盐胁迫下小麦耐盐突变体后代差异cDNA的分离和鉴定

 采用cDNA AFLP(cDNA amplifiedfragmentlengthpolymorphism)技术分析了遗传背景相近的小麦后代突变体中 ,耐盐性较强的RH870 6 4 9(saltresistant,SR)和盐敏感的H870 6 34(saltsensitive ,SS)在盐胁迫和非胁迫情况下基因表达的差异。结果表明 ,其中 88.1%的条带在 4个样品中是一致的 ,只有 11.9%的条带在 4个样品中表现出差异。选取其中的 6 8个差异条带进行克隆 ,测序 35个 ,经Internet进行Blast比较 ,发现 11个片段 (31.4 % )与已知基因具有较高的同源性 ,主要涉及与离子转运有关的蛋白、与信号转导有关的蛋白以及与氧化胁迫有关的蛋白 ;另外2 4个片段 (6 8.6 % )与已知基因同源性较低或未发现同源性 ,可能是一些未知基因。     

小麦PLT2基因的克隆及功能分析

盐胁迫是影响小麦产量的主要原因之一,通过筛选耐盐新基因培育耐盐新品种对保障我国粮食安全具有重要意义。本研究从青麦6号盐胁迫转录组中挖掘到TaPLT2基因,对其进行生物信息学分析,并以黄淮麦区72个冬小麦品系为材料,研究TaPLT2基因多态性与耐盐性的关系,挖掘优异等位变异,为耐盐分子育种储备基因资源。结果表明,TaPLT2基因cDNA全长1 385 bp,位于2AS染色体,其编码蛋白为疏水蛋白,定位于细胞质,包含7个跨膜区域和MFS_STP保守结构域,属于MFS家族的糖转运子亚族。TaPLT2基因受盐胁迫诱导上调表达,处理24 h后达到最高,继续进行盐胁迫处理,表达量基本保持不变。基因多态性分析结果表明,TaPLT2在1 326位即第3个外显子处存在T/C变异,72个小麦品系中变异率为9.46%。相关性分析表明,盐处理后C变异与根长呈负相关,与可溶性糖呈正相关且相关性最高,与耐盐性隶属函数加权平均值呈正相关,说明该SNP与TaPLT2基因的耐盐能力相关。本研究为小麦耐盐育种储备了基因资源。     

黑麦热激蛋白ScHsp90-1基因的克隆及表达分析

本研究从黑麦中克隆了一个热激蛋白Hsp90基因,暂命名为ScHsp90-1,并对其序列进行分析。结果显示,该基因cDNA序列全长2 103 bp,共计编码700个氨基酸,蛋白质分子量约80.47 k D。序列同源性分析表明,ScHsp90-1与小麦、玉米、水稻等物种的热激蛋白同源性较高;进化树分析表明ScHsp90-1与小麦的Ta Hsp90亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR技术对其表达特性分析表明,ScHsp90-1对高温、低温、高盐、干旱等非生物胁迫均有响应,其可能是黑麦的一个胁迫相关基因。     

干旱与NaHCO3胁迫下柽柳基因表达的比较

用cDNA微阵列技术比较了NaHCO3及干旱胁迫下柽柳基因的表达异同。柽柳分别采用0.4mol/L的NaHCO3和干旱处理约30h后取材,分离总RNA,选用Cy3和Cy5进行标记,并与载有柽柳基因的cDNA微阵列杂交,比较了柽柳干旱胁迫的基因表达谱和NaHCO3胁迫的基因表达谱。结果显示,2种胁迫下,有14条基因共同下调表达,31条基因共同上调表达,说明柽柳的抗旱耐盐性状相似性较高。有1个基因在干旱胁迫下为上调表达,在NaHCO3胁迫下为下调表达。同时,和Lea蛋白、脱水诱导蛋白RD22同源的基因在干旱胁迫下表达量升高明显,但NaHCO3胁迫表达量上升不明显;NaHCO3胁迫使与SMDC基因和水通道蛋白同源的基因表达量明显上升,而干旱胁迫其表达量无明显升高,提示了柽柳的抗旱、耐盐性状也存在明显的差异。     

