狂犬病毒CVS株G基因和N基因共表达重组腺病毒载体的构建

通过引入内部核糖体进入位点序列,构建狂犬病毒G基因和N基因共表达的腺病毒载体.通过RTPCR方法扩增得到RVG基因、N基因.N基因先亚克隆入pIRES质粒;G基因经Kpn Ⅰ和Mlu Ⅰ,pIRES-N质粒经Mlu Ⅰ、Not Ⅰ双酶切,回收目的基因后与经Kpn Ⅰ和Not Ⅰ双酶切处理的腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒.线性化后的重组腺病毒质粒转染293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒,RT-PCR法检测狂犬病毒精蛋白和核蛋白基因片段.该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR法可检测到糖蛋白和核蛋白基因片段.试验成功构建了G和N双基因共表达重组腺病毒载体,为狂犬病活载体疫苗的研制提供了依据.     

狂犬病毒CVS株G基因和IFN-a基因共表达重组腺病毒载体的构建

通过RT-PCR方法扩增得到狂犬病毒G基因,PCR方法得到IFN-Αa基因并亚克隆入pIRES获得pIRES-a质粒.双酶切G基因和pIRES-a质粒并回收目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒.线性化后的重组腺病毒质粒转染人胚肾293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒.结果表明:该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达,说明成功构建了G和IFN-a双基因共表达重组腺病毒载体.     

减蛋综合征病毒基因组不同酶切图谱的比较研究

分别应用限制性内切酶HindⅢ、Xba Ⅰ、Soc Ⅰ、Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ对EDSV—gDNA进行单酶切以及以Hind Ⅲ为参照，选用适当内切酶进行双酶切，经对酶切图谱比较分析，以确定基因组中各酶切位点数及在Hind Ⅲ片段上的位置。结果表明：HindⅢ、Xba Ⅰ、Soc Ⅰ、Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ的酶切片段分别为9、2、2、5、4、4条，Hind Ⅲ Xba Ⅰ、Hind Ⅲ Kpn Ⅰ、Hind Ⅲ Sac Ⅰ、Hind Ⅲ BamH Ⅰ及Hind Ⅲ XEcoR Ⅰ分别为10、10、11、11和13条，为进一步研究禽类腺病毒的分子生物学特性和构建腺病毒表达载体奠定了良好的基础。     

秦川牛ADIG基因重组腺病毒过表达载体的构建与病毒包装

【目的】构建秦川牛ADIG基因的重组腺病毒载体,包装并扩繁病毒,为下一步研究该基因在脂肪细胞分化过程中的分子作用机制和相关信号通路奠定基础。【方法】根据NCBI收录的家牛ADIG基因(NM_001113720.1)mRNA序列设计引物,以秦川牛组织样提取的总RNA反转录而成的cDNA为模板,通过RT-PCR和PCR扩增获得目的基因,将其连接到pMD19-T Simple载体并测序。质粒提取纯化后通过BglⅡ与SalⅠ双酶切,然后胶回收酶切产物,将其连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack/CMV-ADIG。将pAdTrack/CMV-ADIG质粒用PmeⅠ酶切线性化,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAD-ADIG,并用PacⅠ酶切鉴定,提取质粒后转化大肠杆菌Top10进行扩繁。用PacⅠ酶切线性化pAD-ADIG载体并回收质粒大片段,转染293A细胞进行病毒包装,然后完成病毒扩繁和病毒滴度的测定。【结果】PCR扩增获得了399bp ADIG基因CDS区;成功构建了重组穿梭质粒pAdTrack/CMVADIG和重组腺病毒质粒pAD-ADIG。经检测,ADIG重组腺病毒包装成功,扩繁后得到了高滴度的腺病毒(1×108PFU/mL)。【结论】成功构建了秦川牛ADIG基因的重组腺病毒表达载体pAD-ADIG,完成了病毒包装和扩繁。     

番鸭呼肠孤病毒σC基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

应用RT-PCR方法扩增出番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)的σC基因,通过XhoⅠ+HindⅢ双酶切后把该基因插入到经过同样双酶切的穿梭质粒pShuttle-CMV载体中。重组穿梭载体经过双酶切和PCR鉴定后进行测序,序列测定正确,同源性为99.8%。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞后获得重组腺病毒。PCR和RT-PCR鉴定的结果证明σC蛋白基因已成功插入到重组腺病毒载体中。     

