豆豉纤溶酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

[目的]为豆豉纤溶酶的进一步研究与应用奠定基础。[方法]以从芽孢杆菌中提取的总DNA为模板,根据GenBank的豆豉纤溶酶基因(AY720895.2)DNA序列设计1对引物,克隆豆豉纤溶酶基因并进行序列测定。构建毕赤酵母表达载体pL3,在毕赤酵母中表达豆豉纤溶酶基因。[结果]经PCR扩增可获得约1.1 kb的DNA片段。序列分析表明所克隆DNA片段包含1个1089 bp的开放阅读框,编码363个氨基酸。该克隆基因与所发表的豆豉纤溶酶基因序列的核苷酸序列同源性为98%,而氨基酸序列同源性达100%。[结论]所克隆的豆豉溶纤酶基因在毕赤酵母中成功表达,且表达产物具有正常的生物学活性。     

外源基因在原核生物和真核生物中的表达(英文)

[目的]研究外源基因在原核生物和真核生物中的表达。[方法]将带有目的基因的表达载体pTYB2-WF转化大肠杆菌ER2566,用IPTG诱导植酸酶基因表达。用SDS-PAGE验证植酸酶融合蛋白表达情况,并进一步对融合蛋白进行纯化。用毕赤酵母表达系统表达植酸酶基因phyA;构建酵母整合载体pPIC9K-phyA,转化毕赤酵母GS115,构建工程菌GS115-pPIC9K-phyA。[结果]在甲醇的诱导下表达植酸酶,经酶活力的测定,其植酸酶活力达7.3μ/ml,构建了毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-phyA。[结论]甲醇酵母表达机制在分子生物学以及工业应用领域发挥作用。     

高表达粟酒裂殖酵母SpTrz2p对细胞周期的影响

[目的]测定粟酒裂殖酵母高表达的SpTrz2p对其细胞周期的影响。[方法]将粟酒裂殖酵母的trz2+克隆到pREP4x质粒上,构建带有SpTrz2的高表达载体,将构建成功的重组子转化至野生型粟酒裂殖酵母细胞中,利用流式细胞仪检测细胞周期的变化。[结果]高表达SpTrz2p可导致酵母细胞形态和周期的改变,使大部分酵母细胞停留于G1期,这说明高表达SpTrz2p对细胞周期有明显影响。[结论]该研究结果表明高表达SpTrz2p给细胞造成的致死毒性是通过影响细胞周期实现的。     

烟草microRNA827及其靶基因的鉴定与分析

[目的]本文旨在明确林烟草(Nicotiana sylvestris)microRNA827(miR827)及其靶基因的表达调控特征,揭示其靶基因在进化上的变异性及其功能,为全面解析植物磷信号途径提供新的证据。[方法]基于本课题组前期工作从普通烟草(Nicotiana tabacum)中克隆到的miR827基因序列,采用生物信息学手段结合RACE和RT-q PCR,以及本氏烟草叶片表皮细胞瞬时表达和酵母突变体回补试验,对林烟草miR827的靶基因进行克隆,对miR827及其靶基因的表达模式、靶基因的定位和功能进行研究。[结果]获得林烟草miR827两个靶基因Ns-SPX-MFS1/2的c DNA全长序列,发现Ns-miR827受缺磷诱导表达,而Ns-SPX-MFS1和Ns-SPX-MFS2响应缺磷信号分别发生下调和上调。Ns-SPX-MFS1/2均定位于液泡膜和细胞核。此外,不论Ns-SPX-MFS1/2的开放阅读框全长或截去SPX结构域的2个基因片段均能回补酵母磷吸收突变株。[结论]miR827及其靶基因调控模块在物种进化中存在复杂的变异性,Ns-SPX-MFS1/2具有转运磷的活性,其可能通过介导液泡和细胞质间磷的转运实现对植株磷稳态的调控。     