小麦逆境胁迫相关基因Ta14S的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗逆机制,为小麦抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】基于cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列,运用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并利用实时荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同胁迫处理条件下的表达模式。【结果】通过RACE扩增获得小麦cDNA全长序列（GenBank登录号：JN650603）,命名为Ta14S。该基因序列全长为1 056 bp,其中,5′端非编码区11 bp,3′端非编码区253 bp,开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。序列比对发现其蛋白质序列包含1个蛋白激酶C的底物结构域、1个类膜蛋白结合域、1个转录因子结合域和1个核输出信号结合域,具有植物14-3-3蛋白的结构特征;运用实时荧光定量PCR进行Ta14S表达分析,该基因在小麦苗期根中表达量最高,在PEG和低温胁迫的任何时间点均稳定上调表达,在ABA和高温胁迫的6 h内其相对表达量均显著高于对照,推测Ta14S可能参与小麦ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦Ta14S的全长cDNA序列,其编码蛋白包含与蛋白质互作的典型功能域;通过对Ta14S在干旱、高温、低温、ABA胁迫过程中的表达特性分析表明,Ta14S在小麦逆境胁迫中发挥着重要的调控功能。     

小麦水通道蛋白基因 TaTIP1-1c-4BL的克隆与表达分析

为探究 TaTIP1-1c-4BL基因在小麦响应缺水胁迫中的作用，采用PCR扩增的方法从小麦‘科农199’cDNA中获得 TaTIP1-1c-4BL基因。生物信息学分析显示该基因编码区全长753 bp，共编码250个氨基酸。TaTIP1-1c-4BL蛋白具有6个跨膜域，为非分泌型、弱酸性、稳定型、疏水性蛋白。系统发育分析显示‘科农199’与来自粗山羊草和大麦的水通道蛋白亲缘关系较近。表达分析显示 TaTIP1-1c-4BL基因在小麦根、茎、叶、籽粒及颖壳中均有表达，在茎中表达量最高。在PEG胁迫下，该基因的表达量下调，表明该基因在小麦应对干旱胁迫过程中具有负调控作用。在NaCl、ABA及H₂O₂胁迫下，表达量先下调后上调，推测该基因参与了某些抗逆信号的传导。     

抗旱性不同的小麦扩展蛋白活性及基因表达分析

以5个抗旱性不同的小麦品种为试验材料,分析了干旱胁迫下小麦扩展蛋白活性与其抗旱性之间的相关性,同时检测了6个不同的扩展蛋白基因在干旱胁迫下的表达情况。结果表明,扩展蛋白活性与小麦抗旱性之间的相关性达98.7%,且基因Ta EXPA3的表达受干旱胁迫调节,与小麦抗旱性密切相关。     

小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的克隆及其对非生物胁迫的响应

【目的】分析小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的特征及其对非生物胁迫的响应,并探讨其在小麦抗逆调控过程中的生物学功能。【方法】利用RACE技术克隆了该基因cDNA全长,采用生物信息学方法分析克隆基因编码蛋白的特性,并通过半定量RT-PCR分析该基因在非生物胁迫条件下的表达特性。【结果】TaPM19-1的cDNA全长1 090 bp,无内含子,编码蛋白包含182个氨基酸,分子量为19.02 kD,包含有典型的AWPM19保守域;依据氨基酸序列将来源于不同植物的16个AWPM19类蛋白分为3组,TaPM19-1与2个来源于大麦及1个二穗短柄草的AWPM19类蛋白亲源关系最近,同属于第三组。高级结构分析显示,TaPM19-1可形成4个由α-螺旋组成的跨膜域,N端位于膜内,包含由27个氨基酸组成的信号肽,C端近40个氨基酸位于膜内。表达分析显示,TaPM19-1除在发育后期的种子中有较高水平表达外,其它组织中未检测到表达;在所检测的2个小麦品种根系中,TaPM19-1的表达受ABA诱导,但在叶片中的表达量极低;水分胁迫条件下,该基因在根系和叶片中均呈现较强的诱导表达特性;在高盐和高温胁迫条件下,该基因在洛旱2号小麦中均可诱导表达,而在中国春小麦中未检测到该基因表达;在低温胁迫条件下,未检测到TaPM19-1的表达。【结论】获得了小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的cDNA全长,其编码蛋白可形成典型的跨膜结构特征;该基因受植物激素ABA的诱导,在洛旱2号中也可被干旱、高盐和高温胁迫诱导,但在中国春中对高盐和高温胁迫无响应。推测TaPM19-1在洛旱2号和中国春中存在不同的转录调控机制。     

