组相比,转染24 h后,S413-PV组胚胎阳性率极显著上升,胚胎成活率均下降,但差异不显著;Tp10组阳性率均呈上升趋势,200∶1组差异极显著,其他组差异不显著,胚胎成活率均显著下降;转染120 h后,S413-PV组胚胎阳性率均极显著上升,胚胎成活率均呈下降趋势,100∶1、200∶1组差异极显著;Tp10组胚胎阳性率上升,200∶1组差异显著,胚胎成活率均极显著下降。以上结果表明,S413-PV可显著提高斑马鱼转基因效率,对胚胎毒性较小;Tp10对转基因效率影响不显著,且对胚胎毒性较强。     

体细胞核移植技术生产转基因猪胚胎的研究

以转染绿色荧光蛋白基因的猪胎儿成纤维阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,体外成熟卵母细胞为核移植受体构建绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,研究供核细胞的处理、注核部位及重构胚融合/激活时间对转GFP克隆胚早期发育的影响.结果显示,胎儿成纤维细胞血清饥饿与非饥饿培养10 d处理组,采用卵周间隙核移植重构胚的卵裂率（82.35%和79.07%）差异不显著(P >0.05);体外培养42~44 h 卵母细胞进行胞质内和卵周间隙注核的重构胚胎,其卵裂率（81.11%和76.80%）差异不显著（P >0.05）;将卵周间隙注射法构建重构胚在0~1 h,2~4 h 和6~8 h 进行融合/激活操作,前2组重构胚卵裂率（75.61%和83.07%）无显著差异(P >0.05),但显著高于第3组（60.00%）的卵裂率(P <0.05).     

低能氩离子束介导将绿色荧光蛋白基因导入小麦的研究

用低能氩离子束介导将改良的绿色荧光蛋白基因（ｍＧＦＰ４）导入小麦栽培品种皖９２１０和皖麦３２号的成熟胚细胞。在含有１００￣１４０ｍ／Ｌ巴龙霉素培养基上继代培养后,获得了一批抗性愈伤组织。经过分化培养,皖９２１０获得５株再生苗,皖麦３２号获得３２株绿苗,对照的２００枚成熟胚未获得再生苗。对再生苗进行ＰＣＲ检测,均扩增出６００ｂｐ的ｎｐｔⅡ基因片段。取４株长势好的绿苗进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析,结果     

大鳞鱼巴人工繁育技术初报

从乌兹别克斯坦引进体质量20～40g的野生大鳞鱼巴(Barbus capito)鱼种,经5年人工培育性腺已发育成熟,2008年5月筛选8尾亲鱼进行人工繁殖试验。结果表明:注射催产药物LHRH-A2、HCG和DOM可促使亲鱼产卵和排精,催产的尾雌鱼中有3尾成功产卵,获得受精卵4.8万粒,孵出鱼苗3万尾,其催产率、受精率、孵化率分别为75％，72.3％67.1％。水温20～23℃时,从受精卵到孵出鱼苗需要约70 h,到仔鱼上浮开口需要约6 d。在哈尔滨地区池塘人工培育大鳞鱼巴鱼苗,1龄鱼体质量可达(40.06±1.19)g,体长(14.34±0.15)cm。     

rbcS启动子的克隆及活性鉴定

利用PCR技术从豌豆(Pisum satium Linn)基因组DNA中分离了rbcS基因启动子及叶绿体定位信号编码序列。序列分析表明,扩增片段(1256bp)与已报道序列的相应区域同源性达98.41 %。将其与绿色荧光蛋白基因(GFP)串连在一起,构建了植物表达载体,通过基因枪介导法转化烟草叶片及洋葱表皮细胞。结果表明这一表达系统增强了绿色荧光蛋白基因的瞬时表达,从而为外源基因在转基因植物中的高效表达提供了新的工具,可以实现目的基因的组织特异性和光诱导性表达。     

慢病毒法生产转基因鸡的初步研究

[目的]探索利用慢病毒生产转基因鸡的适宜方法。[方法]以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建慢病毒载体,包装病毒后感染鸡早期受精卵,并检测不同注射操作和不同接种滴度对鸡胚存活率的影响,同时对接种病毒鸡胚的GFP表达情况进行检测。[结果]采用105、106和107IU/ml的慢病毒滴度,鸡胚孵化率分别为87%、72%和66.7%。以雏鸡血液基因组为模板PCR鉴定转基因阳性率为45.5%;冰冻切片技术发现GFP基因在鸡体内不同组织的表达强度差异显著,免疫系统内表达最强,生殖系统和肌肉组织中GFP基因无表达。[结论]试验初步筛选出较适宜的慢病毒感染滴度,该结果为研制蛋鸡生物反应器和转基因鸡抗病新品系奠定了基础。