小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌及其系统发育

【目的】了解小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌的主要类群,确定内生固氮菌的系统发育地位。【方法】样品表面灭菌后采用无氮培养基分离、培养内生固氮菌,乙炔还原法测定菌株固氮酶活性;PCR扩增得到菌株16S rDNA,通过序列测定和相似性分析研究菌株的系统发育。【结果】从大田小麦体内分离到内生固氮菌34株,固氮酶活性在0.30-30.24 nmol C2H4/h•mg蛋白,基于16S rDNA序列最大相似性,这些菌株分属于假单胞菌（Pseudomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、芽孢杆菌（Bacillus）、黄杆菌（Flavobacterium）等13属21种,种群分布较为广泛;从大田水稻体内分离到内生固氮菌25株,固氮酶活性在3.12-254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于芽孢杆菌、伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）、肠杆菌（Enterobacter）、克雷伯氏菌（Klebsiella）等9属16种,伯克霍尔德氏菌、肠杆菌和克雷伯氏菌是水稻内生固氮菌特有种群;从大田玉米体内分离到内生固氮菌9株,固氮酶活性在7.27-59.58 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）等5属6种;从盆栽试验小白菜体内分离到内生固氮菌14株,固氮酶活性在2.33-205.21 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、节杆菌（Arthrobacter）等6属8种;从市售芹菜体内分离到内生固氮菌10株,固氮酶活性在1.23-46.70 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于鞘氨醇单胞菌、假单胞菌等5属8种。【结论】在生长期小麦、水稻、玉米和部分蔬菜体内普遍存在内生固氮菌,菌株固氮酶活性差异较大,在0.30-254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,系统发育地位分属于假单胞菌、根瘤菌、芽孢杆菌等25个属的56个种,这些内生固氮菌对于农业生产有巨大潜能。     

辣椒叶际固氮菌分离筛选及抑菌活性

为后续研制叶面微生物菌肥提供优良固氮菌种，以辣椒为研究对象，利用选择性培养基分离、筛选辣椒叶际固氮细菌，测定其固氮能力和植物病原菌的拮抗能力并对性能优良的菌株进行16S rDNA分子生物学鉴定。研究表明，从辣椒叶际共分离得到2株具有高效固氮性能的自生固氮菌LJ-1和LJ-2,分别鉴定为不动杆菌(Acinetobacter sp.)和根瘤菌(Rhizobium sp.),固氮酶活性分别达93.26和102.23 U·L^-1。两株菌具有广谱抗真菌活性和耐酸碱能力，对油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌和棉花立枯病菌抑制效果可达50%以上。因此，辣椒叶际固氮菌LJ-1和LJ-2是具有固氮和生防作用的多功能细菌，可为进一步研发优良的叶际固氮菌肥提供微生物资源。     

具有拮抗作用的水稻内生固氮菌的分离与鉴定

从采自云南禄丰县水稻品种楚粳27的根、茎、叶中分离内生固氮菌,并测定其抑菌作用。用YMA无氮培养基分离获得125株具有潜在固氮作用的内生细菌,对125株内生细菌进行固氮酶基因nifH PCR检测,共有15株内生细菌扩增出固氮酶基因nifH片段,确定其为内生固氮菌。水稻各部位的内生细菌菌群密度不同,依次为:根>叶>茎。通过对水稻白叶枯病、条斑病、稻瘟病、纹枯病和恶苗病等5种主要病害的抑菌试验,筛选出对5种病原菌都有抑制作用的内生细菌11株;其中同时具有固氮和抑菌作用的有3个菌株,分别为NR-18、NR-64和NR-79。经16SrDNA序列测定表明,NR-18和NR-79为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa),NR-64为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),均来自水稻根部。     

豆科植物内生固氮菌的分离与筛选

以阿须贝无氮培养基为选择分离条件,对豆科植物内生细菌进行初步分离筛选,并通过固氮酶活性测定方法测定所得菌株的固氮酶活性,筛选有较高固氮酶活性的菌株.获得52株内生固氮菌,均具有固氮酶活性,其中2株固氮酶活性较高,具有潜在的应用价值.     

