巴西橡胶树钙调蛋白基因的克隆和表达分析

以拟南芥和杨树的钙调蛋白氨基酸序列为探针,对橡胶树转录组数据库进行搜索,并设计引物进行PCR扩增,得到7个橡胶树钙调蛋白基因的c DNA序列,命名为Hb Ca M1-7。序列分析结果发现,Hb Ca M1-7的CDS序列均为450 bp,编码149个氨基酸,分子量为16.8 ku,等电点为3.95。其中,Hb Ca M1-6间氨基酸同源性为100%,Hb Ca M7与其他成员之间的氨基酸同源性为98%。在基因结构组织方面,Hb Ca M1-7均为一个内含子,且内含子的插入位置相同,但内含子的长度明显不同。从氨基酸序列同源性和进化关系分析结果可看出,钙调蛋白基因家族在进化上非常保守。在表达方面,Hb Ca M1-6在各组织中均有表达,除了Hb Ca M3在根中表达丰度相对较高,其他成员均在胶乳中表达丰度相对较高,而Hb Ca M7在各组织中的表达均比较低;乙烯利处理后,Hb Ca M2-7的表达均有一定的上升趋势,而在叶片发育过程中Hb Ca M1-5碷呈明显下调表达。由此可见,橡胶树钙调蛋白与橡胶树叶片发育、胶乳乙烯信号通路具有一定的相关性。     

巴西橡胶树HbRALF34的克隆及表达分析

依据橡胶树胶乳转录组数据,利用RT–PCR技术鉴定了一个快速碱化因子(rapid alkalinization factor,RALF)家族基因cDNA序列。该cDNA长度为767 bp,开放阅读框长度为411 bp,编码136个氨基酸。序列比对显示该RALF基因与AtRALF34有较高相似性,因而命名为HbRALF34。以热研7–33–97无性系橡胶树为材料,采用实时荧光定量PCR对不同组织及乙烯、茉莉酸、伤害、过氧化氢、高盐、低温、干旱等处理下HbRALF34的表达模式进行分析。结果表明:HbRALF34在橡胶树叶片、花、树皮以及胶乳中均有表达,其中胶乳中表达量最高;与健康橡胶树相比,HbRALF34在死皮橡胶树胶乳及树皮中的表达量显著上调;乙烯、茉莉酸、过氧化氢及伤害处理能诱导该基因表达,而低温、干旱及高盐处理则抑制该基因表达,表明HbRALF34可能参与橡胶树的信号传导、产排胶调控以及胁迫响应。     

巴西橡胶树HbUBC14基因克隆、生物信息学及表达分析

从巴西橡胶树中鉴定出一个泛素结合酶(UBC)基因,该基因长653 bp,最长开放阅读框504 bp,预测编码蛋白包含167个氨基酸;序列比对分析发现,该基因编码的蛋白具有一段保守的UBC结构域,与拟南芥E2成员UBC14(At3g55380)具有较高的相似性,故将该基因命名为HbUBC14。半定量RT-PCR分析结果表明,HbUBC14在巴西橡胶树胶乳中表达最高,在花药中表达最低。与健康橡胶树相比,死皮树胶乳中HbUBC14表达量明显下降。HbUBC14表达还受乙烯和茉莉酸调控。以上结果表明,HbUBC14可能在巴西橡胶树死皮、乙烯和茉莉酸反应中发挥作用。     

巴西橡胶树HbEPSPS基因逆境响应功能解析

草甘膦除草剂的靶标酶为5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)。为研究HbEPSPS基因在橡胶树中的逆境响应功能,分析其在草甘膦、机械伤害、白粉菌侵染和不同激素处理下的表达模式。结果表明:草甘膦、机械伤害和IAA处理诱导HbEPSPS显著上调;干旱、ABA、SA和ETH处理亦能诱导HbEPSPS显著上调;H2O2处理橡胶树叶片中HbEPSPS表达呈现双峰规律;白粉菌侵染叶片,HbEPSPS表达显著下调。不同部位表达分析结果表明,HbEPSPS基因在花中表达量最高,其次是树皮和叶,在胶乳中表达量最低。此结果表明,HbEPSPS基因在橡胶树草甘膦药害和激素信号响应中具有重要作用,为研究其在橡胶树抗逆机制中的作用奠定良好基础。     