不结球白菜开花基因BcFT的亚细胞定位及其互作蛋白的筛选

[目的]开花基因FT是开花通路下游关键基因。本文旨在研究不结球白菜BcFT的亚细胞定位及互作蛋白的筛选,深入了解不结球白菜BcFT的功能及其调控机制。[方法]构建亚细胞定位载体p EZS-NL-BcFT,利用亚细胞定位技术研究BcFT的空间表达。通过酵母双杂交技术筛选与BcFT互作的蛋白,构建酵母双杂交诱饵载体p GBKT7-BcFT,转化酵母Y2H Gold菌株,验证自激活性和自毒性。对不结球白菜酵母双杂交c DNA文库进行筛选,得到与BcFT互作的片段,并根据基因片段进行比对,以不结球白菜c DNA为模板进行基因全长克隆,构建p GADT7载体,进行共转化验证,最后对筛选得到的2个蛋白进行生物信息学分析。[结果]BcFT蛋白在整个细胞中均有分布。诱饵载体p GBKT7-BcFT表达产物对酵母细胞无自激活性和自毒性,通过酵母双杂交及共转验证得到2个与BcFT互作的蛋白:Bc PPD5和Bc VHA-E1。生物信息学分析预测这2个蛋白均为亲水性蛋白,不含信号肽,Bc PPD5蛋白的氨基酸序列存在1个跨膜区,二级结构中不规则卷曲所占比例最大,第163和296氨基酸残基之间存在1个Psb P结构域;Bc VHA-E1蛋白无跨膜区,二级结构中α螺旋所占比例最大,无特定结构域。[结论]确定了BcFT蛋白在整个细胞中均有表达。利用酵母双杂交技术筛选得到2个与BcFT互作蛋白,进一步分析发现其可能通过光周期路径影响开花。     

T1083替换融合质粒载体pGBKT7-TS转入酵母的自激活实验

[目的]研究T1083替换融合质粒载体pGBKT7-TS转入酵母的自激活实验,探讨其表达产物是否可作为诱饵进行酵母双杂交筛选。[方法]将T1083替换突变BD融合质粒载体pGBKT7-TS转入酵母后,进行自激活和蛋白表达毒性检测试验。[结果]该片段表达产物无自激活特性且对酵母细胞无毒性,可以作为诱饵进行酵母双杂交筛选。[结论]为进一步研究NtKRP尾部T1083替换对NtKRP与靶物质结合的影响奠定了实验基础。     

酵母单杂交文库构建及巨峰葡萄VvFT基因启动子上游调控因子筛选

[目的]利用酵母单杂交文库筛选巨峰葡萄VvFT基因启动子上游调控因子,挖掘参与调控葡萄开花时间的因子,为揭示花期转变代谢通路和定向改良葡萄品种提供理论参考.[方法]利用PlantCARE分析预测VvFT基因启动子顺式作用元件,并以VvFT基因启动子为诱饵,利用酵母单杂交文库筛选技术,筛选作用在VvFT基因启动子上游的调控因子.[结果]葡萄VvFT基因启动子区域存在13种启动子顺式作用元件,包括A-box、CAAT-box和TATA-box组成型调控元件;光响应调控元件ATC-motif、Box 4、G-Box和GT1-motif;茉莉酸甲酯(MeJA)响应调控元件CGTCA-motif和TGACG-motif;干旱诱导的MYB结合位点元件MBS;玉米蛋白代谢必需的调控元件O2-site;参与生物钟控制的调控元件circadian;厌氧诱导必需调控元件ARE.以VvFT基因启动子为诱饵,筛选获得34条表达序列标签(EST),其中有21条为未知功能,有13条在植物生长、抗逆防御、信号转导、转录调控、蛋白酶等方面均有已知或预测的功能,包括转录抑制因子ft41、GRF1互作因子ft44、NAP1相关蛋白ft64及ft70分子伴侣DnaJ10.酵母单杂交点对点验证结果表明VvDnaJ10和VvFT基因启动子之间有相互作用.[结论]通过酵母单杂交文库筛选获取13条候选EST,虽然大部分EST功能预测分析结果与VvFT调控开花时间无明显的直接关系,但研究结果为进一步探索VvFT转录或表达水平控制葡萄开花时间的分子机制提供侯选基因.     

