奶山羊LXRα基因shRNA序列的筛选及腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】构建针对奶山羊肝脏X受体α(Liver X receptorα,LXRα)基因的干扰腺病毒载体。【方法】根据奶山羊LXRα基因CDS区域设计小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA),分别构建pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA及pDsRed1/C1-LXRα载体,共转染HEK 293细胞,48h后观察其荧光蛋白表达量,筛选出具有明显干扰效应的shRNA。将具有明显干扰效应的shRNA载体与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST在LR ClonaseTMⅡ重组酶的作用下进行重组,经氨苄青霉素及氯霉素抗性筛选后获得重组腺病毒载体。将构建好的重组腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化并回收后,转染HEK 293细胞,培养7～10d后收集细胞并反复冻融,收集细胞裂解液,反复扩增3次后,获得高滴度的重组腺病毒,测定其病毒滴度。【结果】①设计出了shRNA-490、shRNA-496、shRNA-509和shRNA-923 4条shRNA序列;②得到shRNA-490和shRNA-923 2条具有明显干扰效应的shRNA;③获得pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA-490和pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA-923 2个重组腺病毒载体,ScaⅠ酶切及测序结果均正确,2个腺病毒重组载体滴度均为5×108 PFU/mL。【结论】奶山羊LXRα基因重组shRNA腺病毒载体构建成功,为利用RNA干扰技术研究LXRα基因在乳腺上皮细胞中的功能奠定了基础。     

西农萨能羊BTN基因RNA干扰序列的筛选及重组腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】构建西农萨能羊BTN基因RNA干扰的重组腺病毒载体,为研究BTN基因的功能和作用机制奠定基础。【方法】设计并合成3对针对BTN不同位点的shRNA编码序列,克隆到pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体中,并与已构建好的表达BTN的pDsRed1-C1-BTN载体共转染HEK293细胞,筛选有效的干扰序列。通过与腺病毒骨架质粒重组,制备表达干扰BTN基因的shRNA的腺病毒,经PacⅠ线性化后,在HEK293细胞中包装并扩增病毒,用TCID50法进行病毒滴度测定,获得高滴度的病毒上清液。【结果】成功构建了西农萨能羊BTN基因的RNAi腺病毒表达载体,腺病毒经包装和扩增后,病毒滴度可达到5×109PFU/mL。【结论】获得了有功能的pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA病毒重组子。     

过表达及RNA干扰糖尿病相关锚定重复序列蛋白基因腺病毒的制备及鉴定

目的 构建含糖尿病相关锚定重复序列蛋白(DARP)基因的重组腺病毒过表达及RNA干扰载体.方法 应用PCR技术扩增大鼠DARP基因序列,设计并合成shRNA序列,分别插入表达载体GV-314和GV-119,经基因测序鉴定.用重组DARP过表达和shRNA表达穿梭载体与辅助包装质粒pBHGloxAE 1共转染人胚肾细胞HEK293,进行病毒包装、出毒和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度.用重组腺病毒感染大鼠H9c2细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度,Western Blot检测DARP蛋白表达.结果 基因测序显示DARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符,转染HEK293细胞包装成功.DARP过表达和shRNA腺病毒明显影响H9c2细胞中DARP蛋白表达水平.结论 成功构建了大鼠DARP过表达及特异性shRNA腺病毒表达载体.     

过表达及干扰人APE1重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建含过表达及干扰人APE1的重组腺病毒.方法 应用PCR技术扩增人APE1基因序列,设计并合成shRNA序列,分别插入pDC315-EGFP和pDC316-EGFP-U6表达载体,经基因测序鉴定.用重组APE1过表达和shRNA表达穿梭载体与辅助包装质粒pBHGdeltaE11ox3Cre共转染人胚肾细胞HEK293A,进行病毒包装、出毒和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度.用重组腺病毒感染人AC16心肌细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度,Western blot检测APE1蛋白表达.结果 基因测序显示APE1过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符,转染HEK293A细胞包装成功.APE1过表达和shRNA腺病毒明显影响人AC16心肌细胞中APE1蛋白表达水平.结论 成功构建了人APE1过表达及特异性shRNA腺病毒表达载体.     

