水稻HL-CMS细胞质雄性不育基因的体外转录及Northern Blot检测

[目的]通过基因克隆和体外转录技术获得水稻红莲型细胞质雄性不育(HL-CMS)不育系粤泰A(YTA)中的2个细胞质雄性不育基因orf216和orfH79的RNA,为Northern Blot检测提供阳性定量标准品,并可作为凝胶阻滞试验的底物,用于研究与恢复基因编码产物的相互作用,从而为阐释不育基因与恢复基因的相互作用分子机制奠定基础。[方法]以红莲型胞质雄性不育基因orf216和orfH79的特异引物,利用不育系YTA为材料,PCR扩增获得相应片段,分别连接至pGEM-T Easy质粒并筛选阳性重组质粒,测序鉴定后酶切线性化,补平粘性末端,以rN4为底物、用依赖于DNA的RNA聚合酶进行体外转录,转录产物用DNase处理除去DNA模板,纯化并测定RNA浓度,并用Northern Blot验证。[结果]获得了细胞质雄性不育基因orf216和orfH79各自的RNA,经检测orf216浓度为1.286μg/μl,A260/A280为2.01;orfH79浓度为1.006μg/μl,A260/A280为2.10。[结论]运用体外转录技术获得的RNA片段条带单一,纯度较高,可用于体外大量获取目的 RNA。     

水稻新型胞质不育系L-orfH79与其同核异质YTA的比较

[目的]验证新型细胞质不育系L-orfH79与其同核异质的近等基因系HL-CMS YTA的区别。[方法]用orfH79和orf290这2种分子标记对L-orfH79和YTA进行分子鉴定,并比较其花粉染色特性、花粉育性、结实率及orfH79表达量。[结果]分子标记鉴定结果显示L-orfH79只含有不育基因orfH79、不含有orf290,YTA同时含有orfH79和orf290。L-orfH79花粉的淀粉沉积比YTA更少,L-orfH79花粉大小均匀,而YTA的花粉形态不一。L-orfH79花粉育性、套袋结实率及自然结实率(都低于10%)略高于YTA(都低于5%)。当L-orfH79中引入恢复基因Rf5或者Rf6后花粉形态和颜色都恢复正常。抽穗期L-orfH79剑叶中的orfH79表达量低于YTA,在L-orfH79中引入Rf5或者Rf6后会减少orfH79的表达量。[结论]L-orfH79是不同于YTA的新型细胞质雄性不育系,L-Rf5、L-Rf6可作为其恢复系。     

红莲型CMS水稻线粒体K+ATP通道特性的初步研究

以水稻红莲型细胞质雄性不育(HL-CMS)不育系粤泰A(YTA)和保持系粤泰B(YTB)黄化苗线粒体为材料,研究了YTA和YTB离体线粒体KA TP通道对其诱导调节剂KCl、ATP、ADP和GTP等的响应特性。结果表明,KA TP通道诱导剂KCl,能明显诱导YTA和YTB线粒体膨胀,但YTA的膨胀程度较YTB的明显;KA TP通道的内源性抑制剂ATP对YTA和YTB线粒体膨胀起显著抑制作用;KA TP通道的内源性激动剂ADP和GTP引起的不育系YTA离体线粒体短暂收缩及之后的再膨胀程度均较YTB的明显;此外,比较YTA和YTB离体线粒体在Rh123一起孵育10 min后,KCl和解偶联剂FCCP处理引起的离体线粒体膜电位(Δψm)下降过程,发现前者的线粒体Δψm较后者的易于过早崩解。对水稻HL-CMS不育系YTA和可育的保持系YTB线粒体KA TP通道特性的比较研究表明,水稻HL-CMS不育系YTA线粒体KA TP通道对其诱导调节剂KCl、ATP、ADP和GTP等的响应较YTB的更敏感。     