巴西橡胶树HbICE2基因的克隆及表达分析

ICE(inducer of CBF expression)介导的非依赖ABA信号传导途径在植物应对低温胁迫反应中起重要的调节作用。采用RT-PCR技术从橡胶树无性系热研8-79的叶片中扩增到1条全长c DNA,共1 677 bp,包括1 593 bp的开放阅读框,编码530个氨基酸,含有bHLH结构域,其中包含19个特征性的保守KMDRASILGDAI(D/E)YLKELL氨基酸序列,命名为HbICE2(Gene Bank登陆号:KY406163)。该基因编码的蛋白分子质量为58.02 KDa,理论等电点为5.95。荧光定量PCR分析结果表明,HbICE2主要在叶片和树皮中表达,而且在原生皮中的表达量显著高于再生皮,在抗寒性较强的橡胶树无性系PR107的树皮中表达量显著高于抗寒性弱的橡胶树无性系热研8-79。HbICE2可能在橡胶树树皮应对低温胁迫的反应中起重要的调节作用。     

巴西橡胶树抗坏血酸过氧化酶基因HbAPX的克隆及其对水杨酸的应答

在对橡胶树转录组进行测序的基础上,利用模式植物中抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)基因的氨基酸序列进行比对并设计引物,通过RT-PCR方法扩增巴西橡胶树APX基因的cDNA片段,命名为HbAPX.该片段包含1个858核苷酸的开放阅读框,编码285个氨基酸的多肽.生物信息学分析结果表明...     

巴西橡胶树谷氨酸脱氢酶基因cDNA片段克隆及表达分析

谷氨酸脱氢酶[Glutamate dehydrogenase,(GDH;E.C.1.1.4.2)]在植物处于逆境或胁迫时,发挥着重要的作用,主要功能可能是解除逆境或胁迫条件下高浓度的铵毒害.该研究通过同源克隆从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中获得谷氨酸脱氢酶基因(HbGDH)的部分cDNA片段(GeneBank登录号:DQ672585),基蛋白包含一个谷氨酸脱氢酶保守结构域.BLAST比对表明HbGDH基因与拟南芥(Arabidopis thaliana)、水稻(Oryza sati-va)GDH基因分别有82%、79%的同源率;系统进化树分析发现HbGDH蛋白与拟南芥、水稻GDH蛋白聚为一簇;不同组织的表达分析表明HbGDH基因在胶乳中表达较高,叶片中次之,树皮中最低.     

巴西橡胶树CCaMK基因家族成员的鉴定和表达分析

钙/钙调素依赖型蛋白激酶(CCa MK,calcium-and calmodulin-dependent protein kinase)是一种钙离子结合蛋白,在钙信号传导过程中起重要作用。本研究以已发表的CCa MK序列作为检索序列,对橡胶树和其他5种植物(木薯、水稻、杨树、蓖麻和拟南芥)的基因组和转录组数据进行全面搜索,鉴定得到6个CCa MK基因,其中包括一个橡胶树CCa MK基因,命名为Hb CCa MK1。序列分析发现:5种植物的CCa MK氨基酸序列同源性较高,为73%~94%。基因结构分析发现,Hb CCa MK1和所分析的其他植物CCa MK一样均,含有6个内含子、1个蛋白激酶结构域和3个EF-hand结构域;从结构和进化上看,Hb CCa MK1和蓖麻、木薯2种植物的CCa MK具有较近的亲缘关系;在表达方面,Hb CCa MK1在橡胶树根中表达丰度最高,其次为树叶和花;另外,Hb CCa MK1的表达还与叶片发育、真菌侵染和低温胁迫有关。     

