转甜菜碱醛脱氢酶基因玉米的田间筛选及生理分析

为了对已获得的转甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)玉米3个株系的后代进行田间耐盐性鉴定,采用稀释1倍的人工海水在温室内模拟田间盐胁迫进行处理,结果表明:在盐胁迫条件下,转BADH基因玉米成活率较对照高,转基因株系的叶片电导率极显著地低于对照,而叶绿素含量极显著地高于对照。转基因株系后代的耐盐性与对照材料相比具有明显的优势,验证了在田间盐胁迫条件下,BADH基因在转基因玉米后代中的表达,同时也为培育转BADH基因玉米纯系奠定基础。     

NaHCO3胁迫对转TaLEA基因山新杨生长及光合、叶绿素荧光特性的影响

为了筛选耐苏打盐渍土的转基因杨树优良株系, 以苏打盐渍土的主要成分NaHCO₃胁迫处理转TaLEA基因的山新杨各株系与对照(NT)，测定不同株系的苗高和地径等生长性状，测定净光合速率(P_n)、胞间CO₂浓度(C_i)、气孔导度(G_s)、蒸腾速率(T_r)等光合参数以及最大光化学效率(F_v/F_m)、光化学猝灭系数(qP)、非光化学猝灭系数(NPQ)、实际光化学电子产量(Φ_PSII)等叶绿素荧光动力学参数，利用染色法分别比较各株系的超氧离子和过氧化氢的累积情况，进而综合评价不同株系对NaHCO₃胁迫的响应。结果表明，NaHCO₃胁迫处理前、后各株系的苗高和地径生长量发生明显分化，由处理前的差异不显著，到处理20 d后的显著，转基因株系的苗高、地径普遍较对照高，表现突出的是转基因株系SL2号，其平均苗高和地径分别较对照提高了17.4%、15.7%；对照的盐害指数是转基因株系的3.3倍，并且转基因株系的平均存活率是对照的2.8倍。各转基因株系的光合参数和荧光参数也较对照增强，P_n、T_r在胁迫20 d后转基因株系较对照分别高了237.38%、649.02%，G_s、C_i在胁迫15 d时转基因株系较对照分别高了119.05%、24.56%，其中SL2号转基因株系较对照分别提高150%、25.81%。各转基因株系的F_v/F_m平均为0.68，对照只有0.45，前者的qP和Φ_PSII只略高于后者，后者的NPQ却是前者的6倍。转基因株系的超氧离子和过氧化氢累积量均少于对照。在相同的碱胁迫环境下，转基因山新杨，尤其是SL2，能保持较快的生长量、较强的光合能力和较低的ROS水平，初步选择其为耐苏打盐渍土的杨树转基因优良株系。      

转基因741杨叶片对卡那霉素适应性分析

采用不同浓度卡那霉素溶液处理转基因741杨株系Pb17、Pb29及未转基因741杨一年生枝条,测定它们在不同处理下的各项生理指标,探索作为选择标记基因的新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)在转基因植株中的表达情况。结果表明,随着卡那霉素处理浓度的提高,各转基因株系及对照的酶促防御系统SOD、POD活性降低,净光合速率、荧光动力学参数下降,但Pb29、Pb17下降幅度均低于对照,证明nptⅡ基因在转基因741杨叶片中与目的基因同步表达,使转基因株系具备抗卡那霉素的能力。     

谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35在水稻中对盐胁迫的响应

【目的】盐胁迫影响作物的产量和品质,而作物的耐盐性受特定基因的调控。在前期获得谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35过表达水稻株系的基础上,拟结合植株在盐胁迫下的表型,对部分盐胁迫指标及响应基因的表达模式进行检测和验证,解析谷子SiRLK35参与盐害响应的可能机制。【方法】选取谷子SiRLK35过表达水稻株系,分别为过表达株系(over-expression,OE)-1(OE-1)、OE-2和OE-3,以野生型中花11为对照,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测各株系中SiRLK35的表达情况;分别用含0、150和200 mmol·L~(-1) NaCl的MS培养液处理三叶期的对照及转基因株系幼苗,观察其表型,统计150 mmol·L~(-1) NaCl处理3d后苗长及根长;用150 mmol·L~(-1) NaCl处理四叶期幼苗,统计处理14 d后材料干重、死亡率和死叶率,对各材料的耐盐性进行评价;进一步挑选SiRLK35过表达程度高且耐盐表型好的OE-1株系,利用3,3'-二氨基联苯胺(3,3'-Diaminobenzidine,DAB)和氮蓝四唑(nitrotetrazolium blue chloride,NBT)染色检测其胁迫下过氧化物积累及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化物酶(peroxidase,POD)的活性;并对部分盐害响应基因的表达模式进行检测。【结果】谷子SiRLK35在株系OE-1中的相对表达量最高;150 mmol·L~(-1)NaCl处理3 d幼苗后,中花11苗长和根长的生长受抑制程度均大于SiRLK35过表达株系,其中OE-1的受抑制程度最小;四叶期幼苗经150 mmol·L~(-1) NaCl处理14 d后,转基因株系地上部和地下部干重降低幅度均低于对照,且幼苗死亡率和死叶率均低于对照;盐胁迫下对照过氧化染色反应明显,O~(2-)和H_2O_2的积累均高于过表达植株,SOD和POD抗氧化酶活性均高于对照;部分盐害响应基因在SiRLK35过表达株系中表现为上调,其中,OsLEA3在盐处理24 h的相对表达量是对照中的1.9倍。【结论】谷子SiRLK35异源转化水稻获得的过表达株系对盐胁迫具有一定的抗性,SiRLK35可通过调控抗氧化酶活性及相关信号途径,从而参与盐害响应。     

柽柳rd22基因的序列分析及耐盐性研究

【目的】验证从抗逆植物柽柳中克隆得到的rd22基因的耐盐能力。【方法】采用根癌农杆菌介导法,对烟草进行rd22基因的遗传转化,将分子检测为阳性的6个转基因烟草株系和非转基因对照烟草的组培苗进行盐胁迫(NaCl浓度分别设为0(CK),110,220和330 mmol/L)试验,通过观察相对电导率、SOD活性和相对生长量的变化,研究rd22基因的耐盐能力。【结果】生物信息学分析表明,来自柽柳的rd22基因属于BURP蛋白家族。分子检测证明,该rd22基因已整合到烟草基因组中,并在mRNA水平上有不同程度的表达。相对电导率和SOD活性分析表明,随着盐胁迫浓度的增加,各转基因烟草株系的相对电导率均呈上升趋势,且均小于对照烟草,在盐胁迫浓度达到330mmol/L时,非转基因对照烟草的相对电导率高达16.49%,而各转基因烟草的相对电导率最大为14.91%。各转基因烟草株系的SOD活性也随着盐胁迫浓度的增加均呈上升趋势,且均大于对照烟草,在盐胁迫浓度达到330 mmol/L时,转基因烟草SOD活性是对照烟草的1.10~1.39倍。相对生长量分析表明,盐胁迫浓度达到110,220,330mmol/L时,各转基因烟草株系相对生长量均高于对照株系,非转基因烟草的相对生长量分别为59.92%,36.99%和12.72%,转基因烟草的相对生长量平均为67.00%,44.05%和17.47%。【结论】rd22基因的导入,提高了转基因烟草的耐盐性。     

