牛分枝杆菌PtpA蛋白对NF-κB信号通路的调控机制

【目的】研究牛分枝杆菌Mycobacterium bovis PtpA蛋白对免疫应答相关的NF-κB信号通路的影响,以揭示PtpA蛋白在机体免疫应答中的作用。【方法】构建PtpA基因真核表达载体FLAG-PtpA,并将其转染到HEK293T中,进行SDS-PAGE分析及Western blot检测。激活NF-κB信号通路后,通过双荧光素酶试验和qPCR方法探究PtpA蛋白对NF-κB信号通路的影响。【结果】成功构建PtpA基因真核表达载体FLAG-PtpA,转染HEK293T后经SDS-PAGE分析,相对分子质量约为22 000处可见特异性蛋白条带。Western blot结果显示,表达产物可与一抗特异性结合,证明该蛋白是PtpA蛋白。双荧光素酶试验中,转染2～24 h,试验组与对照组萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的相对荧光强度的比值差异显著(P0.05);转染2 h后,对照组萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的相对荧光值是试验组的2.93倍,说明PtpA蛋白对NF-κB信号通路激活早期具有显著的抑制作用。qPCR结果显示,转染2 h后,对照组的IL-6、GM-CSF、BIRC-2和BIRC-3的表达量分别是试验组的3.93、3.42、2.17和2.30倍(P0.01);转染4 h后,对照组的IL-6、GM-CSF、BIRC-2和BIRC-3的表达量分别是试验组的4.26、3.93、2.36和2.50倍(P0.01),说明PtpA蛋白对NF-κB信号通路相关的细胞因子(IL-6、GM-CSF、BIRC-2、BIRC-3)在免疫早期具有显著抑制作用。【结论】qPCR结果与双荧光素酶试验结果一致,表明牛分枝杆菌PtpA蛋白对NF-κB信号通路的影响主要发生在早期。本研究为后续研究有效的结核病防控药物提供了理论基础。     

Hedgehog和NF-κB信号通路在结核分枝杆菌感染Ⅱ型肺泡上皮细胞中的免疫调控作用初探

探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染Ⅱ型肺泡上皮细胞(Alveolar epithelial typeⅡcells,AECⅡ)的免疫应答过程中,Hedgehog与NF-κB信号通路及炎症细胞因子的表达变化规律。利用结核分枝杆菌BCG(Bacillus Calmette-Guérin,BCG,卡介苗,弱毒株)和H37Rv(国际标准强毒株)株分别感染人AECⅡ细胞株A549,利用q PCR和Western blot检测Hedgehog信号通路以及NF-κB信号通路相关因子和炎症细胞因子的表达变化。结果表明,H37Rv和BCG感染A549细胞后,Hedgehog信号通路中Shh、Ptch和Gli1与NF-κB信号通路中p-NF-κB m RNA的表达水平升高,同时,伴随着炎症细胞因子IL-8和TNF-αm RNA的表达水平也升高。并且,H37Rv感染A549细胞引起信号分子Shh、Ptch、Gli1和NF-κB蛋白的表达水平高于BCG。Mtb感染AECⅡ细胞都能激活Hedgehog信号通路和NF-κB信号通路并促进细胞的炎症因子分泌,强毒株感染对信号通路的活化强于弱毒株。     

新城疫病毒感染通过蛋白激酶激活NF-κB信号通路诱导干扰素和炎症因子的表达

[目的]本文旨在探究新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染过程中细胞因子显著上调的机制。[方法]NDV感染He La细胞,用RT-PCR法检测IFN-β、IL-6、IL-8 mRNA水平。Western blot分析和免疫荧光分析检测NDV对双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)与NF-κB信号通路的影响。[结果]与未感染组相比,IFN-β、IL-6、IL-8 mRNA水平显著上调。NF-κB信号通路在感染后12~24 h被激活,转录因子p65入核,而使用NF-κB信号通路抑制剂IKK16则显著降低了干扰素和炎症因子的表达,证明NF-κB信号通路介导NDV感染过程中的细胞因子表达和炎症反应。另外,在病毒感染过程中,病原模式识别受体PKR被诱导表达并且被磷酸化激活。使用抑制剂2-氨基嘌呤抑制PKR活性后,能够抑制p65的入核,并减少由NDV诱导的干扰素和炎症因子表达。[结论]NDV感染能够通过PKR调控NF-κB信号通路,引起细胞因子显著上调。     

小鼠Toll样受体9基因的克隆、表达及其活性的初步鉴定

从小鼠巨噬细胞中提取细胞总RNA,采用RT-PCR技术扩增小鼠Toll样受体9(mTLR9)cDNA,构建真核表达质粒p3XFLAG-CMV-7.1-mTLR9,转染293T细胞,利用Western Blotting检测蛋白表达,并用双荧光素酶报告基因系统检测mTLR9对其介导的信号通路下游转录因子NF-κB转录活性影响.结果表明,本试验成功克隆到小鼠TLR9cDNA,构建的重组体转染细胞后表达的蛋白分子质量与预计相符,并能激活下游转录因子NF-κB的转录活性.     