小麦TaTVP1基因的克隆与表达分析

[目的]发掘并研究小麦TaTVP1基因响应耐盐、耐旱等非生物胁迫的功能与机制，为小麦抗逆育种提供新的基因资源。[方法]利用PCR技术克隆小麦TVP1基因，扩增获得cDNA全长序列，并对其进行生物信息学分析，进一步利用qRT-PCR技术分析其表达模式。[结果]小麦TVP1基因全长2 289 bp,编码762个氨基酸；其氨基酸序列具有12个跨膜结构，该结构中疏水氨基酸具有高度保守性，且肽链N末端与C末端均位于膜外，预测该跨膜结构可形成具有明显孔道的高级3D结构蛋白，推测与其具有的H⁺离子泵通道功能密切相关；系统发育树分析表明，TaTVP1蛋白与单子叶植物TVP1蛋白的同源性较高，该类蛋白在进化过程中单子叶和双子叶植物可形成2个明显的类群Ⅰ和Ⅱ;定量PCR分析表明，小麦中TVP1基因在根、茎中的表达量要明显高于叶、穗中，具有组织特异性，且不同材料间同一组织中该基因的表达趋势也存在差异，这可能与不同材料间的耐旱等抗逆性存在差异有关。[结论]克隆并分析了小麦TaTVP1基因，为进一步阐明该基因参与抵御非生物胁迫的机理奠定一定的研究基础。     

甘蓝型油菜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因BnNHX2的电子克隆与序列分析

盐胁迫是造成油菜产量下降的重要环境因子之一。Na^＋／H^＋逆向转运蛋白（Na^＋／H^＋ antiporter，NHX）基因是目前世界植物耐盐性研究领域中最热门的基因，油菜NHX基因的克隆对提高油菜耐盐性的转基因育种意义重大。本研究利用电子克隆的方法，获得1个新的甘蓝型油菜NHX基因BnNHX2的全长cDNA，含有一个长为1629bp的开放阅读框架，编码542个氨基酸，分子质量约59．9ku。生物信息学分析表明，BnNHX2蛋白属于跨膜蛋白，有12个跨膜区，是植物NHX超家族中的一员。通过同源比对和进化分析发现，BnNHX2基因与盐生植物盐芥ThNHXI基因高度同源，表明BnNHX2可能是油菜抵御盐胁迫的关键基因。     

小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的cDNA-AFLP分析

 【目的】分析经叶锈菌诱导小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的基因表达情况,寻找与抗病基因表达相关的片段。【方法】应用cDNA-AFLP技术从mRNA表达水平研究TcLr38和感病对照Thatcher与小麦叶锈菌05-22-65（THTS）互作时基因表达的差异。【结果】76对引物组合检测到约3 800条条带,平均每一对选择性引物可以获得50条条带,其中28对能够在小麦近等基因系TcLr38和感病对照Thatcher之间扩增出特异性条带。多态性条带划分为8种类型,其中3种类型可能与抗病基因相关。最终得到95条小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的特异性表达的转录衍生片段（TDF）,其中19条差异TDFs只在接种叶锈菌的TcLr38中出现,为上调表达,而8条差异TDFs为下调表达。对可能与抗病相关的特异TDFs中的21条片段进行序列测定与分析,经BLASTx比较,17个TDFs所推导的蛋白质序列在数据库中找到其所对应的同源序列,15个TDFs为已知功能的基因。【结论】通过对功能已知的基因分析,推测决定蛋白激酶C、ATP结合蛋白、类受体激酶、信号传导组氨酸激酶（HPK）、肽酶家族M23、Dnak抑制蛋白DksA、甲硫氨酸tRNA合成酶、RanGTP酶激活蛋白1、烯酰辅酶A水合酶的TDFs可能与抗病或防御过程相关。     

明尼2761抗秆锈病相关基因的cDNA-AFLP分析

【目的】分析中国重要辅助鉴别寄主明尼2761经小麦秆锈菌诱导后的基因表达谱,寻找与其抗病基因表达相关的片段。【方法】运用cDNA-AFLP技术研究明尼2761和感病对照Thatcher分别接种小麦秆锈菌后的基因表达差异,对与明尼2761抗病相关的特异表达片段进行分析。【结果】140对AFLP引物组合能够检测到约7 000多条差异表达转录衍生片段（TDF）,平均每一对引物可以获得50条条带,其中有86对引物能够在明尼2761和Thatcher之间扩增出差异条带。对可能与抗病相关的35条特异TDF进行克隆测序,经BLASTx比对,30条TDF在数据库中能够找到同源序列,其中24条TDF功能已知,6条TDF功能尚未明确。【结论】8条与编码激酶结合蛋白、NBS-LRR抗病蛋白、类肉桂酰-CoA还原酶2b、类肉桂酰辅酶A还原酶2c、蔗糖磷酸合成酶7、类蛋白酶metacaspase 1、类锌指蛋白、假定的类RGA4抗病蛋白基因有较高同源性的TDF应与明尼2761的抗秆锈性相关。     