分子标记辅助构建同质同核近等基因恢复系L-Rf5

红莲型水稻恢复系9311中有2个红莲型恢复基因Rf5和Rf6,不育系YTA中有2个不育基因orfH79和orf216;为了研究2个恢复基因与2个不育基因之间的互作关系,将红莲型水稻不育系YTA与恢复系9311杂交,杂种后代再以YTA为轮回亲本回交8代;根据Rf5基因序列设计特异分子标记,并对L-Rf5进行检测,结合花粉镜检结果,筛选出只含Rf5的纯合株系,多代自交后其表型一致,说明纯合株系L-Rf5构建成功;对近等基因恢复系的不育基因orfH79和orf216的表达量进行分析,结果显示:L-Rf5中orfH79的表达量较YTA明显下降;纯合的L-Rf5比杂合的L-Rf5不育基因orfH79的表达量稍低;L-Rf5中orf216的表达量较YTA下降并不明显。同时克隆了YTA、9311、近等基因恢复系中Rf1B序列,发现它们之间没有差异。     

水杨酸对HL-CMS同核异质系水稻叶片蛋白质及细胞壁成分的影响

分别用3种不同浓度的水杨酸(SA,3.25×10-5,7.5×10-5,1.5×10-4mol/L)处理水稻红莲型细胞质雄性不育(HL-CMS)型不育系粤泰A(YTA)和同核异质的保持系粤泰B(YTB)的三叶期幼苗,研究了幼苗叶片蛋白质含量及细胞壁纤维素和木质素含量的变化。结果表明,外源SA对水稻HL-CMS不育系和保持系的作用效果明显不同。3种浓度的SA均对YTA叶片蛋白质含量的增加起一定的促进作用,其中高浓度SA (1.5×10-4mol/L)的促进作用最为显著,但高浓度的SA对YTB则表现出抑制作用。与对照组(木村B培养液处理)相比,3.25×10-5mol/L和7.5×10-5mol/L的SA均能增加YTA三叶期幼苗叶片中细胞壁纤维素含量,而较高浓度(1.5×10-4mol/L)SA处理的作用不明显。对于YTB,只有较高浓度(1.5×10-4mol/L)的SA 对幼苗叶片细胞壁纤维素含量表现出明显的增加作用,3.25×10-5和7.5×10-5mol/L的SA处理没有明显的影响。YTA和YTB幼苗叶片细胞壁木质素含量的变化对SA的响应浓度有所不同,在较高浓度范围的SA能增加YTB幼苗叶片细胞壁木质素含量,而较高浓度范围的SA对YTA幼苗叶片细胞壁木质素则表现为抑制效应,SA仅在较低浓度范围有促进作用。同核异质系YTA和YTB间叶片蛋白质、纤维素和木质素含量的变化对外源SA处理的响应不同,可能只与YTA和YTB细胞质之间的差异有关。     

水稻线粒体基因orf290功能的初步研究

从红莲型不育系粤泰A(YTA)线粒体基因组中克隆并鉴定了一个6.7kb的CMS相关片段HLsp1,序列预测发现了2个orf,其中一个编码290个氨基酸,暂命名为orf290。构建带有线粒体信号肽的超表达载体35S::Rf1b5'::orf290,通过农杆菌介导转化受体保持系粤泰B(YTB),以水稻的单拷贝基因蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)作为内参基因,以潮霉素抗性基因(hpt)作为目的检测基因,基于实时荧光定量PCR鉴定转基因T0代植株中外源基因的拷贝数,并对阳性植株进行花粉镜检和结实率统计。结果显示获得了2株单拷贝转35S::Rf1b5′::orf290植株,并且都有orf290的表达。单拷贝超表达orf290植株的平均花粉可育度30.8%,平均套袋结实率41.6%。这些结果初步证实,线粒体基因orf290可能与水稻细胞质雄性不育相关。     