植物内生固氮菌的研究进展

植物内生固氮菌是指定殖于植物体内与宿主植物进行联合固氮的一类微生物,不但具有固氮作用,还有生物防治、促进植物生长的作用。对植物内生固氮菌的研究始于上个世纪80年代,至今已从甘蔗、水稻等多种作物中分离到多种内生固氮菌。综述了10多年来内生固氮菌的研究进展,对固氮醋酸杆菌(Acetobaterdiazotrophicus)等几种内生固氮菌的生理、生物学特性及其侵染方式、传播途径和固氮机理进行了较全面的概述,并对应用内生固氮菌的可能性和意义,以及需要注意的问题作了一些探讨。     

青藏高原矮火绒草内生细菌多样性及生物功能分析

[目的]探究矮火绒草(Leontopodium nanum)内生细菌的群落结构多样性及其生物学功能,为开发相应功能的生物菌剂提供参考,并为青藏高原生态农牧业生产提供有价值的内生细菌资源.[方法]采用组织分离法对矮火绒草植株内生细菌进行分离纯化,基于16S rDNA序列分析确定分离菌株的系统发育地位;通过平板对峙法检测分离菌株拮抗病原真菌活性;检测分离菌株的产吲哚乙酸(IAA)、溶磷和固氮能力;测定分离菌株除草活性、低温适生性及促种子萌发特性.[结果]从矮火绒草植株根、茎、叶和种子部位共分离获得52株内生细菌,基于16S rDNA序列分析发现52株菌株可归属于4门7纲10目14科18属.其中假单胞菌属细菌为根部优势属,约占根部细菌总数的52.17%;茎中以芽孢杆菌为优势属,约占茎部细菌总数的41.18%;各部位的内生细菌数量分布表现为根>茎>种子>叶.在52株内生细菌中,11株有拮抗病原真菌能力、9株具有产IAA能力、7株有溶磷活性、7株具有固氮活性、20株具有除草活性、13株具有耐低温能力和8株具有促生作用;从植株部位分布来看,7种类型的功能菌在根、茎和种子部位均有分布,拮抗菌和除草菌在根部所占的比例较高,溶磷菌株在各植株部位所占比例均较低;在叶中未分离到拮抗菌、产IAA菌、固氮菌和促生菌.各功能菌株分布在17个属,多样性较高,其中假单胞菌属和芽孢杆菌属中含有多种功能菌株,在植株4个部位所占比例也较高.[结论]矮火绒草植株不同部位内生细菌的数量分布具有差异性,但均可分离到不同类型的功能菌株,功能菌株涵盖17个属,其中以假单胞菌属和芽孢杆菌属居多.     

水稻根系内生固氮菌的分离鉴定及其促生作用研究

【目的】研究不同生育期水稻根系内生固氮菌的多样性,分离鉴定内生固氮菌并筛选具有促生作用的菌株,为水稻生产中固氮菌的应用提供理论依据。【方法】采用无氮培养基培养方法,从拔节期和抽穗期佳辐占根系中分离内生固氮菌,通过扩增16S rRNA方法进行分子鉴定和系统进化分析;采用透明圈法进行溶磷解钾能力验证;采用乙炔还原法测定固氮酶活性。将分离的内生固氮菌株单独接种盆栽水稻幼苗,测定其对株高、根长、鲜质量的影响;将内生固氮菌混合菌液接种水稻品种佳辐占和台粳8号,于齐穂期测定倒1、倒2和倒3叶片的叶绿素含量（SPAD值）。【结果】从拔节期和抽穗期水稻根系中分别分离出10和20株内生固氮菌,且两个时期水稻根系内生固氮菌群多样性存在差异,拔节期以克雷伯氏菌属为主,而抽穗期以假单胞菌属为主。筛选出7株具有溶解无机磷能力的菌株,分别是J3、J10、J23、H27、H30、H33和H37。乙炔还原法测定结果表明,分离的内生固氮菌均具有弱固氮活性,其中 H33和H40-2菌株固氮能力相对较强。将固氮菌回接水稻幼苗,H40-2和J3菌株对水稻株高、地上鲜质量、根长均有显著影响,可促进水稻生长。将固氮菌混合回接水稻根系,发现佳辐占叶片叶绿素含量与对照差异不显著,而台粳8号显著提高。【结论】分离的内生固氮菌株H40 2和J3在水稻苗期具有明显促生作用,可作为功能性内生固氮菌开发利用。     