利用基因芯片研究小麦耐盐突变体盐胁迫条件下基因的表达图谱

 【目的】研究小麦在不同盐胁迫时间下根部基因的应答反应。【方法】利用基因芯片技术，分析盐胁迫下耐盐小麦RH8706－49的小麦根部基因的表达情况。【结果】获得了61 215个小麦基因的差异表达图谱。在不同盐胁迫时间下大量根部基因的表达发生很大变化，即有盐诱导表达的基因，也有盐抑制表达的基因，同时对杂交数据进行多种聚类分析，并对基因表达差异的原因进行了初步分析。【结论】小麦耐盐机理非常复杂，是大量基因协调表达的结果，其中盐诱导表达基因的作用非常重要。     

盐胁迫下拟南芥SCAMP基因克隆和表达的生物信息学分析

为探究分泌载体膜蛋白（Secretory carrier membrane protein, SCAMP）的功能，采用PCR方法从模式植物拟南芥中克隆到5个SCAMP基因，进行生物信息学分析，并通过实时荧光定量PCR技术分析5个SCAMP基因在盐胁迫下的表达模式。结果显示，拟南芥SCAMP蛋白的相对分子量为30.1~33.2 kDa，等电点为6.60~9.18，属于不稳定性疏水蛋白，二级蛋白结构中主要包含4种构象:α–螺旋（Alpha helix， Hh）、无规则卷曲（Randon coil， Cc）、直链延伸（Extended strand，Ee）和β–折叠（Beta turn，Tt），其中以α–螺旋为主，包含4个跨膜结构域，N端和C端均在细胞膜内。实时荧光定量PCR结果表明，AtSCAMPs的表达量均受盐胁迫诱导上调表达，AtSCAMP1，AtSCAMP3，AtSCAMP4，AtSCAMP5基因在叶中的表达明显高于根，且AtSCAMP4和AtSCAMP5在叶中受盐胁迫变化最明显。     

Genome-wide identification and transcriptome profiling reveal great expansion of SWEET gene family and their wide-spread responses to abiotic stress in wheat(Triticum aestivum L.)

The Sugars Will Eventually be Exported Transporter(SWEET) gene family, identified as sugar transporters, has been demonstrated to play key roles in phloem loading, grain filling, pollen nutrition, and plant-pathogen interactions. To date, the study of SWEET genes in response to abiotic stress is very limited. In this study, we performed a genome-wide identification of the SWEET gene family in wheat and examined their expression profiles under mutiple abiotic stresses. We identified a total of 105 wheat SWEET genes, and phylogenic analysis revealed that they fall into five clades, with clade V specific to wheat and its closely related species. Of the 105 wheat SWEET genes, 59% exhibited significant expression changes after stress treatments, including drought, heat, heat combined with drought, and salt stresses, and more up-regulated genes were found in response to drought and salt stresses. Further hierarchical clustering analysis revealed that SWEET genes exhibited differential expression patterns in response to different stress treatments or in different wheat cultivars. Moreover, different phylogenetic clades also showed distinct response to abiotic stress treatments. Finally, we found that homoeologous SWEET genes from different wheat subgenomes exhibited differential expression patterns in response to different abiotic stress treatments. The genome-wide analysis revealed the great expansion of SWEET gene family in wheat and their wide participation in abiotic stress response. The expression partitioning of SWEET homoeologs under abiotic stress conditions may confer greater flexibility for hexaploid wheat to adapt to ever changing environments.     

苹果砧木珠眉海棠盐胁迫应答基因的微列阵研究

以盐胁迫下苹果的耐盐砧木珠眉海棠为材料,用SMARTTM方法构建了cDNA文库。随机挑取5 000个cDNA克隆制备芯片,得到差异表达的基因388个,其中249个表达上调、139个表达下调。分析其中变化量在8倍以上的42个基因,并对部分基因进行RT-PCR验证,结果与芯片杂交结果一致。根据功能把这些基因分为5类:光合作用相关基因、物质转运相关基因、基础代谢相关基因、逆境相关基因以及其他基因。其中直接参与盐应答的基因占34%,包括上游调控蛋白、合成植体内小分子渗透调节物的限速酶、胁迫产生的活性氧清除剂、直接调节离子运输和储存的蛋白等。用此cDNA微列阵体系,将基因芯片技术与cDNA文库相结合,成为全面研究盐胁迫下基因表达的有效途径。为进一步研究盐应答基因功能及盐胁迫机制提供参考。