雷帕霉素通过促进自噬提高小鼠iPSCs诱导效率

【目的】雷帕霉素(Rapamycin)可以激活和促进细胞的自噬过程。探明在体外培养系统中添加雷帕霉素,检测是否可以通过促进自噬过程提高iPSCs诱导效率。【方法】在iPSCs诱导过程的1~3d和4~6d分别加入雷帕霉素,检测自噬现象,同时对iPSCs诱导过程中多能性基因表达进行检测,统计原代iPSCs克隆数等,评价雷帕霉素对iPSCs重编程的影响;在iPSCs的培养过程中分别加入50nM/L和100nM/L的雷帕霉素处理。【结果】使用浓度为50nM/L和100nM/L的雷帕霉素处理,可以提高iPSCs的诱导效率。50nM/L浓度处理,重编程效率较高【结论】雷帕霉素在iPSCs重编程过程中可以促进自噬,提高Nanog表达水平,抑制p53表达,进而提高iPSCs诱导效率。     

细胞焦亡调控肿瘤免疫微环境的分子机制研究进展

为探究细胞焦亡在肿瘤免疫微环境中的分子机制,收集国内外最新文献资料,对小动物肿瘤现状、细胞焦亡、诱导细胞焦亡的蛋白家族和其在肿瘤免疫微环境中的作用机制进行阐述。结果表明:1)细胞焦亡是由Gasdermins(GSDMs)家族蛋白所介导的可调节的细胞程序性死亡,GSDMs被蛋白酶水解激活,切割形成N端(具有成孔活性),在细胞膜上打孔,导致渗透性细胞裂解,从而将促炎分子释放到细胞外,引发炎症和免疫反应,对肿瘤微环境的调节有重要意义;2)细胞发生焦亡时会不断胀大破裂,释放细胞内容物,其产生的炎性环境可以招募细胞毒性T细胞(CD8+T)、巨噬细胞和NK细胞等免疫细胞杀死和吞噬肿瘤细胞,抑制髓源性抑制细胞(MDSC);3)细胞焦亡将肿瘤免疫微环境激活为免疫刺激状态,使其由“冷”转“热”,抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移,靶向治疗肿瘤疾病,降低患病宠物的死亡率。综上,诱导细胞焦亡和调控肿瘤免疫微环境为抗肿瘤治疗提供了新思路,细胞焦亡分子生物学机制的深入研究有望为宠物临床提供一种前景广阔的新型治疗方法。     

芹菜素对LPS诱导小鼠急性肺损伤的保护作用

[目的]揭示芹菜素的抗炎作用机制.[方法]通过建立小鼠模型,研究芹菜素对LPS诱导急性肺损伤的保护作用.[结果]芹菜素可以降低LPS诱导的肺组织损伤和肺组织MPO活性.与LPS组相比,芹菜素治疗组可以显著降低肺泡盥洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平,并抑制NF-κB信号通路的激活.[结论]芹菜素可以通过抑制NF-κB的激活并降低炎性细胞因子的水平,从而对小鼠急性肺损伤产生抗炎保护作用.     

三氯生通过诱导巨噬细胞非mTOR途径自噬加强胞内菌杀伤

为了研究三氯生能否引起细胞自噬并探讨其可能的诱导通路,揭示三氯生作为抗菌药物的新作用机制,利用免疫荧光、菌落计数、免疫印迹等技术检测经三氯生处理过细胞的自噬水平、相关蛋白表达量的变化及杀菌能力的改变。结果表明:三氯生能引起Hela细胞和Raw264.7细胞的自噬,并且该自噬为完全自噬。三氯生诱导的小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞自噬依赖的是胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)途径,而非经典的雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,m TOR)途径。此外,三氯生通过该作用机制加强了巨噬细胞对胞内菌的杀伤作用。研究表明,三氯生诱导自噬的现象在细胞中普遍存在,自噬在对抗病原微生物中起到重要作用,诱导自噬是三氯生作为抗菌药物的新作用机制。     

