响应面法优化玉木耳原生质体制备条件

[目的]优化玉木耳原生质体制备条件,获得高质量、高产量的原生质体,为后续玉木耳遗传育种、优良性状筛选和品种改良提供良好的试验材料.[方法]以玉木耳原生质体产量为考察指标,结合单因素试验和响应面优化法,建立原生质体制备回归方程,探究玉木耳原生质体的最佳制备条件.[结果]单因素试验结果表明,玉木耳原生质体制备的适宜条件为:酶解时间3 h、酶解液浓度2.0%、酶解温度35℃.响应面试验结果表明,各因素对原生质体制备影响程度的排序为:酶解温度>酶解时间>酶解液浓度,酶解温度与酶解时间的交互作用对原生质体产量有极显著影响(P<0.01),酶解时间与酶解液浓度的交互作用影响显著(P<0.05).响应面试验优化后,获得玉木耳原生质体的制备条件为:酶解液浓度2.0%、酶解时间3.4 h、酶解温度35℃,此条件下玉木耳原生质体的平均产量为17.5×106 CFU/mL,与理论产量(17.77×106 CFU/mL)偏差小.[结论]利用响应面法可确立玉木耳原生质体制备的最佳条件,获得较理想的原生质体产量.     

响应面法优化平菇单核原生质体的制备及再生技术

为了提高平菇原生质体融合育种效率,本研究通过构建基于原生质体产量及单核原生质体再生率的响应面模型,优化平菇原生质体制备体系。以平菇菌株黑平16-1为试材,分别通过单因素试验考察菌丝菌龄(3～6 d)、酶液浓度(0.5%～2.0%)、酶解温度(28～34℃)和酶解时间(3～6 h)对原生质体制备及再生率的影响,并在单因素试验基础上,设计4因素3水平的响应面试验,建立各因素与响应值(原生质体产量和单核原生质体再生率)之间的数学模型,确定原生质体制备及单核原生质体再生的最佳提取工艺。结果表明,最佳提取工艺为菌龄4 d、酶液浓度1.51%、酶解温度28.3℃、酶解时间3.7 h,在此条件下平菇原生质体产量和单核原生质体再生率分别为(2.25±0.21)×107个·mL~(-1)和(6.80±0.42)%,与模型预测值接近(2.27×107个·mL~(-1)和6.83%),方程拟合度良好,该方法适用于对平菇原生质体的制备及单核原生质体再生条件的参数优化。     

两步酶解法制备拟南芥保卫细胞原生质体

用两步酶解法提取拟南芥保卫细胞原生质体。首先使用作用比较缓和、浓度为0.8%的绿木酶Celluly-sin 25℃,120 r/min水浴振荡30 min,促使原生质体游离出来;然后再使用1.5%的纤维素酶Cellulase RS和0.02%的果胶酶Y-23组成的酶解液,22℃,60~70 r/min,酶解40~60 min,制备拟南芥保卫细胞原生质体。结果表明,两步酶解法可以制备出活性较高、适于进行膜片钳等后续试验的原生质体。     

玫烟色棒束孢IfB01菌株原生质体制备与转化条件研究

为了提高虫生真菌玫烟色棒束孢If B01原生质体的产量和转化效率,进而为该菌株的基因工程和细胞工程改良奠定基础,本文研究了不同细胞壁降解酶配比、渗透压稳定剂、酶解温度、时间、p H值和转速等对玫烟色棒束孢If B01原生质体制备以及不同聚乙二醇4000(PEG4000)浓度对原生质体转化的影响。结果显示,培养30 h的菌丝用1%蜗牛酶+2%纤维素酶配比、以0.7 mol/L的Na Cl溶液(p H6.0)为渗透压稳定剂,30℃、100 r/min酶解8 h,获得的原生质体产量最高,达6.72×106个/m L;此原生质体在40%的PEG4000作用下可获得最高的转化效率,达7.05%。研究表明酶液、酶解温度、时间、p H值、渗透压、稳定剂、转速和PEG4000的浓度等因素对原生质体的制备和转化有较大影响。     