施氏假单胞菌在玉米根际的固氮效率和促生效果研究

非豆科植物根际联合固氮作用广泛存在于水稻、玉米等根际,在农作物节肥增产方面具有巨大的应用潜力。施氏假单胞菌A1501是一株分离自水稻根际的模式联合固氮菌,接种该菌对水稻和玉米均具有良好的促生效果。为了进一步研究根际固氮与促生效果的关系,利用突变型泌铵固氮菌株（1568/pVA3）和转基因氮高效利用玉米品系共同构建高效固氮体系,并在温室条件下进行促生及生物固氮量评价。播种60 d后对玉米生长量和微生物固氮量进行分析,结果表明：固氮施氏假单胞菌接种后氮高效利用和对照玉米品系的地上和地下部生物量都显著高于不接种对照,但是固氮菌接种对氮高效利用玉米和对照玉米的总生物量没有显著影响。氮高效利用玉米接种1568/pVA3菌株后,植株生物量较施肥处理提高25.5%,全氮含量较不接种对照增加39%,15N同位素稀释法测定生物固氮量为0.8 g·株^-1;接种野生型后植株生物量较施肥处理提高24.8%,生物固氮量为0.64 g·株^-1。研究结果表明,通过将固氮菌尤其是泌铵工程菌与氮高效利用玉米建立联合固氮体系可以显著提高根际固氮量和植株生物量,据估算每公顷可节省化肥约23%,而对照体系为7.5%。     

玉米联合固氮菌的固氮活性及联合固氮效果

盆栽实验表明,分属于固氮菌属(Azotobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、克雷伯氏属(Klebsiella)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的9株玉米联合固氮菌均能在玉米苗根际繁殖并有固氮作用,且能提高植株的含氮量和干重。但不同菌株的固氮活性和玉米的联合固氮效果不同。     

糖蜜草内生固氮菌IS-PCR和16S rRNA基因全序列分析

采用插入序列指纹图谱分析（IS-PCR）和16SrRNA基因全序列分析,对来源于优良牧草——糖蜜草Melinis minutiflora Beauv．内生固氮菌进行研究．结果表明,糖蜜草中分离的内生固氮菌与产脂固氮螺菌模式菌株DSM1691的插入序列指纹图谱存在着差异;来源于糖蜜草的4株菌紧密地聚在一起,与GenBank中已知产脂固氮螺菌Azospirillum lipoferum的16SrRNA基因全序列有97％的序列相似性．初步确定糖蜜草中分离的内生固氮菌为一新类群的内生固氮菌．     

小麦内生细菌分离培养基的选择

分别利用肉汁胨琼脂、营养琼脂、胰酶大豆琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂、脑心浸液琼脂、金氏培养基B、LB营养琼脂和酵母膏蛋白胨琼脂8种常用的细菌分离培养基来分离小麦内生细菌,以选择适宜的分离培养基,结果显示,胰酶大豆琼脂和金氏培养基B的分离效果显著优于其他培养基,马铃薯葡萄糖琼脂和脑心浸液琼脂的分离效果较差。利用选择出的金氏培养基B和胰酶大豆琼脂分别对豫东麦区的7个小麦品种的内生细菌进行分离,进一步确认了胰酶大豆琼脂和金氏培养基B为分离小麦内生细菌的适宜培养基。     