秦川牛Gli2基因重组干扰腺病毒的构建

【目的】构建秦川牛醇溶蛋白2(Gli2)基因的重组干扰腺病毒,为研究Hh信号通路在秦川牛脂肪形成过程中的功能奠定基础。【方法】构建3条短发卡RNA(shRNA):shRNA-LY1、shRNA-LY2、shRNA-LY3,利用双荧光素酶报告系统检测其干扰效率。再用干扰效率较高的shRNA-LY3构建腺病毒干扰载体pAD/PL-DEST/CMV-GFP/U6-LY3,转染HEK 293A细胞进行腺病毒的包装并扩繁以提高病毒滴度。利用LaSRT法测定腺病毒的滴度,并将得到的病毒以不同剂量侵染秦川牛脂肪细胞,确定其最佳感染复数(MOI)。【结果】筛选得到shRNA-LY3干扰效率最高,达到85%;成功构建了秦川牛Gli2基因腺病毒干扰载体pAD/PL-DEST/CMV-GFP/U6-LY3,包装后获得了重组干扰腺病毒Ad-shRNA-LY3;LaSRT法测得其滴度为1×10~9 PFU/mL。腺病毒对秦川牛脂肪细胞的最佳MOI为50。【结论】成功构建了秦川牛Gli2基因腺病毒干扰载体,包装后获得了高滴度的重组干扰腺病毒Ad-shRNA-LY3,其对秦川牛脂肪细胞的最佳MOI为50。     

秦川牛ADIG基因重组腺病毒过表达载体的构建与病毒包装

【目的】构建秦川牛ADIG基因的重组腺病毒载体,包装并扩繁病毒,为下一步研究该基因在脂肪细胞分化过程中的分子作用机制和相关信号通路奠定基础。【方法】根据NCBI收录的家牛ADIG基因(NM_001113720.1)mRNA序列设计引物,以秦川牛组织样提取的总RNA反转录而成的cDNA为模板,通过RT-PCR和PCR扩增获得目的基因,将其连接到pMD19-T Simple载体并测序。质粒提取纯化后通过BglⅡ与SalⅠ双酶切,然后胶回收酶切产物,将其连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack/CMV-ADIG。将pAdTrack/CMV-ADIG质粒用PmeⅠ酶切线性化,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAD-ADIG,并用PacⅠ酶切鉴定,提取质粒后转化大肠杆菌Top10进行扩繁。用PacⅠ酶切线性化pAD-ADIG载体并回收质粒大片段,转染293A细胞进行病毒包装,然后完成病毒扩繁和病毒滴度的测定。【结果】PCR扩增获得了399bp ADIG基因CDS区;成功构建了重组穿梭质粒pAdTrack/CMVADIG和重组腺病毒质粒pAD-ADIG。经检测,ADIG重组腺病毒包装成功,扩繁后得到了高滴度的腺病毒(1×108PFU/mL)。【结论】成功构建了秦川牛ADIG基因的重组腺病毒表达载体pAD-ADIG,完成了病毒包装和扩繁。     