表达犬瘟热病毒核蛋白的重组犬2型腺病毒构建与包装

为构建表达犬瘟热病毒核蛋白的重组犬2型腺病毒，用MluⅠ和SphⅠ双酶切真核表达载体pVAXLPN，获得CDVN基因表达盒，将CDVN基因表达盒克隆入预先用SspⅠ酶切后的线性化质粒pVAXAE3中，构建含CDVN基因表达盒的转移质粒pVAX△E3LPN。用NruⅠ和SalⅠ双酶切转移质粒pVAX△E2LPN。回收E3区部分缺失的含CDVN基因表达盒的目的片段，定向克隆入同样酶切处理含CAV-2全基因组的质粒载体ppoly2-CAV-2中，构建E3区部分缺失的包含CDV N基因表达盒的重组质粒pCAV-2-CDVLPN。重组质粒pCAV-2-CDVLPN经AscⅠ酶切获得线性化基因组CAV-2-CDVLPN。此基因组与NruⅠ和Sal Ⅰ分别酶切CAV-2 SY基因组获得的片段混合，利用脂质体介导共转染MDCK细胞，重复转染3次后。出现典型CAV-2病变，经电镜观察和酶切鉴定，证明表达犬瘟热核蛋白的重组犬2型腺病毒包装成功。     

水貂生长激素基因重组腺病毒的构建

本研究利用AdEasyTMXL腺病毒载体系统构建了水貂生长激素基因重组腺病毒。利用PCR、酶切、凝胶回收等方法,从质粒pCMVmGH中获得水貂生长激素基因(mGH),构建穿梭质粒pShuttle-CMV-mGH。pShuttle-CMV-mGH经PmeⅠ酶切线性化后转化至BJ5183感受态大肠杆菌内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd-CMV-mGH。重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染AD-293细胞。PacⅠ酶切结果表明质粒重组成功。转染第10天,细胞出现圆缩、死亡、漂浮等典型病变,透射电镜检测到重组病毒。TCID50测得第2代重组病毒的滴度达到10-7.89/0.1ml。RT-PCR结果证实,重组病毒能够正确转录目的基因。结果表明本试验成功构建了水貂生长激素基因重组腺病毒,为水貂促生长的研究提供了新的科学手段。     

猪乙型脑炎PrM-E重组腺病毒的构建及免疫原性

应用RT-PCR方法扩增出猪乙型脑炎病毒的PrM-E基因,经序列测定正确后,通过SalⅠ和EcoRⅠ酶切位点把该基因插入经过同样双酶切的穿梭质粒pDC315中,获得重组穿梭质粒pDC315-PrM-E。重组穿梭载体经过酶切和PCR鉴定后进行测序,证明所插入的基因是正确的。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHGlox-E1.3Cre共转化293细胞获得重组腺病毒Ad-PrM-E。经PCR鉴定证明所构建的重组腺病毒含有PrME基因。小白鼠免疫28 d后进行间接ELISA检测证明所构建的重组腺病毒在小白鼠体内能够诱导产生抗JEV的抗体,阳转率90%。     

番鸭源禽1型副黏病毒HN基因主要抗原结构域和V基因融合表达载体的构建

为构建番鸭源禽1型副黏病毒HN主要抗原结构域(HNd)和V基因融合表达载体,经PCR及融合PCR分别从重组质粒pMDHN和pMDP中扩增HN基因主要结构域和V基因cDNA.将HNd经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切、V基因用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,分别定向插入真核载体pcDNA3的多克隆位点相应的酶切位点中,对2个单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV进行酶切和测序鉴定.利用融合PCR技术扩增出HNd-V基因,定向克隆至pcDNA3的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切酶切位点之间,转化感受态细胞后,经PCR反应初筛后,对阳性克隆进行酶切分析及测序鉴定.对单表达重组质粒进行酶切分析及测序鉴定,结果表明:HNd和V基因已被正确定向克隆至真核表达载体peDNA3,成功构建了2个基因的单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV;对融合重组质粒酶切分析和测序鉴定表明,HNd-V融合基因正确克隆进真核表达质粒pcDNA3中,成功构建了融合表达载体pcDNAHNd-V.     