小鼠STEAP4对HepG2细胞自噬的调控机制

为研究机体内稳态调节机制,经筛选高脂小鼠转录组数据得到特异上调的Steap4基因,对其进行不同物种间基因多态性比较,并在HepG2细胞中异源超表达该基因24 h后检测自噬相关基因在转录和翻译水平的变化。结果显示,STEAP4基因在不同物种间较保守,其基因多态性主要在翻译水平产生变化,小鼠Steap4基因与人源STEAP4基因相似性最高。荧光定量PCR的结果表明mSTEAP4对HepG2自噬关键基因无显著性影响,但Western blot结果显示mSTEAP4能够下调自噬相关蛋白的表达量,即mSTEAP4从蛋白水平抑制HepG2细胞自噬水平。STEAP4在细胞处于内稳态时会抑制自噬,降低细胞中的物质能量代谢,使细胞处于静息状态。     

赭曲霉毒素A促进PCV2复制的自噬机制研究

为研究赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)诱导自噬的信号通路机制,通过药物的特异性抑制信号通路中不同激酶的活性,探讨特异性激酶抑制剂在OTA诱导的自噬及猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)复制促进中的作用。结果表明:1)OTA能够抑制PCV2感染猪肾细胞株(PK-15)中的蛋白激酶B(AKT)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的活性,从而增强自噬能力;2)胰岛素能够逆转OTA引起的AKT与mTOR磷酸化水平的降低,能够逆反OTA诱导产生的自噬以及PCV2的复制促进;3)OTA能够激活细胞外信号调节激酶1/2(extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)信号通路;4)ERK1/2的抑制剂(U0126)通过降低ERK1/2的磷酸化水平,从而抑制了OTA诱导的自噬及PCV2的复制促进;5)U0126能够减少OTA引起的mTOR磷酸化水平降低的幅度。     

黄曲霉毒素B1诱导MEK/ERK/ROS介导的巨噬细胞自噬反应

为研究黄曲霉毒素B1(AFB1)能否诱导细胞自噬,并初步探讨其可能的作用机制。利用免疫荧光、酶标仪检测、免疫印迹等技术检测经AFB1处理过的细胞的自噬水平、相关蛋白的表达量以及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生情况。结果表明:AFB1能够引起RAW264.7细胞和Hela细胞的自噬反应,并且该自噬为完全自噬。AFB1诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7自噬是依赖细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)途径发生的,并受ROS的调节。此外,发现AFB1诱导ROS产生呈浓度依赖性,而ROS抑制剂同时抑制了ROS和自噬发生,但自噬抑制剂并没有有效地抑制ROS的产生,表明ROS处于AFB1诱导自噬的上游,对自噬起到调节作用。这表明AFB1诱导的自噬现象在细胞中普遍存在,而自噬作为机体的免疫机制,在抵抗AFB1毒力侵染的过程中发挥重要作用。     

mTOR抑制剂对胞内李斯特菌繁殖的影响

为了检测mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin)对单核细胞增生李斯特菌(Lm)在小鼠脑微血管内皮细胞内存活的影响,将不同浓度抑制剂雷帕霉素与细胞共同孵育,然后将Lm分别感染细胞,细菌菌落计数法计算胞内细菌数量,MTT法检测抑制剂雷帕霉素对细胞活性的影响,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抑制剂雷帕霉素对Lm介导的IFN-γ和IL-6分泌的影响,利用试剂盒检测caspase-1活性。结果表明:抑制剂雷帕霉素在5、10、25 nmol/L浓度时不影响细胞活性,雷帕霉素显著抑制了Lm在细胞,且与雷帕霉素浓度和感染时间相关,雷帕霉素显著提高了Lm介导的IFN-γ、IL-6、caspase-1、IL-1β和NLRP3的mRNA水平。结论:本研究表明,mTOR抑制剂雷帕霉素可调控细胞内Lm的存活,雷帕霉素可增强Lm介导的细胞炎性体水平,为Lm引起脑膜炎的致病机制提供科学依据。     