牛SREBP1基因shRNA序列的筛选及其腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】筛选可靶向干扰牛的SREBP1基因的有效shRNA,构建相应腺病毒载体并包装重组腺病毒,为在细胞水平上研究SREBP1基因的功能和作用机制提供基础。【方法】以秦川牛SREBP1基因为研究对象,首先靶向其编码区（coding sequence,CDS）序列设计并合成6条干扰和1条阴性对照shRNA,并构建表达载体pENTR-U6-shRNA。然后与载体psiCHECK-Ⅱ-SREBP1共转染293A细胞,筛选有效的pENTR-U6-shRNA。其次将筛选的pENTR-U6-shRNA和阴性对照pENTR-U6-NC分别与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST体外重组,得到腺病毒重组载体,并在293A细胞包装扩繁得到高滴度腺病毒,GFP标记法测定病毒滴度。最后将病毒侵染牛前体脂肪细胞,实时荧光定量法（qRT-PCR）检测干扰效率。【结果】筛选出靶向牛SREBP1基因干扰效率为87.4%的shRNA-1053。构建了pAd-1053和阴性对照pAd-NC重组腺病毒载体并包装得到Ad-1053和Ad-NC高滴度病毒,测定得到的病毒滴度分别为7×108 GFU•mL-1和9×108 GFU•mL-1。Ad-1053和Ad-NC分别侵染牛前体脂肪细胞,qRT-PCR检测结果显示Ad-1053可显著降低SREBP1基因的mRNA 水平（干扰率＞85%）,而Ad-NC对SREBP1基因表达无明显影响。【结论】成功筛选得到靶向干扰牛SREBP1基因的有效shRNA,并包装扩繁获得相应的高滴度重组病毒。     

利用CRISPR/Cas9技术敲除RNA甲基化酶TRDMT1基因及其功能初探

为构建TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系,利用CRISPR/Cas9系统在TRDMT1基因第1个外显子前插入BGH Ploy(A)转录终止序列,终止TRDMT1基因表达。利用重叠PCR方法合成sgRNA序列,构建TRDMT1-gRNA载体及含不同抗生素基因的同源重组载体TRDMT1-LOXN-Puro和TRDMT1-LOXP-Neo;将同源重组载体TRDMT1-LOXN-Puro、TRDMT1-LOXP-Neo及TRDMT1-gRNA、Cas9表达载体MLM3613共转染HEK293细胞;利用Puromycin和Neomycin抗生素筛选细胞,通过RT-qPCR检测TRDMT1基因转录终止效率。通过细胞生长曲线和划痕试验检测TRDMT1基因敲除对HEK293细胞增殖和迁移能力的影响。结果表明:成功构建了TRDMT1-gRNA载体及TRDMT1-LOXN-Puro、TRDMT1-LOXP-Neo同源重组载体;与正常HEK293细胞相比,试验组TRDMT1表达量仅为1%;TRDMT1基因敲除后显著影响HEK293细胞增殖和迁移。这一研究通过CRISPR/Cas9技术成功构建了TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系(HEK293-TKO),为RNA甲基化研究提供了一种有效的工具;TRDMT1基因可能与细胞的增殖和迁移有关。     

miR-505慢病毒表达载体的构建

目的:构建携带增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和miR-505基因的慢病毒载体。方法:采用PCR方法从pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-505表达载体质粒扩增出miR-505 shRNA基因编码区173bp、175、171bp片段,通过限制性酶切、T4DNA连接酶连接,分别将miR-505 shRNA基因插入慢病毒表达载体FUGW与L26Fsy(1.1)GW中,构建成重组载体FUGW-miR-505-3p/5p/nc与Fsy-miR-505-3p/5p/nc。脂质体介导下将慢病毒重组载体转染至HEK 293T细胞,通过EGFP观察转染效率,RT-PCR方法检测miR-505的表达量。结果:荧光显微镜下观测到HEK 293T细胞转染后有较强绿色荧光;RT-PCR显示转染FUGW-miR-505-3p/5p与Fsy-miR-505-3p/5p的HEK 293T细胞中对应miR-505-3p/5p明显升高。结论:成功构建带有EGFP和miR-505-3p/5p/nc shRNA基因的慢病毒表达载体。     