白桦BpCHS3转基因植株耐盐性分析

目的查耳酮合成酶（CHS）是黄酮类化合物生物合成途径中的关键酶，其高表达可以促进黄酮类化合物积累，增强植物抵抗盐碱、干旱等非生物胁迫的能力，开展转BpCHS3白桦耐盐性分析，为阐明该基因的功能提供参考。方法以前期获得的转BpCHS3白桦为试材，进行转基因白桦qRT-PCR及Northern Blot检测，同时测定了叶片中花青素质量分数。NaCl胁迫处理下，分别测定转BpCHS3白桦的盐害指数、叶绿素荧光参数及光合参数。采用qRT-PCR技术，测定转基因株系的类黄酮代谢途径中CHS下游5个关键酶基因以及BpCHS家族成员相对表达量。结果qRT-PCR及Northern Blot检测显示，导入的目标基因BpCHS3在mRNA水平能够表达。转基因白桦组培生根苗在0.3%NaCl胁迫第25天，对照（WT）株系盐害指数高达83%，而转基因白桦平均盐害指数仅为39%；白桦转基因盆栽苗在0.4%NaCl胁迫后，叶绿素荧光参数及光合参数测定显示，NaCl胁迫第9天多数转基因株系最大光化学效率（F_v/F_m）仍为正常值，而WT株系降至0.66，胁迫第9天时实际光化学效率（Φ_PSII）和光化学猝灭系数（qP）呈下降趋势，但WT株系的降幅高于转基因株系；NaCl胁迫6 d时，5个转基因株系的净光合速率（P_n）平均值仍高于WT的43.47%。认为盐胁迫下BpCHS3基因在白桦中的过量表达能够维持其较高的光电子传递活性，提高PSⅡ反应中心原初光能转换效率，同时也能维持较高的净光合效率。分别以转BpCHS3白桦cDNA为模板qRT-PCR分析显示，相对WT株系CHS下游的5个关键酶基因在转基因株系中均呈不同程度的上调表达，BpCHS家族成员中只有BpCHS3表达量显著上调，而 BpCHS1和BpCHS2均呈下调表达或与WT株系差异不显著。BpCHS3过表达株系花青素质量分数分析发现，转基因白桦叶片中花青素质量分数均显著低于WT株系，推测BpCHS3的过量表达，对另外2个CHS家族成员产生共抑制，且影响花青素的合成。结论转BpCHS3白桦的耐盐性提高，与花青素质量分数多少无关，BpCHS3的过表达可能促进其他黄酮类化合物的积累，从而增强白桦的耐盐能力。      

过量表达棉花GhSAP1提高转基因烟草的耐盐性

【目的】SAP（stress-associated protein）是一类涉及胁迫应答和调控的锌指蛋白。克隆并分析其对逆境胁迫应答的反应,为棉花抗逆育种提供候选基因。【方法】通过电子克隆方法并经RT-PCR验证获得棉花锌指蛋白基因GhSAP1,将带有目的基因的载体质粒通过PEG介导转化棉花叶肉原生质体细胞,瞬时表达分析其编码蛋白的特性及亚细胞定位信息。通过qRT-PCR技术分析目标基因的组织表达特征及非生物胁迫条件下的表达特性。通过农杆菌介导叶盘转化法,经组织培养获得转基因烟草进行异位表达,检测其与抗逆相关的生理指标,证明其提高植物抗逆能力。【结果】GhSAP1 ORF长度为543 bp,编码一条含180个氨基酸残基的多肽。其理论等电点8.97,分子量19.3 kD,具有典型的A20/AN1锌指结构域。亚细胞定位显示该基因编码的蛋白定位于细胞核上。不同组织器官表达分析显示,GhSAP1在根、茎、叶中的表达量高,而在开花后5 d的胚珠中表达量很低。GhSAP1受盐胁迫诱导,高盐处理2 h后表达量最高。利用含100 μg•mL-1 Kan的培养基进行抗性筛选转基因后代,结合目标基因的PCR与RT-PCR验证,获得转GhSAP1的转基因烟草阳性株系10个。目标基因GhSAP1均能在烟草基因组中整合并异位过量表达。随机选择3个转基因烟草株系,盐胁迫处理显示,发芽一周的种子在含200 mmol•L-1 NaCl培养基上胁迫12 d,转基因植株幼苗平均成活率为81.7%,比非转基因对照植株增加近3倍,其平均根长为3.05 cm,极显著高于非转基因对照。利用GhSAP1表达较高的L2纯系进行成株期烟草盐胁迫处理30 d,转基因烟草后代的SOD活性和可溶性总糖含量增幅分别为23.89 U•g-1 FW和8.37 %,均显著高于非转基因对照;与未胁迫处理相比,转基因植株的叶绿素含量降低幅度仅为0.17 mg•g-1 FW,而非转基因对照降低了0.39 mg•g-1 FW;盐胁迫处理后,转基因植株的MDA含量增幅为7.42 nmol•g-1FW,而非转基因对照增幅达20.85 nmol•g-1FW;在盐胁迫下,转基因植株具有更强的K+根部运输到植株绿色组织能力,其地上部的K+/Na+为1.23,显著高于非转基因对照。【结论】GhSAP1在参与植物的逆境应答反应机制中具有重要作用,过量表达GhSAP1可显著提高转基因烟草的耐盐能力。     