运用布尔网络模型和贝叶斯网络模型推测基因调控网络的比较研究

基因调控网络的研究从基因之间相互作用的角度揭示复杂的生命现象,是功能基因组学研究的重要内容,也是当前生物信息学研究的前沿。布尔网络模型和贝叶斯网络模型都是研究基因调控网络的有力工具。本文分别采用布尔网络模型和贝叶斯网络模式推测基因调控网络,实验结果显示布尔网络推测出了7条正确的调控关系,而贝叶斯网络仅推测出5条正确的调控关系,在本实验中推测基因之间的调控关系正确数布尔网络模型优于贝叶斯网络模型。     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母中的表达及纯化(英文)

[目的]观察拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母体系中的表达,获得重组蛋白。[方法]将At2G34450基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SalⅠ将重组质粒线性化,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。[结果]拟南芥At2G34450在酵母培养基中实现了表达,表达产物经SDS-AGE鉴定为重组蛋白。[结论]在毕赤酵母真核系统中实现了拟南芥At2G34450蛋白的表达,为进一步研究拟南芥HMGB家族蛋白打下了基础。     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母中的表达及纯化

[目的]观察拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母体系中的表达,获得重组蛋白。[方法]将At2G34450基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SaⅠl将重组质粒线性化,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。[结果]拟南芥At2G34450在酵母培养基中实现了表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定为重组蛋白。[结论]在毕赤酵母真核系统中实现了拟南芥At2G34450蛋白的表达,为进一步研究拟南芥HMGB家族蛋白打下了基础。     

Dynamic complex formation during the yeast cell cycle

To analyze the dynamics of protein complexes during the yeast cell cycle, we integrated data on protein interactions and gene expression. The resulting time-dependent interaction network places both periodically and constitutively expressed proteins in a temporal cell cycle context, thereby revealing previously unknown components and modules. We discovered that most complexes consist of both periodically and constitutively expressed subunits, which suggests that the former control complex activity by a mechanism of just-in-time assembly. Consistent with this, we show that additional regulation through targeted degradation and phosphorylation by Cdc28p (Cdk1) specifically affects the periodically expressed proteins.     

Restriction of DNA replication to the reductive phase of the metabolic cycle protects genome integrity

When prototrophic yeast cells are cultured under nutrient-limited conditions that mimic growth in the wild, rather than in the high-glucose solutions used in most laboratory studies, they exhibit a robustly periodic metabolic cycle. Over a cycle of 4 to 5 hours, yeast cells rhythmically alternate between glycolysis and respiration. The cell division cycle is tightly constrained to the reductive phase of this yeast metabolic cycle, with DNA replication taking place only during the glycolytic phase. We show that cell cycle mutants impeded in metabolic cycle-directed restriction of cell division exhibit substantial increases in spontaneous mutation rate. In addition, disruption of the gene encoding a DNA checkpoint kinase that couples the cell division cycle to the circadian cycle abolishes synchrony of the metabolic and cell cycles. Thus, circadian, metabolic, and cell division cycles may be coordinated similarly as an evolutionarily conserved means of preserving genome integrity.     

羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白酵母双杂交诱饵表达载体的构建及其毒性和自激活效应检测

[目的]构建含羊布鲁氏菌16M Omp25基因的酵母双杂交诱饵质粒,检测诱饵质粒表达产物对cdc25H酵母细胞有无毒性作用以及对报告基因有无激活作用。[方法]聚合酶链反应(PCR)扩增布鲁氏菌Omp25基因的编码序列,定向克隆到酵母表达载体pSos上,构建诱饵重组质粒pSos-Omp25,经测序正确后,将其将转化到酵母菌cdc25H感受态细胞,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。[结果]序列测定证明重组诱饵质粒pSos-Omp25构建成功;重组质粒表达产物对cdc25H酵母细胞无毒性,对报告基因无激活作用。[结论]利用SOS恢复系统(SRS)成功构建了羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白酵母双杂交诱饵质粒,为筛选与羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白相互作用的蛋白创造了条件。     