7个shRNA分子对绵羊BMPR-1B基因的干扰作用分析

为获得有效干扰绵羊BMPR-1B基因的shRNA干扰分子,从绵羊卵巢组织中扩增了1 515 bp BMPR-1B基因全长编码区cDNA序列,添加HA标签序列后,插入Plex-mcs慢病毒质粒,构建Plex-BMPR-1B慢病毒表达载体,转染HEK293细胞,并与2个包装质粒共转染293T细胞进行病毒包装,用获得的重组慢病毒感染HEK293细胞;同时,将7个干扰分子与Pll-LentiLox 3.7载体重组,并与3个包装质粒共转染293T细胞进行病毒包装,获得干扰分子的重组病毒颗粒。最后用干扰分子重组的病毒颗粒感染整合Plex-BMPR-1B的HEK293细胞,进行qRT-PCR和Western blot检测。结果显示:重组BMPR-1B蛋白质在稳定整合Plex-BMPR-1B的HEK293细胞系中获得了表达;研究中设计的7个shRNA分子能抑制绵羊BMPR-1B基因表达水平68.30%～99.86%,其中PLL-BMPR-1B-1306和PLL-BMPR-1B-1475干扰分子的干扰效果最好。     

禽呼肠孤病毒σNS和σC基因shRNA载体构建及其干扰效果测定

禽呼肠孤病毒σC基因是病毒粘附蛋白,σNS基因具有结合单链RNA活性。根据siRNA靶序列设计原则,设计并合成siRNA模板并克隆到shRNA表达载体pSilencer-CMV 4.1 neo。分别构建了针对σC基因的shRNA载体C1、C2、C3和针对σNS基因的shRNA载体NS1、NS2、NS3。将构建的shRNA载体和阴性对照分别与表达σC和σNS基因的融合蛋白的真核表达载体pEGFP-σC及pEGFP-σNS共转染DF-1细胞。荧光显微镜观察结果表明,6个shRNA片段不同程度地抑制各自融合蛋白的表达。Real-time PCR检测结果表明,C3和NS1体外干扰病毒复制的效果最佳。     

两种方法研究不同茎部长度串联shRNA表达载体对EGFP基因的干扰效应

目的:旨在观察不同茎部长度串联shRNA表达载体对EGFP基因的干扰作用。方法:采用体外培养的Vero细胞,选用不同茎部长度串联shRNA表达载体+EGFP表达载体+脂质体转染的方法,将构建好的干扰载体转染Vero细胞,然后使用实时荧光定量RT-PCR对其沉默效应进行定量分析。在小鼠腿部肌肉注射干扰质粒,实时荧光定量RT-PCR对其沉默效应进行定量分析。结果:转染Vero细胞时,pGenesilR21、pGenesilR27和pGenesilR29荧光表达量仅为对照质粒pEGFP-C1的4.3%、3.0%和6.9%;小鼠腿部肌肉注射干扰质粒时,pGenesilR21、pGenesilR27和pGenesilR29荧光表达量仅为对照质粒pEGFP-C1的2.5%、1.3%和5.1%。结论:在细胞和个体水平,不同茎部串联干扰载体对目的基因的抑制效应均很明显(达到90%以上),比单一位点产生的沉默效应要强许多,不同茎部长度干扰效应彼此间差异不显著。     

西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因启动子的克隆及活性测定

【目的】克隆测定西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因(fatty acid synthase,FAS)启动子的全长序列,进行活性区域分析,为奶山羊FAS基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】根据牛和人脂肪酸合酶基因启动子的同源序列以及西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因5′UTR区域,分别设计上、下游引物,以西农萨能奶山羊全血DNA为模板克隆启动子序列。依据生物信息学分析结果重设引物,将FAS启动子基因分段克隆并连接到荧光素酶表达载体PGL-3,与Psv-β-半乳糖苷酶对照载体共转染293、MCF-7细胞,进行荧光素酶活性检测和β-半乳糖苷酶的活性检测。【结果】FAS基因启动子序列全长2640bp,与牛、人FAS启动子序列同源性90%以上,包括数个潜在SP1、Ets、LSF等转录因子结合位点和CCAAT框、GC框。-1040—-340bp处可能包含启动子活性中心,通过启动子缺失片段试验将活性中心范围缩小至-721—-540bp之间。【结论】通过克隆FAS基因启动子区域,分析表明启动子前端存在负调控元件,找出了启动子最小活性中心。     

cDNA Cloning of Goat DNA Methyltransferase 1,Screening of shRNA Vectors and Influences to Development of Nuclear Transfer Embryos