盐胁迫下MaAQP1转基因拟南芥幼苗的生长和生理响应

为了探讨盐胁迫对香蕉水通道蛋白质基因(Ma AQP1)转基因拟南芥幼苗的生长及抗逆性生理指标的影响,以Ma AQP1转基因拟南芥为研究对象,研究不同盐(Na Cl)浓度(0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150mmol/L)处理下转基因拟南芥的表型及生理指标变化。结果显示:(1)经过盐胁迫后,野生型和转基因株系钾离子(K+)浓度降低,钠离子(Na+)浓度升高,而转基因株系K+和Na+浓度均明显低于野生型株系,同时,转基因株系具有较高的K+/Na+;(2)随着盐胁迫浓度的增加,野生型和转基因株系中电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量及过氧化氢酶活性均逐渐升高,当盐胁迫浓度达到150 mmol/L时4个指标均达到高峰,其中,转基因株系中的电导率、脯氨酸含量及过氧化氢酶活性均比野生型的高,而丙二醛含量比野生型的低;(3)随着盐胁迫浓度的增加,野生型株系幼苗的根长缩短程度大于转基因株系,同时,转基因株系的根毛要远多于野生型。表明Ma AQP1能够提高转基因拟南芥的耐盐性。     

棉花GhSEDEG38基因调控棉花耐盐性的功能分析

基于棉花体细胞胚胎再生不同时期表达谱中筛选出一系列差异表达转录因子,通过RT-PCR和qRT-PCR分析这些转录因子在不同逆境处理下的表达,发现GhSEDEG38基因(somatic embryogenesis differencially expressed gene 38)的表达受盐胁迫诱导明显上调;序列分析发现GhSEDEG38编码bZIP型转录因子,与拟南芥bZIP53基因同源。为进一步验证该基因的功能,构建了该基因的RNAi干涉载体并转化棉花,通过分子检测获得了表达量显著降低的转基因棉花株系。通过对萌发期和三叶期转基因材料和对照材料进行盐处理发现,干涉GhSEDEG38基因降低棉花在萌发期及苗期对盐胁迫的抗性,盐处理后转基因植株的MDA含量和活性氧含量显著高于对照材料,而可溶性糖含量显著低于对照材料。综上,GhSEDEG38参与棉花对盐胁迫的应答。     

柽柳eIF1A基因耐重金属CdCl_2胁迫能力分析

通过实时荧光RT-PCR技术研究了CdCl2胁迫下不同时间点柽柳根、茎、叶中eIF1A基因的表达模式,结果表明:该基因受CdCl2胁迫诱导明显,可能参与柽柳的CdCl2胁迫应答。进一步对转柽柳eIF1A基因的T2代烟草进行CdCl2胁迫,测定各转基因株系及野生型烟草的MDA、POD、SOD、可溶性蛋白含量等各项抗逆生理指标,结果表明柽柳eIF1A基因具有提高烟草的耐CdCl2胁迫的能力。     

翻译起始因子(eIF1A)基因的获得及抗旱性分析

从柽柳cDNA文库中测序得到一条长度为631bp,编码113个氨基酸的全长cDNA基因序列,利用生物信息学软件对该基因进行分析,确定其属于eIF1A家族。采用农杆菌介导法进行烟草的遗传转化,通过分子检测证明eIF1A基因已经整合到烟草基因组中,并且在mRNA水平上得到不同程度的表达。对各转基因烟草及非转基因对照烟草进行旱胁迫处理,测定抗逆生理指标、生长量大小。结果证明,柽柳的eIF1A基因具有提高烟草的抗干旱能力。     