OM Ⅲ株口蹄疫病毒P1-2A-3C腺病毒载体的构建

选取O型口蹄疫病毒(FMDV)OMⅢ株的P1-2A和3C作为目的基因,分别扩增出目的片断后,定向亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,得到重组载体pAdTrack-P12A3C,重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体pAdeasy-1共同电转化入大肠杆菌BJ5183感受态细胞,同源重组后得到重组腺病毒质粒(pAd-P12A3C).将重组腺病毒质粒线性化后转染至HEK293细胞中可观察到典型的绿色荧光,从重组腺病毒的基因组中可扩增到P12A3C基因,证实获得了含有P12A3C的重组腺病毒.     

甜瓜蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因正反义表达载体的构建

为了改善甜瓜果实的品质及研究甜瓜蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的生物学功能,本试验分别构建了甜瓜果实SPS基因的正义及反义表达载体。用PCR方法将克隆到pMD18-T载体上的甜瓜SPS基因用带有KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物扩增,然后将该扩增片段克隆到pMD19-T Simple载体上,再用KpnⅠ和XbaⅠ双酶切,得到该基因编码区3.37 kb的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的KpnⅠ/XbaⅠ克隆位点,构建了甜瓜果实SPS基因的正义表达载体。将已克隆到pMD18-T载体上的甜瓜SPS基因用KpnⅠ和HincⅡ双酶切,得到该基因编码区830 bp的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的KpnⅠ/SmaⅠ克隆位点,构建了甜瓜果实SPS基因的反义表达载体。     

表达小反刍兽疫病毒H基因的山羊痘病毒通用转移载体的构建及鉴定

笔者以山羊痘病弱毒疫苗毒株TK基因内KpnI为插入位点，构建了表达绿色荧光蛋白和小反刍兽疫（PPR）H基因的重组山羊痘病毒通用转移载体，为今后研究羊痘病毒活载体疫苗奠定基础。     

表达小反刍兽疫病毒H基因的山羊痘病毒通用转移载体的构建及鉴定(英文)

[Objective] This study was to develop a live vector vaccine of goat pox virus of Peste des petits ruminants(PPR). [Method] Using PCR amplification technique, PPR H gene was obtained, then ligated into pGEM-T easy vector; the recombinants were digested by Nhe Ⅰ and Hind Ⅲ, and ligated into pEGFP-N1-P7.5, yielding the recombinant vector pEGFP-N1-P7.5-H; next the expression cassette EGFP-N1-P7.5-H was first released from recombinant vector pEGFP-N1-P7.5-H by double digestion of Hind Ⅲ and Nhe Ⅰ and ligated into pUC119-TK that was digested by Kpn Ⅰ, yielding the transfer vector pUC119-TK-EGFP-P7.5-H. [Result] Identification and double enzyme digestion showed that the transfer vector pUC119-TK-EGFP-P7.5-H was correctly constructed. From the transfer vector transfected BHK-21 cells which infected GTPV AV41, specific fluorescence was observed at 48th h of transfection. [Conclusion] The construction of goat poxvirus live vector laid a foundation for the live vector vaccine of PPR vaccine.     

表达猪Viperin蛋白重组腺病毒的构建及其对PRRSV复制的抑制作用

为研究猪Viperin蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的抑制作用,通过RTPCR方法扩增猪Viperin基因,并克隆入腺病毒穿梭载体p Ad Track-CMV,经菌液PCR、酶切鉴定后进行测序。将PmeⅠ内切酶线性化的重组穿梭载体质粒(p Ad Track-s VIP)电转化大肠杆菌BJ5183,与腺病毒骨架载体p Ad Easy-1进行同源重组,提取重组后的腺病毒质粒,经内切酶PacⅠ线性化后转染HEK-293A细胞,装配成完整的病毒粒子r Ad-s VIP。重组腺病毒r Ad-s VIP感染细胞后,可见绿色荧光蛋白的表达。RT-PCR、Western blot检测结果表明,重组腺病毒r Ad-s VIP可正确表达猪Viperin蛋白,且表达的猪Viperin蛋白具有良好的反应原性,对PRRSV的复制具有明显的抑制作用。     

猪Ⅱ型圆环病毒Cap基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白Cap基因的重组腺病毒表达载体。首先将Cap基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV上,再将重组质粒pAdTrack-CMV／Cap用Pme Ⅰ线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-Cap。为进一步研究PCV2腺病毒活载体疫苗奠定了基础。     