红麻谷胱甘肽还原酶基因(HcGR)的克隆及盐胁迫下表达分析

[目的]克隆红麻谷胱甘肽还原酶基因(HcGR)并分析其组织表达特性及不同盐胁迫下的表达模式,为深入研究HcGR基因在响应盐胁迫的分子调控机制提供理论参考.[方法]基于红麻转录组测序结果,克隆HcGR基因,对其序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR检测HcGR基因在红麻不同组织及不同盐度胁迫[CK(0 mmol/L NaCl)、T1(50 mmol/L NaCl)、T2(100 mmol/L NaCl)和T3(200 mmol/L NaCl)]下的表达情况.[结果]克隆获得的HcGR基因开放阅读(ORF)长度为1698 bp,其编码蛋白相对分子量为60 kD,由555个氨基酸残基组成,理论等电点(pI)为8.46,为亲水性蛋白,定位于叶绿体;HcGR蛋白二级结构以无规则卷曲为主,以α-螺旋、延伸链和β-转角为辅,所占比例分别为44.14%、27.75%、22.16%和5.95%,其三级结构由无规则卷曲、α-螺旋和延伸链3种结构元件相互盘绕而成;该蛋白与榴莲GR蛋白亲缘关系较近.HcGR基因在红麻根、茎和叶中均有表达,且相对表达量存在显著差异(P<0.05,下同),相对表达量排序为叶>根>茎,表明HcGR基因具有明显的组织表达特异性.在红麻的根和叶中,HcGR基因相对表达量随NaCl胁迫浓度增加整体上呈先升高后降低的变化趋势,且均在T1处理下达峰值,显著高于CK、T2和T3处理.HcGR基因在茎中的相对表达量随NaCl胁迫浓度增加呈波动变化趋势,但T1、T2和T3处理均高于CK,其中T1和T3处理显著高于CK.[结论]HcGR基因在红麻根、茎和叶中的表达具有明显组织特异性,且可被不同浓度NaCl诱导响应盐胁迫信号,并通过上调各组织中的转录水平以提高抗盐胁迫能力,故推测该基因在红麻抗盐胁迫机制中发挥重要调控作用.     

巴西橡胶树谷氨酸脱氢酶基因cDNA片段克隆及表达分析

谷氨酸脱氢酶[Glutamatedehy drogenase,（GDH;E.C.1.1.4.2）]在植物处于逆境或胁迫时,发挥着重要的作用,主要功能可能是解除逆境或胁迫条件下高浓度的铵毒害.该研究通过同源克隆从巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）中获得谷氨酸脱氢酶基因（HbGDH）的部分cDNA片段（GeneBank登录号：DQ672585）,其蛋白包含一个谷氨酸脱氢酶保守结构域.BLAST比对表明HbGDH基因与拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryzasativa）GDH基因分别有82%、79%的同源率;系统进化树分析发现HbGDH蛋白与拟南芥、水稻GDH蛋白聚为一簇;不同组织的表达分析表明HbGDH基因在胶乳中表达较高,叶片中次之,树皮中最低.     

橡胶树半胱氨酸蛋白酶基因HbCP2的克隆与表达特性分析

根据EST和基因组序列设计引物,应用RT-PCR技术从橡胶树的根组织中分离到1条长1056bp的cDNA,该序列包含了1023bp的开放读码框（ORF）,17bp的5’ UTR和16bp的3’ UTR;ORF预测编码340个氨基酸,理论分子量为3752kD,等电点为525,属于液泡定位的分泌型蛋白;蛋白含有1个Inhibitor_I29和1个Peptidase_C1A结构域,隶属于木瓜蛋白酶C1家族;蛋白与蓖麻、杨树中同源蛋白的相似性均在80%以上,将基因命名为HbCP2。表达分析显示,在所分析的根、树皮、木质部、芽、叶片、叶柄和乳管等组织中,HbCP2仅在根中被检测到,表现出明显的组织特异性。     

巴西橡胶树HbUBC5基因克隆、生物信息学及表达分析

为研究巴西橡胶树泛素结合酶(UBC)基因功能,采用PCR技术从巴西橡胶树中克隆了一个UBC基因,用半定量RTPCR分析基因表达模式,同时对基因编码蛋白进行生物信息学分析。结果表明,基因长681 bp,最长开放阅读框555 bp,预测编码蛋白包含184个氨基酸;序列比对分析发现,该基因编码的蛋白具有一段保守的UBC结构域,与拟南芥E2成员UBC5(At1g63800)具有较高的相似性,故将该基因命名为HbUBC5。半定量RT-PCR分析结果表明,HbUBC5在巴西橡胶树胶乳中表达最高,在树皮中表达最低。HbUBC5在叶片不同发育时期表达模式存在变化,在古铜期最低,在稳定期最高。与健康橡胶树相比,死皮树胶乳中HbUBC5表达量明显下降。HbUBC5表达还受乙烯和茉莉酸调控。以上结果表明,HbUBC5可能在巴西橡胶树死皮、产排胶、乙烯和茉莉酸反应中发挥作用。     