The yeast cell cycle gene CDC34 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme

Mutants in the gene CDC34 of the yeast Saccharomyces cerevisiae are defective in the transition from G1 to the S phase of the cell cycle. This gene was cloned and shown to encode a 295-residue protein that has substantial sequence similarity to the product of the yeast RAD6 gene. The RAD6 gene is required for a variety of cellular functions including DNA repair and was recently shown to encode a ubiquitin-conjugating enzyme. When produced in Escherichia coli, the CDC34 gene product catalyzed the covalent attachment of ubiquitin to histones H2A and H2B in vitro, demonstrating that the CDC34 protein is another distinct member of the family of ubiquitin-conjugating enzymes. The cell cycle function of CDC34 is thus likely to be mediated by the ubiquitin-conjugating activity of its product.     

不同含油量油菜品种LECl基因表达研究

[目的]揭示不同含油量油莱品种LECl基因的遗传多样性。[方法]测定不同含油量品种不同发育时期LECl基因的表达量及含油量。[结果]甘蓝型油菜LECl基因与含油量密切相关,其相对表达量在花期和角果期均与含油量呈显著正相关,且花期的相关系数大于角果期相关系数。[结论]该研究为选育高含油量油菜品种提供理论依据。     

低聚异麦芽糖和酵母细胞壁对中华鳖肝脏中溶菌酶基因表达的半定量分析

[目的]探讨低聚异麦芽糖和酵母细胞壁对中华鳖肝脏中溶菌酶基因表达的影响。[方法]利用CODEHOP设计简并引物,通过RT-PCR克隆中华鳖溶菌酶基因,然后通过半定量PCR分析低聚异麦芽糖和酵母细胞壁对中华鳖溶菌酶基因在肝脏中表达量的影响。[结果]通过克隆中华鳖溶菌酶基因,获得303 bp的溶菌酶基因片段,其GenBank登录号HQ437284,与GenBank登录号Q7LZQ1.3的中华鳖C型溶菌酶氨基酸序列同源性为75%。半定量分析结果表明,低聚异麦芽糖可显著提高中华鳖溶菌酶基因在肝脏中的表达量,而酵母细胞壁对中华鳖溶菌酶基因片段在肝脏中的表达量的影响不显著。[结论]该研究可为低聚异麦芽糖和酵母细胞壁在中华鳖养殖中的科学应用以及绿色环保添加剂的开发提供理论依据。     

环境雌激素调控的β-半乳糖苷酶酵母细胞的建立

为建立环境雌激素的酵母评价体系，将人工合成的雌激素效应元件插入pMP206质粒的上游，并将该质粒转入人雌激素受体基因重组酵母细胞，使LacZ基因置于雌激素的调控之下，以构建可用于评价环境雌激素的酵母细胞。结果表明：经DNA测序发现pMP206／ERE-LacZ报告质粒DNA框架正确。对转化子进行PCR鉴定，发现有雌激素受体基因和pMP206／ERE-LacZ报告质粒的特异性条带，说明雌激素受体基因和受雌激素调控的LacZ报告基因已重组于酵母细胞。从而证明以LacZ为报告基因的环境雌激素酵母评价细胞重组成功。     

柽柳谷胱甘肽转移酶基因(ThGSTZ1)转入酵母的抗逆能力分析

[目的]研究盐、重金属、低温和高温胁迫下,柽柳GST基因（命名为ThGSTZ1）的抗性作用。[方法]将ThGSTZl基因构建到酵母表达载体pYES2中,转入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）获得重组型酵母,同时以转化空载体pYES2的重组酵母作为阴性对照;对2种重组酵母分别进行LiCl、NaCl、KCI、CdCl2、ZnCl2、MgCl2、-20和53qC胁迫处理,比较2种酵母的成活率。[结果]ThGSTZ1能有效的提高酵母的抗盐碱及极端温度的能力,表明ThGSTZ1可能参与柽柳的逆境胁迫应答过程。[结论]GST基因具有参与多种胁迫响应和调节的功能。