禾本科内生真菌研究15:禾本科内生真菌Epichloё yangzii原生质体的制备与再生

为高效获得内生真菌Epichloё yangzii Rnj5706菌株的原生质体,分别检测酶系组合、稳渗剂、pH值、酶解温度等因子对E.yangzii原生质体制备的影响。结果表明:制备E.yangzii原生质体的优化条件为液体培养48 h的鲜菌丝在pH值6.8含0.7 mol/L NaCl的酶解液(1.5%崩溃酶、1.0%蜗牛酶、1.0%纤维素酶、2.0%溶菌酶)中32℃酶解4 h,这时的原生质体得率为39.2×105个/mL酶解液。并比较不同保存时间下的原生质体的再生比率,表明随保存时间延长,再生比率急剧下降。本研究关于E.yangzii原生质体的制备和再生方法,为内生真菌遗传操作等后续研究提供了基础。     

玉蕈原生质体制备条件研究

[目的]探索了玉蕈原生质体的制备与再生的适宜条件。[方法]采用斜面、平板培养基和液体培养基,研究了玉蕈菌丝体酶解时间(1~5 h)、酶解温度(25℃)和菌龄(4~7 d)以及渗稳剂种类(甘露醇、蔗糖、KCl、MgSO4)对玉蕈原生质体制备与再生的影响,优化了玉蕈原生质体制备与再生的条件。[结果]玉蕈原生质体制备与再生的适宜条件是:渗稳剂为0.6 mol/L MgSO4.7H2O,玉蕈菌丝体酶解时间2h,酶解温度25℃,菌龄5 d。在此条件下,玉蕈原生质体的产量最高,达16.7×106个/ml。[结论]该研究为利用原生质体技术进行玉蕈育种奠定了基础。     

禾本科内生真菌研究15:禾本科内生真菌Epichlo(e) yangzii原生质体的制备与再生

为高效获得内生真菌Epichlo? yangzii Rnj5706菌株的原生质体,分别检测酶系组合、稳渗剂、pH值、酶解温度等因子对E.yangzii原生质体制备的影响.结果表明:制备E.yangzii原生质体的优化条件为液体培养48 h的鲜菌丝在pH值6.8含0.7 mol/L NaCl的酶解液(1.5％崩溃酶、1.0％蜗牛酶、1.0％纤维素酶、2.0％溶菌酶)中32℃酶解4h,这时的原生质体得率为39.2×105个/mL酶解液.并比较不同保存时间下的原生质体的再生比率,表明随保存时间延长,再生比率急剧下降.本研究关于E.yangzii原生质体的制备和再生方法,为内生真菌遗传操作等后续研究提供了基础.     

石斛兰叶片原生质体分离条件研究

[目的]探讨了石斛兰原生质体分离过程中的影响因素,建立最佳的原生质体制备体系。[方法]以石斛兰叶片为材料,采用正交设计研究纤维素酶浓度、酶解时间、温度、pH值以及甘露醇浓度对石斛兰原生质体分离的影响。[结果]以3%纤维素酶R-10＋0.6%果胶酶Y-23为混合酶液,0.5mol/L甘露醇为渗透压稳定剂,在26℃的黑暗条件下,pH值为5.4的酶液组合中,黑暗条件下振荡,酶解15h,获得的原生质体产量最高。[结论]该制备体系为后续原生质体培养和体细胞杂交奠定良好的基础。     

内生真菌Neotyphodium sp原生质体的制备与再生研究

通过对酶系组成、酶解温度、酶解时间和酶解液pH值等多个因子的研究,得出了制备禾本科植物内生真菌Neotyphodiumsp原生质体的最佳方法,即经10.3%蔗糖溶液预处理的鲜菌丝于32℃,在pH 6.8的酶解液(1.5%崩溃酶、1.0%蜗牛酶、1.0%纤维素酶和2.0%溶菌酶)中酶解5 h,原生质体得率为7.3×103个/mg鲜菌丝。比较不同再生方式对原生质体再生率的影响,结果表明,液体再生涂布平板法有利于提高原生质体再生率。     

酶解条件对黄瓜原生质体分离效果的影响

[目的]研究黄瓜原生质体分离的最佳酶解条件.[方法]以黄瓜子叶和悬浮细胞为材料,研究不同酶解条件对其原生质体的分离效果的影响.[结果]黄瓜子叶获得高质量的原生质体的最佳条件为：酶液组合2％纤维素酶＋1.0％果胶酶,酶解时间8h,酶液浓度0.7 mol/L,酶液pH 5.5.[结论]该试验研究了不同酶解条件对黄瓜原生质体的分离效果的影响,为黄瓜的进一步开发利用提供依据.     