重庆地区玉米叶内生细菌的分离及其与草地贪夜蛾肠道菌的比较

为进一步了解重庆地区玉米叶内生细菌的组成以及这些内生细菌与入侵重庆地区草地贪夜蛾肠道微生态的相互关系,以采集自巫山地区被草地贪夜蛾入侵的玉米地里的玉米嫩叶为材料,运用传统微生物培养方法尝试对其内生细菌进行初步的分离培养,并通过16S rDNA测序开展了优势菌的属水平鉴定.此次共分离获得了22个细菌分离株,经16S rDNA序列同源性分析,将它们归类到11个分类单元,分属克雷伯氏菌属(Klebsiella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、微杆菌属(Microbacterium)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、无色杆菌属(Achromobacter)和丛毛单胞菌属(Comamonas).与前期研究得到的该地区草地贪夜蛾肠道微生物菌群数据比较可以发现,玉米内生细菌中包括克雷伯氏菌属(Klebsiella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)和金黄杆菌属(Chryseobacterium)在内的5个属可以在草地贪夜蛾肠道中分离到,表明草地贪夜蛾肠道微生物多数可能源自其食物,但是草地贪夜蛾肠道微生物中常见的假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、短波单胞菌属(Brevundimonas)和气单胞菌属(Aeromonas)并未在玉米嫩叶中分离到,说明它们可能是主要存在于草地贪夜蛾肠道中的微生物.该研究对草地贪夜蛾所取食的玉米叶中内生细菌的种类进行了初步分析,为后续研究玉米叶内生细菌和草地贪夜蛾肠道微生物的相互关系奠定了基础.     

玉米内生细菌的动态分布及拮抗作用

[目的]比较不同品种及生育期玉米内生细菌的多样性差异,对分离到的内生细菌的拮抗作用进行鉴定。[方法]以桂单0810、迪卡008、正大619玉米品种苗期和穗期的不同组织为研究对象,采用组织研磨匀浆方法分离培养内生细菌,结合形态生理特征和16S r DNA基因序列同源性比对分析对菌株进行了分类,并测定了所分离的菌株对4种玉米病原菌的拮抗作用。[结果]从桂单0810、迪卡008、正大619这3个玉米品种苗期和穗期的根、茎、叶中共分离到82株内生细菌,归于4个属,芽孢杆菌属为优势菌群,各菌群在不同生育期及组织的分布动态各有特点,其中有8株菌对4种玉米病原菌表现出不同程度的拮抗作用。[结论]玉米内生细菌的多样性丰富,可作为玉米病害生防菌的来源。     

茶叶内生菌的分离鉴定及其生防功能初探

对采自福建宁德地区的大白毫和福云六号茶叶进行内生菌的分离和脂肪酸鉴定.从7份样品中共分离到16株细菌、1株真菌.老叶中均未检测到内生菌,芽叶中内生菌数量为26.5×106-139.5×106cfu.g-1.有机种植的福云六号芽叶含菌量是大白毫的1.94倍.常规种植的大白毫芽叶含菌量为97.5×106-139.5×106cfu.g-1,明显高于有机种植的26.5×106-28.3×106cfu.g-1.大白毫带有红杆菌属、微杆菌属、根瘤菌属和贪噬菌属的内生细菌,福云六号仅含有根瘤菌属和贪噬菌属.有11株茶叶内生菌对10种供试病原菌表现出拮抗活性,其中放射根瘤菌Eb659菌株抑菌谱最广,具有作为生防菌防治植物病害的潜质.     