This study was designed to clone cDNA of goat DNA methyltransferase 1（DNMT1） gene,to screen an effective shRNAproducing vector targeting goat DNA methyltransferase 1 and to improve the developmental competence of goat nuclear transfer embryos by decreasing the DNMT1 expression in donor cells.In this study,PCR primers were designed against regions of high homology between bovine and sheep sequences and then used to amplify the larger portions of the coding regions.Next,3 RNAi oligonucleotides were designed based on the cloned sequences and inserted into pRNAT-U6.1/Neo vector,acquiring 3 new vectors,respectively termed pRNAD1,pRNAD2 and pRNAD3.Then the positive cells were sorted by flow cytometry after transfection and detected by real-time PCR analysis and sodium bisulfite genomic sequencing.Finally,the developmental rates of nuclear transfer（NT） embryos generated using donor cells with and without the effective shRNA vector respectively,as well as in vitro fertilization（IVF） embryos were observed and recorded.The results showed that the coding regions of goat DNA methyltransferase 1 gene was successfully cloned（GenBank no.FJ617538）.Furthermore,an effective interfering shRNA（pRNAD2） was obtained,with its interference effect being 47.88%.Finally,NT embryos with shRNA vector harbored better developmental competence during morula and blastocyst stage compared to controls（P 〈 0.05）,reaching the similar rates to IVF embryos（P 〉 0.05）.In conclusion,goat DNA methyltransferase 1 gene cDNA was cloned and sequenced,an effective shRNA vector responsible for inhibiting DNA methyltransferase 1 expression was developed and the developmental competence of goat nuclear transfer morulae and blastcysts was significantly improved,which provided a feasible pathway for improving goat nuclear transfer embryo development competence by decreasing the methylation level in donor cells through RNAi-mediated manner.     

填饲鹅肝脏组织中脂肪酸沉积与FAS基因mRNA的表达丰度

【目的】研究不同填饲期肥肝鹅肝脏组织中不同脂肪酸沉积与脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase,FAS）基因mRNA的表达丰度及相关性。【方法】对200只100日龄青农灰鹅进行填饲,从填饲0 d起,每隔6 d屠宰1次,共6次。每次随机选取10只,每只为1个重复,屠宰测定肥肝重、肝中脂肪含量、各种脂肪酸含量和FAS基因mRNA的表达丰度。【结果】①肥肝重随填饲时间的延长而增加,肝中粗脂肪含量（ether extract,EE）随肝重的增加而增加,以填饲18—24 d鹅的肥肝增重最快（504.67 g/6 d）,12—18 d的次之。②肝中饱和脂肪酸（saturated fatty acid,SFA）和单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid,MUFA）的含量随着填饲时间的延长而增加,尤其是在12—18和18—24 d这两个阶段的沉积最为明显,而多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid,PUFA）主要是在填饲后期（18—30 d）沉积;在整个填饲过程中,各种脂肪酸的沉积表现为填饲后期显著大于填饲前期（P＜0.05或P＜0.01）;填饲30 d时沉积量较大的脂肪酸为肉豆蔻酸（C14﹕0）、棕榈酸（C16﹕0）、硬脂酸（C18﹕0）、棕榈油酸（C16﹕1）、油酸（C18﹕1）、二十碳烯酸（C20﹕1）和亚油酸（C18﹕2）,每100 g组织中的含量分别为0.6028 、17.72、7.25、2.75、37.42、0.3078和0.43 g。③FAS基因mRNA的表达丰度随肝脏增重和脂肪沉积速度的增加呈现出先增加后迅速降低的趋势,填饲24 d时极显著高于其它时期（P＜0.01）;0—24 d鹅肝脏组织中FAS基因mRNA表达丰度与肥肝重、EE、SFA和MUFA存在极显著正相关（P＜0.01）,而与PUFA存在弱负相关且差异不显著（P＞0.05）,30 d时相关性不显著（P＞0.05）。【结论】①鹅肝中EE、SFA和MUFA的含量随填饲时间和肝重的增加而增加;填饲18—24 d鹅肝脏增重和EE、SFA和MUFA的沉积速度最快;②FAS基因mRNA的表达对肥肝鹅肝脏中脂肪的沉积具有填饲前、中期快速增加,填饲后期下降的调控作用。     