猪圆环病毒2型诱导PK-15细胞产生IFN-β的信号通路研究

【目的】研究猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)感染PK-15细胞后调控β-干扰素(interferon-β,IFN-β)生成的信号通路,为猪圆环病毒病的发生机理和防治提供理论基础。【方法】将PK-15细胞随机分成5组:对照组、PCV2组、BX795(TBK1/IKKε抑制剂)组、BAY 11-7082(NF-κB抑制剂)组和BX795+BAY11-7082(混合抑制剂)组。BX795组、BAY 11-7082组、BX795+BAY 11-7082组分别用0.5μmol BX795、5μmol BAY11-7082、0.5μmol BX795+5μmol BAY 11-7082预先处理1 h,然后感染PCV2。于感染后3、12、24、48和72 h收集细胞,提取RNA。用荧光定量PCR检测IFN-β、模式识别受体(TLR3、TLR9、RIG-1、MDA-5、DAI)、接头蛋白(TRIF、MyD88、Sting、MAVS、IRF3)的mRNA 含量。【结果】PCV2感染PK-15细胞后,IFN-β的mRNA 含量在48、72 h显著升高(P0.01),表明PCV2感染可以诱导PK-15细胞生成IFN-β;TLR3的mRNA 含量在48 h显著升高(P0.01),TLR9的表达量在48、72 h显著升高(P0.01);TLR3和TLR9下游的接头蛋白MyD88和TRIF的mRNA 含量在48 h显著升高(P0.01),表明PCV2激活了Toll样受体介导的NF-κB信号途径;MDA-5的mRNA 含量在48、72 h显著升高(P0.01),RIG-1的mRNA 含量在72 h显著升高(P0.01),MDA-5和RIG-1下游的接头蛋白MAVS、Sting、IRF3的mRNA 含量在48 h显著升高(P0.01),表明PCV2激活了RIG-1样受体介导的IRF3信号途径;DAI的mRNA 含量在48、72 h显著升高(P0.01),表明PCV2亦激活了DNA模式识别受体介导的IRF3信号途径;分别用BX795和BAY 11-7082抑制IRF3和NF-κB介导的信号通路,结果显示NF-κB抑制剂组的IFN-β的mRNA 含量与PCV2组相比无显著性差异(P0.05),TBK1/IKKε抑制剂组的IFN-β的mRNA 含量与PCV2组相比明显下降(P0.05),表明PCV2诱导IFN-β的产生主要由IRF3信号途径调控。【结论】PCV2感染可以诱导PK-15细胞中IFN-β表达量的上调,其上调主要与IRF3信号通路有关。     

PCV2感染对仔猪肝脏MyD88-NF-κB信号途径的影响

选取31头经检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原和抗体均为阴性的5周龄断奶仔猪,随机分为对照组16头和试验组15头,对照组仔猪每头滴鼻4 mL PBS,试验组仔猪每头滴鼻4 mL 5×105TCID50.mL-1PCV2悬液。于PCV2接种当天剖杀4头仔猪作为对照组,分别于14、21和35 d剖杀4头对照组和5头试验组仔猪,采集肝脏。用激光共聚焦显微镜检测核因子κB/P65(NF-κB/P65)蛋白的核易位变化;蛋白提取法分别提取肝脏细胞核蛋白和胞浆蛋白,Western blot定量检测细胞核中NF-κB/P65和细胞浆中p-IκBα、MyD88蛋白含量的变化;电泳迁移率(EMSA)法检测细胞核中NF-κB DNA的结合率变化。检测结果显示,PCV2接种仔猪,肝脏中NF-κB/P65蛋白核易位逐渐增多,到21 d达到峰值;p-IκBα、MyD88、NF-κB/P65 DNA结合率在接种后均先升高后趋于恢复,并于21 d达到高峰。与对照组仔猪相比,肝脏中MyD88和NF-κB/P65蛋白含量以及NF-κB DNA结合率在14和21 d试验组均显著升高(P<0.05),35 d含量变化不显著;21 d时试验组p-IκBα蛋白含量显著升高。相关性分析显示,NF-κB/P65蛋白含量与MyD88含量、NF-κB DNA结合率之间存在显著正相关,相关系数分别是0.566和0.528。结果表明,PCV2可通过激活MyD88启动NF-κB信号途径;通过IκBα的磷酸化降解激活NF-κB,并促进其进行核易位,使NF-κB与DNA发生结合,调控相关炎性细胞因子的转录和表达。     