巴西橡胶树MADS-27基因的克隆与生物信息学分析

以巴西橡胶树花芽为材料,利用RT—PCR技术从总RNA中扩增获得1个MADS基因。eDNA长度1063bp．开放阅读框717bp,编码239个氨基酸．命名为HbMADS-27。在HbMADS-27氨基酸序列中具有1个较强的跨膜区,二级结构分析结果表明其属于混合型蛋白。HbMADS-27在N端前34-50氨基酸区域内为较强的疏水区,但整条多肽链表现为亲水性。对20个MADS蛋白进行系统进化分析,结果发现,巴西橡胶树的HbMADS-27基因与蓖麻的MADS-27基因亲缘关系最近,而与拟南芥MADS-27基因亲缘关系相对较远。     

巴西橡胶NBS类抗病基因同源序列的克隆与分析

[目的]探讨巴西橡胶NBS类抗病基因同源序列的克隆与序列分析。[方法]以高抗炭疽病的巴西橡胶无性系R042为材料,根据抗病基因Prf、L6、N等的P．100p和GLPL保守结构域设计简并引物,从R042扩增具有抗病基因同源序列的片段,对分离获得的抗病基因同源序列进行Blastn、氨基酸同源性分析、序列比较和系统进化分析。[结果]从巴西橡胶高抗炭疽病无性系R042基因组DNA中分离获得1个NBS类抗病基因同源序列,经Blastn比对后发现,该抗病基因同源序列与毛果杨中的一个CC—NBS—LRR抗病蛋白的mRNA的序列同源性为66％,Blastn的E值为2e-24,推测氨基酸序列与已知抗病基因的相似性在26．9％～43．2％。[结论]序列比对与系统进化分析表明,该抗病基因同源序列具有NBS类抗病基因的所有保守序列,且与Xal的亲缘关系最近。     

橡胶树Lhcb2基因的克隆与表达特性分析

基于从基因组中获得的基因序列,应用RT-PCR技术从橡胶树叶片中分离得到1条849bp的cDNA;该cDNA包含1个798bp的ORF,编码265个氨基酸,理论分子量为2866kD,等电点为542,属于叶绿体定位的类囊体膜蛋白;蛋白含有3个跨膜螺旋,2个C端螺旋,1个保守的捕光叶绿素a/b结合蛋白结构域,1个三聚化基序,以及多个类胡萝卜素和叶绿素结合位点,根据进化关系可归为LHCB2亚家族;蛋白与蓖麻、野草莓、可可、葡萄和棉花中同源蛋白的一致性均接近95%,在进化上显示出高度的保守性,将基因命名为HbLhcb21。表达分析显示,HbLhcb21倾向于在叶片中表达,且其转录水平随着叶片的成熟而逐渐增加,但随着叶片的衰老而明显下调。     

巴西橡胶树LIM结构域基因克隆与生物信息学分析

根据乙烯利刺激巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳差异表达cDNA文库的EST序列信息,利用RACE技术从胶乳中成功克隆了1个含有LIM结构域的未知功能新基因HbLIM的全长cDNA。生物信息学分析表明,该基因全长cDNA由1016bp的碱基组成,拥有1个570bp的开放阅读框编码189个氨基酸残基;推测氨基酸序列富含Lys,Ser,Ala和Leu,含有2个LIM结构域和2个N-豆蔻酰化位置。序列相似性分析表明,HbLIM编码的氨基酸序列与蓖麻、杨毛、葡萄相应的LIM基因的相似性高达98%,95%和92%。这些研究结果为深入探讨LIM结构域蛋白在巴西橡胶树乳管发育及乳管代谢中的功能奠定了基础。     

橡胶树乳管表达多酚氧化酶基因HbPPO1的克隆与分析

根据EST序列设计引物,应用RACE和RT-PCR技术从橡胶树的胶乳（乳管细胞的胞质成分）中分离到1条长2102bp的cDNA,该序列包含1个1803bp的开放读码框（ORF）,81bp的5’UTR和218bp的3’UTR;ORF预测编码600个氨基酸,其理论分子量为6788kDa,等电点为856,质体定位;蛋白含有多酚氧化酶特有的Tyrosinase、PPO1_DWL和PPO1_KFDV结构域;蛋白与木薯、蓖麻、麻疯树和胡杨中同源蛋白的相似性分别为852%、820%、798%和782%,将基因命名为HbPPO1。结果表明,在所分析的胶乳、树皮和叶片组织中,基因在胶乳中的表达丰度最高,且其表达水平受乙烯利显著抑制。