自噬对DON诱导仔猪海马神经细胞损伤的影响

[目的]本试验旨在研究自噬对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)诱导仔猪海马神经细胞损伤的影响。[方法]以不同质量浓度DON(0,125,250,500,1 000和2 000 ng·mL~(-1))处理对数生长期仔猪海马神经细胞24 h后,采用倒置显微镜、透射电镜观察DON对仔猪海马神经细胞形态和超微结构的影响;采用p EGFP-LC3质粒瞬时转染细胞,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的分布情况;采用Western blot检测DON对仔猪海马神经细胞自噬标志性蛋白LC3的表达;通过添加自噬激活剂雷帕霉素(RAP)和自噬抑制剂氯喹(CQ)来升高和降低细胞的自噬水平,CCK-8法检测细胞的存活率。[结果]不同质量浓度的DON均可诱导细胞自噬,自噬水平随着DON浓度的增加先上升后下降,在1 000 ng·mL~(-1)时达到峰值。与对照组相比,DON可显著抑制细胞存活率并诱导细胞发生明显的形态学变化,并呈剂量依赖性;随着DON浓度的升高,细胞LC3-Ⅱ含量先上升后下降,1 000 ng·mL~(-1)时,LC3-Ⅱ含量最高,差异显著或极显著(P0.05或P0.01)。与DON处理组相比,自噬水平的上升显著提高细胞活性(P0.05),而自噬水平的下降显著降低细胞活性(P0.05)。[结论]DON可以引起仔猪海马神经细胞自噬水平的上升,激活的自噬对DON导致的细胞损伤具有一定的保护作用。     

油茶皂苷W抗肿瘤活性研究

为了给开发新型抗肿瘤药物提供科学依据,对油茶皂苷W的体内外抗肿瘤活性进行了探讨。体外采用MTT法、Gimesa染色法、流式细胞术、Western Blot等现代药理学方法检测油茶皂苷W体外抑制肿瘤细胞增殖及其作用机制;体内通过建立肝癌H22荷瘤小鼠模型,腹腔注射不同浓度的油茶皂苷W以验证其体内抗肿瘤药效,取肿瘤组织采用HE染色与透射电镜分别观察其形态与超微结构的变化。体外试验结果表明油茶皂苷W可以明显抑制人非小细胞肺癌细胞的增殖,且能够诱导肿瘤细胞发生自噬;体内试验结果表明油茶皂苷W具有良好的抗肿瘤药效,肿瘤组织出现坏死与凋亡的特征。因此,油茶皂苷W具有良好的体内外抗肿瘤活性,其抗肿瘤作用机制可能与诱导肿瘤细胞发生凋亡与自噬有关。     

急性热应激对鹅组织中NLRP3炎性小体基因表达的影响

本试验旨在研究NLRP3炎性小体在鹅热应激损伤中的作用.将27只雏鹅分为A、B和C 3组,对照组A组环境温度设为25 ℃,热应激组B组和C组分别在38 ℃和40 ℃环境下热处理1 h.采集各组雏鹅的脑、肝脏、脾脏、肺脏、空肠等组织,将A组和C组的组织制作切片进行病理学观察,并提取各组所有组织的RNA、反转录后通过荧光定量PCR法对NLRP3信号途径相关基因及下游炎症因子表达水平进行检测,并对A、B、C各组雏鹅静脉采血,用ELISA对血清中IL-1β的含量进行检测.组织切片结果显示,40 ℃热应激组的肝脏、脾脏、肺脏、空肠等组织出现明显的显微结构损伤和炎症细胞聚集增多.荧光定量结果显示热应激促进了HSP70和HSP90基因的表达,38 ℃热应激组NLRP3、ASC、Caspase-1在脾中表达水平显著高于对照组（P<0.05),IL-1β在肺组织中的表达量显著高于对照组(P<0.05),血清中IL-1β的含量也显著升高(P<0.05).试验表明热应激导致雏鹅组织炎症的发生,NLRP3炎性小体可能参与热应激处理导致的脾脏和肺脏的炎症损伤过程.     

丝裂原活化蛋白激酶抑制剂对脓毒症大鼠肺损伤的保护作用

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)活化与脓毒症大鼠肺组织和血浆肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达及组织炎症反应的关系。方法采用盲肠结扎穿孔术(CLP)模型制造大鼠腹腔感染。随机将56只大鼠分为正常对照组、CLP组和CLP+MAPK抑制剂(SB203580)处理组,各组又分不同时间点亚组。采用反转录多聚酶链式反应和酶联免疫吸附试验检测试剂盒分别测定血浆和肺TNF-αmRNA和蛋白水平;同时测定肺髓过氧化酶(MPO)活性、HE染色病理切片检测肺组织炎症反应程度。结果与正常大鼠相比,CLP后各时间点肺血浆和肺组织TNF-αmRNA、蛋白含量均升高明显;同时肺MPO和组织病理学评分升高明显。MAPK抑制剂处理后,与CLP组相应时间点相比,MPO和病理学评分均显著下降;TNF-αmRNA表达和蛋白含量同时显著降低。结论抑制MAPK活化可缓和脓毒症所致大鼠肺组织炎症反应,减轻肺组织损伤。     