人H1启动子转录shRNA的细胞种属特异性研究

利用siDirect软件预测绿色荧光蛋白(GFP)基因特异性小干扰RNA(siRNA),将人工合成的相应shRNA插入含人H1启动子的pSuper载体,获得表达载体pSuper-shRNA,再将H1-shRNA插入表达GFP基因的peGFP-N1载体,获得表达载体peGFP-H1-shRNA。分别以pSuper-shRNA peGFP-N1和peGFP-H1-shRNA转染COS-1、293-T、鸡胚肝(CEL)和鸡胚成纤维(CEF)细胞,根据相同条件下GFP阳性细胞数及荧光强度变化判断产生的siRNA对GFP基因表达的沉默作用,比较人H1启动子在哺乳动物和禽源细胞中的转录活性。结果表明:人H1启动子在2种哺乳动物细胞中能有效转录shRNA,但在2种禽源细胞中的转录活性很弱,提示在禽源细胞中表达siRNA和进行基因沉默研究应选用禽源启动子。     

Construction and Screening of Bovine Bax Gene shRNA Interference Expression Vector

Bax is a pro-apoptotic member of the Bcl-2 family genes which regulate programmed cell death. To decrease the apoptosis of bovine fibroblast cells, we construsted specific short hairpin （shRNA） expression vector encoding shRNA targeting Bax gene to screen the most effective vector. Four shRNAs sequences based on the sequence of bovine Bax mRNA in the GenBank were designed, and one scrambled shRNA sequence was regarded as negative control. The designed and synthesised single-stranded primer were annealed to double-stranded oligo sequences and cloned into linear pRI-GFP vector digested by enzymes Xho I and Bgl II. Screening positive cloning after transformed into DH5a competent cells and identified by PCR amplification and DNA sequencing. Named the correct vectors as pRI-GFP-Bax-190, pRI-GFP-Bax-206, pRI-GFP-Bax-215, pRI -GFP-Bax-389, pRI-GFP- Bax-NC （the negative control） and seleced them by quantitative PCR after transfected after 24 h and 48 h. The results showed that pRI-GFP-Bax-190 was the highest efficiency （95.47%）, and significant difference （P〈0.01） after 48 h transfection. RNA interference （RNAi） mediated by shRNA expression vector could significantly down-regulate the expression of Bax gene in bovine fibroblast cells, which laid a foundation for further research.     

脂肪酸合成酶(FAS)的SNP与鹅肥肝性能关联研究

脂肪酸合成酶(FAS)是脂肪合成中的关键酶之一,以其为候选基因,采用PCR-SSCP方法对FAS的SNP不同基因型与朗德鹅的肥肝性能进行相关分析.结果表明:朗德鹅的FAS有EE、EF和FF 3种基因型,基因型频率分别为0.380,0.380,0.240,E和F的基因频率分别为0.569,0.431.EF和FF基因型的鹅肥肝重显著高于EE基因型(P＜0.05),EF与FF基因型间差异不显著(P＞0.05).初步研究结果认为,FAS基因可以作为鹅肥肝性状的候选分子遗传标记.