芭蕉属植物内生细菌磷脂脂肪酸(PLFA)生物标记特性研究

【目的】分离、鉴定芭蕉属植物内生细菌,了解内生细菌的种群结构及其脂肪酸生物标记特性。【方法】采用平板分离纯化芭蕉、威廉斯蕉和野生蕉植株内生细菌,利用细菌脂肪酸鉴定技术进行鉴定。【结果】共获得内生细菌11属14种,野生蕉植株分离得到9种,威廉斯蕉植株7种,芭蕉植株3种。共检测到35个磷脂脂肪酸生物标记,这些生物标记分为4种类型,即(1)高频次分布:在14株细菌中出现10—14次,属于细菌总体类群(general)的生物标记。(2)中频次分布:在14株细菌中出现4—6次,可以用于代表细菌属类群(genus)识别生物标记。(3)低频次分布:在14株细菌中出现2—3次,可以用于指示特定细菌种间差异的生物标记。(4)微频次分布:仅在一种细菌种类出现,是细菌种(species)特征生物标记。利用磷脂脂肪酸生物标记分析内生细菌群落结构,可将14种细菌分为3类;运用多样性、丰富度、均匀度及优势度指数等生态学概念,分析了磷脂脂肪酸生物标记总量与各生态学参数之间的关系,结果表明,磷脂脂肪酸生物标记16:0、18:1W7C、14:0、12:0、18:0、17:0CYCLO的丰富度皆相对较高;磷脂脂肪酸生物标记的Response值总和较高,均匀度(J)较低,其Simpson优势度指数(D)、Shannon-Wiener(H1)、Brillouin(H2)、Mcintosh(H3)多样性指数也相对较高。【结论】芭蕉属植物内生细菌及其磷脂脂肪酸生物标记存在多样性。     

功能内生细菌对植物体内有机污染物代谢的影响

土壤有机污染危及农产品安全和人体健康。筛选具有降解有机污染物功能的植物内生细菌, 并将其定殖于植物体,有望调控植物体内有机污染物的代谢过程,从而有效地规避植物有机污染的风险,相关研究受到国内外研究者的关注。通过综述近年来有关具有有机污染物降解功能的植物内生细菌分离、筛选的研究进展,分析了功能内生细菌对植物体内有机污染物代谢的影响,揭示了功能内生细菌调控植物体内有机污染物代谢的机理,为进一步利用内生细菌调控植物有机污染的风险提供了思路和依据。     

4种茄科作物内生细菌的分离及拮抗菌的筛选

番茄、茄子、烟草和辣椒健康植株内生细菌的分离及拮抗菌的筛选结果表明,植物的不同种、品种及植物的不同部位,内生细菌数量有所不同.不同作物每克鲜重平均内生细菌数量为1180-11160 cfu;各作物植株不同部位均以果中内生细菌的数量最少,根和茎中的内生菌数量较多.拮抗测定表明,各植物体内均存在对番茄青枯病菌和黄瓜枯萎病菌具有拮抗作用的内生细菌,对番茄青枯病菌具有拮抗作用的植物内生细菌占总数的16.21%,而对黄瓜枯萎病菌具有拮抗作用的内生细菌占总数的28.53%.从拮抗菌株中筛选出3株对多种植物病原真菌有较好拮抗作用的菌株,对黄瓜枯萎病有20.83%-79.17%的防病效果,此3菌株对水稻白叶枯病菌和番茄青枯病菌也有一定拮抗作用,内生性测定表明,3菌株均能进入宿主植物番茄和茄子体内,经初步鉴定3菌株均为芽孢杆菌(Bacillussp.).     