血清淀粉样P成分转基因小鼠模型的建立

目的:建立可表达血清淀粉样P成分(SAP)转基因小鼠模型,以研究SAP基因的功能。方法:采用基因重组技术将SAP基因插入到pCMV-Tag5A真核表达载体上。经BciVI限制性内切酶酶切后,琼脂糖凝胶电泳回收2.7 kb目的片断,受精卵原核显微注射法将其注入雄原核,制备转基因小鼠。采用PCR法在基因水平筛选SAP转基因小鼠阳性小鼠;免疫沉淀法结合免疫印迹法在蛋白水平检测SAP基因在PCR阳性转基因小鼠中的表达情况。结果:成功构建了pCMV-Tag5A/mSAP真核表达载体。经显微注射法将2.7 kb线性目的基因片断注射入受精卵雄原核,移植入代孕母鼠,所生127只小鼠,其中PCR鉴定获得10只转基因阳性小鼠。免疫沉淀法和免疫印记法随机检测83#♂founder、7#♀founder与C57 BL/6J小鼠回交F1代PCR阳性转基因小鼠血清中外源SAP基因蛋白水平的表达,发现均有表达。结论:该研究以C57BL/6J小鼠为研究对象,成功地产生能稳定遗传SAP基因的过表达转基因小鼠模型,它将有利于研究SAP基因在炎症、淀粉样沉淀、自身免疫系统中的作用。     

TBHQ对鸡舍PM2.5诱导鸡胚肺组织细胞焦亡、坏死和炎症损伤的影响

【目的】探讨特丁基对苯二酚(tert-Butylhydroquinone,TBHQ)对鸡舍细颗粒物(fine particulate matter,PM_2.5)诱导鸡胚肺损伤的缓解作用及机制，为预防和缓解鸡舍PM_2.5污染引起的鸡呼吸道健康问题提供理论依据。【方法】选用14日龄鸡胚作为研究对象，首先建立鸡舍PM_2.5诱导鸡胚肺组织损伤模型，再利用鸡胚肺损伤模型研究TBHQ的缓解作用。在建立鸡舍PM_2.5诱导鸡胚肺组织损伤模型试验中，选取不同浓度的PM_2.5(0、0.25、0.5、1 mg·mL^-1)在14日龄鸡胚卵白处注射，5 d后，观察鸡胚存活率以及鸡胚肺组织形态，选取合适的PM_2.5处理浓度(0.25 mg·mL^-1)，建立鸡胚肺损伤模型。在TBHQ对PM_2.5诱导鸡胚肺损伤的影响试验中，将14日龄鸡胚分为对照组(生理盐水)、PM_2.5组(0.25 mg·mL     

鸡大肠杆菌1型菌毛单克隆抗体的研制

将菌毛化的大肠杆菌C600（fim^ ）经0.3%甲醛灭活后作为免疫原，经淋巴细胞杂交瘤技术，用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选获得1F4－1和2C32株抗F1菌毛a或b因子抗原单抗和1株抗F1c因子抗原单抗，它们均为IgG1。免疫印迹试验结果表明：3株单抗均能同禽大肠杆菌1型菌毛反应，识别分子质量为17ku左右的菌毛蛋白。同时对沙门氏菌及猪源大肠杆菌进行检测，结果均无交叉反应性，说明禽病原性大肠杆菌F1菌毛与沙门氏菌1型菌毛及猪大肠杆菌粘附素之间存在很大差异。     