马协和红莲型细胞质雄性不育水稻苗期ATPase同工酶分析

马协和红莲型细胞质雄性不育水稻亲本之间、亲本和Ｆ１之间的ＡＴＰａｓｅ同工酶比较结果表明：①马协不育系和红莲型粤泰不育系分别两种不同的细胞质雄性不育类型；②依据ＡＴＰａｓｅ同工酶４、５、７、９分别在马协 ６３、马协保持系和马协不育系中的特异表达，可在苗期对其进行纯度鉴定。     

水稻红莲型细胞质雄性不育基因orfH79的表达对细菌生长的抑制

orfH79是水稻红莲型细胞质的雄性不育基因.为了进一步研究其分子机理,在大肠杆菌中分别构建水稻红莲型细胞质雄性不育基因ofH79的原核表达载体pET-28a -orfH79和pGEX5x -2 - orfH79.分别转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)后利用IPTG诱导分析其表达产物对细菌生长的影响,结果表明PET -...     

2个育性恢复基因Rf1a和Rf1b在红莲型水稻中的表达量分析

[目的]探究红莲型水稻细胞质雄性不育(CMS)与不同恢复基因之间的作用模式。[方法]利用特异性引物结合荧光定量PCR技术,在红莲型水稻近等恢复基因系L-Rf5、L-Rf6,恢复系9311和不育系粤泰A(YTA)中检测2个包台型恢复基因Rf1a和Rf1b的表达量。[结果]Rf1a在L-Rf5、L-Rf6、9311中都能表达,而Rf1b只能在部分材料或部分组织中表达。对同一时期二者的表达量分析发现,L-Rf5和9311的相同组织中Rf1a表达水平显著高于Rf1b,L-Rf6叶片中Rf1a的表达量则低于Rf1b。[结论]该研究结果对研究红莲型恢复系的遗传多样性具有一定的参考价值。     

红莲型细胞质雄性不育恢复品种的筛选与分类

以红莲型细胞质雄性不育系粤泰 A为母本与不同品种杂交 ,调查了 5 2个组合 F1 的花粉育性和小穗育性。结果表明 :这些品种对红莲型细胞质不育的恢复类型较为复杂 ,在所研究的品种中 ,只有 5 .77%的品种对红莲型细胞质不育系具有保持能力 ,其余则对红莲型细胞质不育系具有一定的恢复能力 ,这些对红莲型细胞质不育系具有恢复能力品种在恢复力上也存在一定的差异 ;就对红莲型细胞质不育系具有恢复能力品种的分布而言 ,这些品种的分布范围较广 ,类型较复杂     

几类小麦雄性不育系育性敏感期的可溶性蛋白质变化研究

[目的]研究几种小麦雄性不育系育性敏感期的可溶性蛋白质含量变化。[方法]以2种K型小麦雄性不育系及保持系和YS型温敏不育系为材料,对花粉发育过程中倒二叶和花药中可溶性蛋白质含量进行研究。[结果]不育系花药中蛋白质含量从减数分裂期至单核期呈上升趋势,而单核期至三核期呈下降趋势,且单核期至二核期下降速率最快;保持系在单核期至三核期蛋白质含量下降较不育系缓慢,整个时期可溶性蛋白质含量明显低于保持系;不育系和保持系叶片中可溶性蛋白质含量在整个生育期变化没有花药中变化明显;K型不育系和YS型温敏不育系蛋白质含量差异不明显;不育系可溶性蛋白质含量显著下降。[结论]蛋白质合成受阻或较多的蛋白质降解会导致生理代谢紊乱,花粉正常发育受到阻碍。     

温敏雄性不育系小麦BNS败育的细胞学观察

[目的]为了明确温敏雄性不育系小麦BNS雄性败育的细胞学机制.[方法]采用醋酸洋红染色对温敏雄性不育系小麦BNS花粉母细胞减数分裂和小孢子发育过程进行细胞学观察,采用浓度1％I2-KI溶液染色法进行花粉育性统计.[结果]BNS不育系在减数分裂过程中异常,中期Ⅰ出现染色体滞后现象;二分体时期细胞质分配不均匀,染色体靠边,没有在细胞中央;四分体时期子细胞大小不一,其子细胞存在落后染色体,有的二分体经过第2次分裂没有形成4个子细胞,而是分成3个子细胞;小孢子发育过程中观察到单核靠边期,未能发育到双核期和三核期,还出现空孢现象;开花期的花粉彻底败育.而扬麦13能形成正常的二核期和三核期,花粉可育.[结论]减数分裂过程中出现的异常行为是导致BNS花粉败育的原因之一.单核期是其败育的关键时期.     