一株小菇属天麻萌发菌原生质体制备的研究

通过正交设计法探究了菌丝体菌龄、酶液浓度、稳渗剂种类、酶解时间等不同因素对天麻萌发菌原生质体制备的影响。结果表明,稳渗剂种类对天麻萌发菌原生质体制备产量的影响最显著;天麻萌发菌菌丝体在改良PDB液体培养基中25℃培养3 d,该菌丝最适于原生质体的制备;其最优制备条件为MNM作为稳渗剂、酶液浓度1.0%、酶解时间7 h,此时原生质体产量最大,达到11.17×10~6个/ml。     

高粱红曲菌M-3原生质体制备与再生

通过单因素及正交试验优化,拟建立高粱红曲菌M-3的菌丝高效制备和再生原生质体的优化方法。试验结果表明,在以1.0mol·L~(-1)山梨醇(pH8.0)为高渗透稳定液,以纤维素酶(0.3%)和蜗牛酶(0.3%)为裂解酶的条件下,考查不同酶解时间、酶解温度及酶解pH等单因素对原生质体形成与再生的影响;在单因素试验的基础上,采用正交设计试验确定原生质体制备与再生的最佳工艺参数为:酶解时间2h、pH值为6.0、温度32℃,在此工艺条件下,原生质体形成数为3.000×10~6个·mL~(-1),原生质体原生质体再生率为19.33%(再生菌落数为5.80×10~5个·mL~(-1))。     

泰妙菌素生产菌种原生质体制备条件优化

[目的]探讨泰妙菌素生产菌种原生质体的最优制备方法。[方法]通过对原生质体制备条件进行优化,建立泰妙生产菌种原生质体制备体系。[结果]优化后制备条件:以培养3 d的菌丝体为材料,将其置于含质量浓度0.10%溶壁酶、0.60 mol/L MgSO_4的酶液中,25℃酶解3.0~3.5 h,将酶解液用G2砂芯漏斗过滤,滤液即为原生质体悬液。采用该方法,泰妙生产菌种原生质体制备率达1.5×10~6个/m L。[结论]试验结果为提高泰妙菌素生产菌种的产量提供了理论依据。     

青天葵叶片原生质体分离条件的优化

以青天葵Nervilia fordii(Hance)Schltr.的新鲜叶片为试材,对青天葵原生质体的制备分离技术进行研究。用不同浓度的甘露醇溶液处理青天葵叶片下表皮细胞,进行细胞质壁分离试验,确定青天葵叶片细胞的等渗浓度;采用正交设计研究酶解法制备青天葵叶片原生质体的最适合纤维素酶浓度、离析酶浓度及酶解时间。结果表明,青天葵叶片细胞的等渗浓度为11%甘露醇;采用1.0%纤维素酶R-10+0.6%离析酶R-10的混合酶液酶解青天葵叶片12 h能达到很好的分离效果,获得高质量的原生质体。     

冬虫夏草无性型菌丝体的原生质体制备条件研究

以冬虫夏草无性型中国被毛孢为原材料,通过液体培养获得菌丝体,经酶解处理后在不同条件下获得原生质体,以研究酶的种类及浓度、渗透压稳定剂及浓度、酶液pH值以及酶解时间等不同因素对中国被毛孢原生质体制备的影响。结果显示,中国被毛孢菌株原生质体的最佳制备条件为:使用浓度配比分别为4和3 mg·mL-1的Yatalase和Glucanex酶,在1.0 mol·L-1KCl作为渗透压稳定剂,酶液pH值为6,酶解3 h,所得原生质体量最多。     

复合酶解耦合微生物发酵制备海藻生物有机液肥的研究

为了开发海洋生物质资源,以大型海藻为原料,利用生物法制备海藻有机液肥,采用复合酶解耦合微生物发酵法,研究了影响酶解效率的pH、温度、酶添加量和反应时间等因素,并利用正交试验获得复合酶解海藻的优化工艺参数。同时为进一步提高海藻细胞内生物活性物质的释放,利用微生物菌剂对海藻酶解液进一步发酵,获得最适发酵工艺条件。结果表明,复合酶解耦合微生物发酵法制备海藻肥的最佳酶解条件为酶解pH 6.5、酶解温度65℃、酶添加量5%、酶解时间8 h。利用微生物菌剂对海藻酶解液发酵的最佳发酵工艺条件为发酵时间36 h、微生物菌剂接种量0.3%、发酵装瓶量40 mL/100 mL、发酵温度45℃、发酵初始pH 6.5。经种子萌发试验,复合酶解耦合微生物发酵制备的海藻液肥可以显著提高种子萌发率。     