柽柳过氧化物酶基因的序列分析及山新杨遗传转化研究

对刚毛柽柳(Tamarix hispida)的过氧化物酶基因(ThPOD)全长序列进行分析,结果表明,该基因全长为1 376 bp,包含一个1 086 bp的开放阅读框,可编码361个氨基酸残基,蛋白分子质量为39.3 ku。根据ThPOD基因保守序列设计特异引物克隆该基因,并成功构建了pROKⅡ-ThPOD植物过表达载体,利用农杆菌介导法转化山新杨(Populus davidiana×P.bolleana),经PCR和Northern blot鉴定,初步证明外源基因ThPOD已整合到山新杨的基因组中并在转录水平上进行了表达。     

杨树对潮霉素的敏感性研究

以山新杨、欧美杨、小黑杨无菌苗的幼叶、叶片分化的不定芽、茎段为外植体,研究了其对潮霉素的敏感性。结果表明:叶片分化时山新杨和欧美杨的潮霉素敏感性为2.0 mg/L,小黑杨为3.0 mg/L;不定芽生长和生根时山新杨和小黑杨的敏感性为2.0 mg/L,欧美杨为1.0 mg/L;茎段生长和生根时山新杨和小黑杨的敏感性为6.0 mg/L,欧美杨为2.0 mg/L。     

过量表达AtNHXS1新基因显著提高水稻的耐盐性

以转基因和野生型水稻为材料,通过农杆菌介导法将AtNHXS1转到水稻植株中花11号中,分析在盐胁迫下Na+、K+含量的变化,对两者耐盐性进行比较,并对转基因株系进行分子鉴定和转录表达分析。结果表明:PCR初步鉴定得到了20个转基因株系,随机挑选2个PCR阳性株系进行Southern blot鉴定,确定AtNHXS1以单拷贝的形式成功插入到水稻基因组中。耐盐性分析表明,在盐胁迫条件下,转基因水稻植株的生长状况、干质量、鲜质量、Na+含量显著优于或高于野生型水稻植株;此外,300mmol/L NaCl处理下,转基因水稻植株能够正常存活,而野生型水稻5d内几乎全部死亡。将300mmol/L NaCl处理过的植株在无盐胁迫的条件下进行恢复生长试验,转基因植株10d内恢复正常,而野生型则不能。过量表达改组后的AtNHXS1新基因显著提高了水稻的耐盐性。     

Research on Tobacco Transformation of Vacuolar H＋-ATPase Subunit c Gene from Iris lacteal

Vacuolar ATPase is the key enzyme in the aspect of plant stress, which contains 13 subunits. In this study, VHA-c which was cloned from the salt-tolerant plants Iris lacteal was transformed into tobacc...     

转AtNDPK2基因甘薯的耐盐性鉴定

以转AtNDPK2基因甘薯植株为试材,根据其生理指标及表型变化来鉴定转基因甘薯的耐盐性。室内鉴定结果表明:在100、150 mmol/L NaCl胁迫下,转基因株系JN1~JN6的根长显著高于对照。田间鉴定结果表明:在50 mmol/L NaCl胁迫下,转基因株系JN1~JN6生长正常,而对照10 d后出现黄叶及枯萎等症状;在100 mmol/L NaCl胁迫下,对照植株和JN2~JN6在处理4 d后出现枯萎,而JN1生长正常。     

转DREB1A基因提高烟草抗逆性的研究

将拟南芥(Arabidopsis thatiana)DREBIA基因分别在组成型启动子花椰菜病毒35S启动子和逆境诱导型启动子rd29A的驱动下转入烟草中,获得的两种转基因植株对干早和低温胁迫的抗性均显著提高,但对盐胁迫的杭性无明显变化.研究分析了组成型启动子和逆境诱导型启动子控制的DREBIA转基因植株在形态发育和抗...