表达小反刍兽疫病毒H基因的山羊痘病毒通用转移载体的构建及鉴定

［目的］研制小反刍兽疫羊痘活载体疫苗。［方法］利用PCR技术扩增小反刍兽疫病毒H基因，克隆到pGEM-T easy载体，Nhe Ⅰ和Hin-d Ⅲ双酶切重组质粒，将目的片段插入到真核表达载体pEGFP-N1-P7.5中，得到重组载体pEGFP-N1-P7.5-H，重组载体Hin-d Ⅲ、NheⅠ双酶切片段EGFP-P7.5 H平末端连接到KpnⅠ 酶切后的载体pUC119-TK中，得到通用转移载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-H。［结果］经酶切鉴定及PCR扩增检测，表明构建载体正确。pUC119-TK-EGFP-P7.5-H转染羊痘病毒感染的BHK21细胞，48 h后报告基因表达。［结论］该研究为研制小反刍兽疫基因工程活载体疫苗奠定基础。     

香蕉枯萎病菌2个生理小种PL基因真核表达载体的构建与表达

【目的】构建香蕉枯萎病菌1号小种（FOC1）和4号小种（FOC4）果胶裂解酶（Pectate lyases, PL）基因的真核表达载体，并进行诱导表达，为进一步研究PL在病原菌致病过程中的作用奠定基础。【方法】将质粒pMD18-pl-foc1、pMD18-pl-foc4和真核表达穿梭载体pPICZαA进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切反应，回收目的片段连接，转化至DH5α进行筛选扩繁，对菌落进行PCR鉴定后抽提质粒进行PCR和EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切鉴定。将阳性载体线性化后电击转化毕赤酵母 SMD1168感受态细胞，用甲醇进行诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE分析。【结果】成功构建了FOC1和FOC4 PL基因的真核表达载体pPICZαA-pl-foc1和pPICZαA-pl-foc4，经甲醇诱导表达后分别获得了重组的PL蛋白，其分子质量约为23.4 ku。【结论】FOC1和FOC4 2个香蕉枯萎病菌小种的PL基因在酵母中得到了成功表达。     

人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因腺病毒载体的构建及包装

【目的】构建能够表达人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的腺病毒。【方法】通过对PCI-neo-hTERT质粒的改造，依次构建出JMB293-hTERT、pAdTrack-hTERT载体，将pAdTrack-hTERT经PmeⅠ线性化后与pAdEasy-1载体共转化到 BJ5183 细菌中进行重组，经卡那霉素抗性筛选获得重组腺病毒载体pAdEasy-hTERT。将pAdEasy-hTERT PacⅠ酶切线性化并回收后，转染HEK293人胚肾细胞，培养7 d后，收集细胞并反复冻融，收集细胞裂解液；反复扩增3次后，测定重组hTERT腺病毒的滴度。【结果】①利用酶切连接的方法得到了穿梭载体pAdTrack-hTERT；②通过同源重组将外源目的基因hTERT整合到腺病毒骨架载体中，得到重组质粒pAdEasy-hTERT；③成功获得了滴度为6.73×10¹⁰ GFU/mL的高滴度腺病毒颗粒。【结论】含有hTERT基因的重组腺病毒颗粒包装成功，为后续哺乳动物原代细胞永生化研究奠定了基础。     

新城疫病毒JZ05株F基因重组pGAPZα的构建

以RT-PCR扩增新城疫病毒JZ05株,基因F1片段和F2片段,以核酸内切酶κpnI和XbaI对目的基因片段及质粒pGAPZαA进行酶切,连接酶切产物,转化Eacterium coli DH5α.以PCR方法确定JZ05 F1的阳性重组子为2个,JZ05 F2的阳性重组子为4个.对阳性重组子进行酶切鉴定及序列分析,结果发现,重组质粒pGAPZαA-F1、pGAPZαA-F2及质粒pGAPZαA的酶切电泳条带与试验设计大小相符;基因测序得到的重组子中F1和F2序列长度分别为1198bp、269bp,与新域疫病毒JZ05株F基因序列比对,其序列长度和核苷酸排列完全一致.这表明重组质粒中目的基因片段的核苷酸序列、大小和插入位置是正确的,为以酵母表达系统表达F1和F2、研究强毒株与弱毒株F蛋白的抗原性差异程度及研制重组亚单位疫苗打下了基础.