枇杷叶提取物干预博莱霉素诱导肺纤维化大鼠MH-S细胞炎症反应及机制研究

本研究为探索枇杷叶提取物(EBJE)对肺纤维化(PF)大鼠巨噬细胞丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)/核转录因子(NF-κB)信号通路和炎症损伤的调控作用。取Wistar大鼠120只,分为生理盐水(NS)组、模型(BLM)组、阳性对照组、EBJE高、中、低剂量组,每组20只。采用气管内一次性输注博来霉素(BLM,5 mg/kg)制备肺纤维化模型,造模成功后开始给药,1次/d,28 d后取材,分离肺泡巨噬(MH-S)细胞,Masson染色法检测各组肺纤维化病理进程;ELISA和RT-PCR检测各组肺泡巨噬细胞NF-κB、IL-17、TNF-α蛋白及mRNA表达情况;Western Blot检测MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白p-p38 MAPK,p-38 MAPK,p-ERK1/2,ERK1/2表达情况;Person检验肺巨噬细胞MAPK蛋白表达水平。结果显示,与NS组相比,BLM组肺纤维化明显,肺部炎症细胞浸润比例增加,提示造模成功。与BLM组相比,EBJE高、中、低剂量组大鼠肺纤维化明显改善,炎症因子NF-κB、IL-17、TNF-α表达量降低,MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白p...     

破骨细胞的形成和活化

破骨细胞(Osteoclast,OC)是一种高度分化的多核巨细胞。其形成和活化受RANKL/RANK/OPG和TNFα/IL-1两种机制的调控。1,25-(OH)2-D3作用于成骨细胞(Osteoblast,OB)表面受体,促进核因子κB受体活化子配体(Receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)表达,从而刺激OC的生成和活化。而骨保护素(Osteoprote-gerin,OPG)通过与OC表面核因子κB受体活化子(Receptor activator of NF-κB,RANK)竞争性地结合RANKL,阻断RANKL介导的OC分化和骨吸收,从而对调控和维持骨骼正常代谢发挥作用。此外,中、高浓度的钙、磷对OC的生成和活化也具有抑制作用。     

MTB感染对小鼠肺脏上皮细胞NF-κB和p53信号通路的调控

【目的】探讨在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染小鼠早期,其肺脏上皮细胞中NF-κB和p53信号通路参与机体的免疫调控作用。【方法】将C57BL/6 Cnc小鼠30只(雄、雌各15只),按5只/组设空白对照组、阴性对照组(腹腔注射生理盐水)和MTB感染组(腹腔注射牛结核分枝杆菌减毒株(卡介苗,BCG)),感染4 d后经安乐死处死小鼠,摘取小鼠肺脏和脾脏进行形态学观察;将小鼠肺脏进行冰冻超薄切片,HE染色分析其肺脏病理变化;利用免疫组织荧光技术和激光共聚焦显微镜,标记SP-C阳性肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)的位置,观察NF-κB和p53蛋白在肺泡上皮细胞中的表达情况。提取小鼠肺脏组织细胞总蛋白,以β-actin为内参,通过Western blot分析NF-κB和p53信号通路相关因子TLR4、TRAF6、NF-κB、p53、MDM2和CBP在蛋白水平上的变化。【结果】在MTB感染小鼠4 d后,小鼠肺脏形态无明显变化,脾脏1/3尖部瘀血变黑;HE染色发现肺脏组织炎性细胞浸润。在小鼠肺脏上皮细胞中NF-κB与p53蛋白免疫荧光表达较空白对照组和阴性对照组增强。TLR4、NF-κB、p53、MDM2和CBP蛋白在雄性与雌性小鼠中都呈现出显著上调。【结论】当结核分枝杆菌感染小鼠时,小鼠肺脏上皮细胞通过NF-κB和p53信号通路活化来参与宿主抗结核分枝杆菌病感染的免疫调控作用。     

Wip1正调控TLR4信号介导Ⅰ型干扰素的表达

Wip1是由基因ppm1d编码的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,不仅在细胞应激反应、增殖分化中起重要作用,还参与调控炎症反应和肿瘤发生等过程。Wip1能抑制TNF-α诱导的NF-κB激活,而NF-κB又是TLR4信号通路中的重要组分,因此推测Wip1在LPS诱导的TLR4信号通路中可能起调控作用。Western印记结果显示,在Wip1基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs,Mouse embryonic fibroblasts)中,TLR4信号诱导的IRF3磷酸化程度显著降低。与此相一致,实时荧光定量PCR实验揭示,受LPS刺激后,Wip1基因敲除的MEFs比野生型细胞产生更少的I型干扰素IFN-β和干扰素诱导基因(Interferon-stimulated genes,ISGs),如Mx1,Mx2和Rasd2。将野生型和磷酸酶失活的Wip1分别回补进Wip1缺失的MEFs,构建了野生型和突变体Wip1回补的细胞系进一步验证该结果。通过实时荧光定量PCR研究,发现野生型和磷酸酶失活的Wip1均能促进LPS诱导的ISGs的表达,Wip1不依赖于其磷酸酶活性来促进TLR4介导的I型干扰素反应。研究首次发现Wip1能通过增强IRF3的磷酸化来促进I型干扰素的表达,揭示了机体抵御病毒感染的新机制。