伏马毒素B1对猪体外成熟卵母细胞凋亡与自噬的影响

【目的】探究伏马毒素B₁（fumonisin B₁,FB₁）对猪卵母细胞体外成熟的影响及其潜在的作用机制, 为临床有效防治FB₁所致的生殖毒性损伤提供理论参考。【方法】采集猪卵丘-卵母细胞复合体（cumulus oocyte complexes, COCs）进行随机分组,在体外成熟培养过程中分别用不同浓度FB₁（0、10、20和30 μg·mL^-1）处理44 h后,统计卵母细胞第一极体（first polar body, PB1）排出和激活后胚胎发育情况;通过免疫荧光染色结合共聚焦显微镜技术进一步检测FB₁对卵母细胞减数分裂进程和细胞骨架结构的影响;为进一步探究FB₁对猪卵母细胞毒性损伤的作用机制,分别采用JC-1、Annexin V-FITC和LC3A/B荧光染色检测各组卵母细胞内线粒体功能、早期凋亡和自噬水平,并在此基础上,进一步通过Western blotting分析了凋亡/自噬相关蛋白的表达情况。【结果】FB₁处理对卵母细胞成熟具有明显的抑制作用,PB1排出率呈浓度依赖性下降,当FB₁浓度达到20 μg·mL^-1以上时,PB1排出率显著降低（P<0.01）,并使卵母细胞孤雌激活后胚胎的卵裂率及囊胚率均显著降低（P<0.01）,对卵母细胞的发育潜力有一定的损伤作用。细胞周期分析结果表明,FB₁处理还会导致减数分裂周期进程紊乱,使阻滞在生发泡破裂期（germinal vesicle breakdown,GVBD）的卵母细胞比例显著升高（P<0.01）成功发育至第二次减数分裂中期（metaphase II,MII）细胞比例明显下降（P<0.01）,同时,卵母细胞中纺锤体异常的比例显著升高（P<0.01）、胞膜上的微丝分布显著减少（P<0.05）。进一步的研究结果表明,与对照组相比,FB₁处理组卵母细胞线粒体膜电位明显降低（P<0.05）,线粒体功能受损,同时,FB₁处理组卵母细胞早期凋亡率显著增加（P<0.01）,细胞自噬水平也显著升高（P<0.01）。Western blotting分析结果显示,FB₁处理组卵母细胞中促凋亡蛋白BAX和自噬蛋白LC3A/B II的表达均显著上调（P<0.05）,抑凋亡蛋白BCL2的表达显著下调（P<0.05）,提示早期凋亡和自噬的发生。【结论】FB₁对猪卵母细胞体外成熟及其激活后胚胎发育具有明显的毒性损伤作用,致使减数分裂周期阻滞,纺锤体结构紊乱、微丝分布减少和线粒体损伤,其毒性作用机制与诱导卵母细胞凋亡和自噬有关。     

蒲公英提取物对急性肺损伤小鼠炎症介质及SOD含量的影响

[目的]研究蒲公英水提物对脂多糖LPS诱导小鼠急性肺损伤（ALI）炎症介质及抗氧化能力的影响。[方法]LPS滴鼻建立小鼠ALI模型,设空白组、模型组、蒲公英剂量（2.5、5.0、10.0 mg/kg）组和地塞米松（0.5 mg/kg）组。测定肺组织中超氧化物岐化酶SOD含量,检测肺泡支气管灌洗液中INF-γ、NO、PGE2含量。[结果]蒲公英水提物可增强LPS诱导的ALI小鼠肺组织SOD的释放,降低BALF中炎症介质INF-γ、NO、PGE2的含量。[结论]为蒲公英的开发利用提供理论依据。     

卵形鲳鲹RelB蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】制备卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）RelB蛋白（TroRelB）多克隆抗体,为深入研究TroRelB蛋白的结构、功能及蛋白—蛋白相互作用打下基础。【方法】将TroRelB基因与pET-32a表达载体连接构建pET-32a-TroRelB重组质粒,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受态细胞,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,以Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化的TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠制备多克隆抗体,应用ELISA和Western blotting分别检测抗体效价及特异性。【结果】以构建的pET-32a-TroRelB重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导能成功表达获得TroRelB重组蛋白,其相对分子量为84.0 kD,且主要以包涵体的形式进行表达。经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化透析的TroRelB重组蛋白浓度为0.498 mg/mL,能被抗His标签抗体识别。以纯化TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗TroRelB血清（多克隆抗体）,ELISA检测结果显示其抗体效价为1:256000;Western blotting检测结果显示,5和15 ng的TroRelB重组蛋白均可特异性结合TroRelB多克隆抗体,而阴性对照（免疫前血清）未出现预期条带。【结论】原核系统诱导表达的TroRelB重组蛋白主要以包涵体的形式进行表达,且携带有His标签,以其免疫Balb/C小鼠制备获得的TroRelB多克隆抗体具有较强的特异性和较高的抗体效价,可用于深入研究TroRelB蛋白的生物学功能及揭示卵形鲳鲹的免疫机制。