层出镰孢菌原生质体制备条件的研究

[目的]研究层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)原生质体的最佳条件,建立高效制备层出镰孢菌原生质体制备的方法.[方法]通过对菌丝体菌龄、酶解液组合、酶解反应温度及酶解时间等影响因素进行优化,对层出镰孢菌原生质体的制备条件进行研究.[结果]菌块在CMC液体培养基中25℃培养分生孢子3 d后,过滤离心后转移至YEPD液体培养基中培养12 h,该菌丝最适于层出镰孢菌原生质体的制备;用1.2 mol/L KCl溶液配制含有5 mg/m L裂解酶、25 mg/m L崩溃酶、0.05 mg/m L溶壁酶的酶解液在30℃下对菌丝酶解1.5 h,此时原生质体的数量最大,为2.47×10~9个/m L.原生质体再生培养时,使用40%PTC溶液恢复细胞壁,在TB3液体培养基中30℃过夜培养,离心后与TB3固体培养基混合后倒入平板培养,原生质体再生率可达39.75%.[结论]通过对菌丝体菌龄、酶解液浓度、温度、酶解时间等条件的优化,可提高层出镰孢菌原生质体的产量及再生率,为进一步研究层出镰孢菌致病分子机制提供理论依据.     

水稻纹枯病菌原生质体制备与再生条件的优化

为获得进行水稻纹枯病菌遗传转化所需的高质量原生质体,选用该病菌强致病力菌株GD-118,分别从酶种类、菌龄、酶解时间、酶解温度、酶液pH值和渗透压稳定剂及其浓度6个方面优化了原生质体的制备条件,从酶解时间和渗透压稳定剂及其浓度2个方面优化了原生质体的再生条件。结果表明:优化后的水稻纹枯病菌原生质体制备的最佳条件组合是"纤维素酶+溶菌酶+崩溃酶"组合酶、总酶终质量浓度10mg/mL、菌丝菌龄15h、酶解时间3h、酶解温度35℃、酶液pH5.6、以0.6mol/LMgSO4.7H2O为渗透压稳定剂,此最佳条件组合所制备的原生质体产率高达4.00×107/g;原生质体最佳的再生条件是酶解3h的原生质体在含1.0mol/L甘露醇的再生培养基上26℃时进行培养,在此条件下可获得最佳的再生效果,再生率为39%。     

蛹虫草原生质体分离条件研究

[目的]为蛹虫草各种药理机制及有效成分的研究提供试验依据。[方法]在其他条件不变的情况下,分别研究不同酶解液(单一酶和不同的组合酶)、不同菌龄(3、5、7、9、11 d)、不同酶解时间(1、2、3、4、5 h)、不同酶解温度(23、28、33、38、43℃)、不同酶解pH值(pH值4.92、5.29、5.91、6.47、6.98)以及不同渗透压稳定剂(浓度0.6 mol/L的MgSO4、KCl、甘露醇和葡萄糖)对蛹虫草原生质体制备结果的影响,确定制备蛹虫草原生质体的适宜条件。[结果]用浓度0.6 mol/L KCl配制成含1.0%纤维素酶和0.5%蜗牛酶的复合酶,在28℃、pH值5.91时,对培养9 d的菌丝体酶解3 h,得到的原生质体数量最多。[结论]为以后进行蛹虫草原生质体技术的深入研究和应用奠定了基础。     

白刺的原生质体制备与培养

以西伯利亚白刺幼苗子叶为材料,采用L(934)正交试验,比较酶组合、渗稳剂甘露醇浓度、酶解温度和酶解时间对其原生质体制备的影响。试验结果表明,适宜酶解条件为1%纤维素酶OnozukaR-10+0.2%果胶酶Y-23+0.8mol·L-1甘露醇,28℃下酶解3.5h。而且,经过预处理的子叶,其原生质体得率优于未处理的。在MS+2,4-D1mg·L-1+6-BA0.5mg·L-1+0.7mol·L-1甘露醇的固液双层培养基中,原生质体能形成细胞团。