大豆光敏雄性不育株88-428BY-827小孢子母细胞的细胞学观察

 以长光照条件下的大豆光敏雄性不育88-428BY的雄性可育株为对照,对其短光照条件下的雄性不育株进行了小孢子母细胞减数分裂的观察。结果表明,88-428BY-827雄性不育株花粉败育在发育各个时期都发生。88-428BY-827雄性不育株小孢子母细胞减数分裂的染色体的行为出现了多种类型的异常现象:联会异常、单价体、三价体、染色体落后、染色体粘连、染色体桥、染色体不均等分离等;单核小孢子阶段小孢子饱满、细胞核内染色体明显且超出正常的染色体数目;少数小孢子的萌发孔为4个;成熟的花粉粒大小不等、形状不规则、甚至形     

萍乡显性核不育水稻不育株与可育株同工酶比较分析

对萍乡显性核不育水稻纯合不育株、杂合不育株和隐性可育株幼穗发育期的叶片、幼穗和花药中3种同工酶表达进行了比较分析，结果表明：叶片中，不育株（纯合与杂合）与可育株的酯酶（EST）、过氧化物酶（POD）、细胞色素氧化酶（COD）的同工酶酶谱未见差异，且在幼穗发育的不同时期也基本相同；幼穗中，不育株（纯合与杂合）与可育株的EST、POD、COD的同工酶酶谱在雌雄蕊形成期存在差异，与可育株的同工酶酶谱相比，不育株除在谱带的显色速度、颜色和带宽上存在差异外，在谱带数及其分布未见差异；在单核期花药中，不育株（纯合与杂合）比可育株多1条EST、少2条POD和2条COD同工酶带，在三核期也呈上述特征。表明水稻显性核不育基因在叶片中不表达、幼穗中部分表达和花药中充分表达，水稻显性核不育基因表达具有组织的时空和特异性。花药发育过程中基因表达程序的扰乱是引起花粉败育的最主要的原因。     

K型和T型小麦雄性不育花粉粒形态与细胞化学定位

 通过光镜、电镜和酶细胞化学定位技术 ,比较研究了T型和K型同核异质不育系及其保持系在小孢子发生、发育过程中的细胞学、ATP酶和细胞色素氧化酶活性反应变化。结果表明 ,T型不育系花粉粒败育主要发生在单核花粉粒后期 ,败育发生的形态学变化从液泡膜开始 ,花粉粒败育与单核花粉粒时期细胞核和核仁中ATP酶活性的缺乏有关。K型不育系花粉粒败育主要发生在二细胞后期和三细胞时期 ,败育发生的形态学变化从线粒体开始 ,花粉粒败育与花粉粒内壁的结构异常密切相关     

甘蓝型油菜温敏细胞核雄性不育系TE5A花药发育的细胞学研究

【目的】明确甘蓝型油菜温敏细胞核雄性不育系TE5A花药败育的时期及细胞学特征,为进一步研究其雄性不育的机理奠定理论基础。【方法】用不同温度(16℃和22℃)处理试验材料不育系TE5A,分别观察植株的育性及花器形态;并采用常规半薄切片技术,通过甲苯胺蓝、苯胺蓝和苏丹黑B等染料进行染色,观察并比较该不育系TE5A不育植株和可育植株花药发育的显微结构、胼胝质以及脂质体等脂类物质的异同;进一步通过透射电镜对其花药发育的超微结构进行比较观察。【结果】当把可育株油菜从16℃光照培养箱移到22℃光照培养箱后7 d,观察到花朵的育性转变为雄性不育。把22℃光照培养箱的不育株油菜移到16℃光照培养箱后,观察到先开放的花朵表现为雄性不育,而随后开放的花朵表现为雄性可育。在不育环境下的不育株TE5A花朵的花瓣大小和形态与可育株花朵没有明显差异,但不育株花朵的花丝显著短于可育株的花丝,并且花药萎缩、干瘪,没有花粉粒附着在上面。在不育环境下,不育系TE5A花药败育发生在花粉母细胞减数分裂时期,花粉母细胞减数分裂发生异常,没有二分体及四分体的形成,形成"拟小孢子"。胼胝质在花粉母细胞时期可以正常合成,但后续的降解滞后,在四分体时期没有降解,直至花粉粒成熟期才开始降解。绒毡层没有观察到明显异常,并能分泌脂质体等脂类物质。"拟小孢子"的花粉粒外壁发育异常,无法形成具有特殊柱状体和顶盖结构的花粉粒外壁,因此,不能结合孢粉素和脂质体等物质。随着花药的继续发育,最后"拟小孢子"逐渐降解,只剩下花粉空壳。【结论】甘蓝型油菜温敏细胞核雄性不育系TE5A花朵的花瓣大小和形态与可育株花朵没有明显差异,但花丝显著缩短,花药萎缩、干瘪,没有花粉粒附着在上面。不育系TE5A花药败育发生在花粉母细胞减数分裂时期,减数分裂异常导致无法形成二分体及四分体,并且胼胝质的异常降解及花粉粒外壁的异常对花药败育也有重要影响。甘蓝型油菜温敏细胞核雄性不育系TE5A可以作为一新型甘蓝型油菜温敏细胞核雄性不育系材料。     

不同温光类型雄性不育小麦的比较研究

为了研究3类不同类型温光敏雄性不育小麦之间的差异,对其进行光合速率、可溶性蛋白质含量和可溶性糖含量的比较分析。结果表明,3类温光敏雄性不育小麦的光合速率之间没有显著差异;ES8-1温光敏雄性不育系的各生理指标与K2-87S-2A和3017A2个温光敏雄性不育系的变化不同。ES8-1中各物质含量的显著变化主要发生在减数分裂时期到单核花粉粒时期;K2-87S-2A和3017A中各物质含量的显著变化主要发生在单核花粉粒时期到二核花粉粒时期。由此表明,这3类温光敏不育系的雄性败育进程有所不同,ES8-1不育系的败育时间早于K2-87S-2A和3017A不育系。     

Male Sterile Lines of Zinnia elegans and Their Cytological Observations

In order to find out a new pathway for utilizing heterosis of Zinnia elegans and accelerate breeding process, the mechanism of anther development of a male sterile line was explored. Backcross, sibmating, selling of fertile plants and testcross with inbred lines were analyzed and identified in the field, and cytology was observed. Recessive nucleus male sterile line AH209AB capable of being a maintainer was obtained by successive backcrosses with male sterile plants and fertile F1 plants as male parents. Cytological and anatomical studies indicated that： （1） The wall of normal anther was constituted of four layers of cells such as epidermis, powder chamber wall, middle level and tapetum cells. The process in meiosis of pollen mother cell in Zinnia elegans was normal and cytoplasm divided simultanously. Mature pollen grain was tricellular type. （2） The petal of male sterile plant degraded as a thread-like structure, the stamens were villiform in appearance and no pollens were formed. The result showed that the anther of male sterile plant no longer proceed to differentiate spore mother cell and the pollen sac after the formation of the tissue of sporogenous cells, there was no evident boundary between tapetum cell, middle lamella and inner wall of PMC, tapetal cells did not develop from the very beginning. So the abortion type was completely structural male sterility. The male sterile line belongs to non-sporange male sterile type and is of great use in F1 seeds production.