柑橘木虱黄龙病菌携带量与其内生菌群相关性

【目的】分析柑橘木虱（Diaphorina citri）体内可能与黄龙病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）互作的内生细菌,为黄龙病菌的人工培养及其病害防控奠定基础。【方法】首先通过传统分离培养方法比较不同地理来源带黄龙病菌（带菌）和不带菌黄龙病菌（不带菌）的木虱中可培养内生细菌的差异。其次将带菌状况不同的木虱分别分为头、胸、腹3部分,经PCR扩增其16S rDNA的V6-V8区,用变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）方法,比较带菌状况不同的木虱内生细菌的差异和木虱不同部位内生细菌的差异。选择3种差异的内生细菌：Bacillus sp.、Salmonella sp.、Enterobacter sp.,在8份带菌状况不同的木虱样品中通过q-PCR分别对其进行实时荧光定量分析,再以总细菌量为校正计算包括黄龙病菌在内的4种细菌的相对含量,数据经LSD检验,以各种细菌相对含量的-lg值作图,先比较同一样品中3种细菌分别与黄龙病菌的相对含量关系,再比较同种细菌在不同样品中的特性,分析3种内生细菌和黄龙病菌的互作关系。【结果】不带菌木虱中可培养内生菌菌落丰富度和菌落形成单位均大于带菌木虱中。在不带菌木虱中共获得14株形态不同的菌株,分属于芽孢杆菌属（Bacillus,3株）、欧文氏菌属（Erwinia,1株）、克雷伯氏杆菌属（Klebsiella,1株）、葡萄球菌属（Staphylococcus,2株）、节杆菌属（Arthrobacter,1株）、泛菌属（Pantoea,2株）、果胶杆菌属（Pectobacterium,1株）、沙门氏菌属等（Salmonella,1株）、链霉菌属（Streptomyces,1株）、Massilia brevitalea（1株）等10个细菌属。在带菌木虱中分得的4株细菌在不带菌木虱中均分离到,分属于克雷伯氏菌属、芽孢杆菌属、果胶杆菌属。其中Dc-11（嗜气芽孢杆菌属）在带菌木虱和不带菌木虱中分离频率均达到100%,表明其为木虱体内常驻细菌;对木虱不同部位（头、胸、腹）内生细菌16S rDNA的PCR-DGGE图谱显示,带菌与不带菌木虱中细菌种群差别明显,带菌状况相同的木虱不同部位之间差别不明显。其中优势条带10 （Wolbachia sp.）、12（Wolbachia pipientis）、13（Syncytium endosymbiont of Diaphorina citri）、14（Uncultured bacterium）、19（Serratia marcescens）、21和22（均为嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia）在木虱体内稳定存在,带菌木虱腹部特有优势内生细菌为Enterobacter sp.,木虱中同样也存在次级内生菌Wolbachia。q-PCR的结果验证了所选的3种细菌在前期传统分离培养和16S rDNA-PCR-DGGE中结果的可靠性,同时表明肠杆菌属在8份样品中与黄龙病菌呈正相关关系。【结论】黄龙病菌进入木虱体内会改变木虱内生细菌菌群种类和结构;嗜气芽孢杆菌（B. aerophilus）在柑橘木虱体内稳定存在,为木虱体内常驻菌群;Enterobacter sp.与黄龙病菌带菌量呈正相关,推测其可能与黄龙病菌互作。     

杂交玉米农大108及其亲本种子内生细菌群落的多样性

 【目的】 研究不同基因型玉米对其种子内生细菌群落结构的影响。【方法】通过构建16S rDNA文库的非培养方法,对杂交玉米组合农大108正、反交及其亲本种子内生细菌群落多样性进行研究。【结果】 两后代种子内生细菌分别含46和42个OTU,第一优势菌属均为Pseudomonas,丰度分别为34.29%和34.00%;亲本玉米黄C和178种子内生细菌分别含17和11个OTU,第一优势菌属分别为Enterobacter及Burkholderia,丰度分别为49.13%和89.72%。母本玉米黄C种子内生细菌群落中Roseateles、Enterobacter、Pseudomonas及Sphingomonas 4个菌属与父本178种子内生细菌群落中Pseudomonas、Ralstonia、Paenibacillus及Bacillus 4个菌属存在其正交后代种子中。母本178种子内生细菌群落中Acinetobacter、Pseudomonas、Ralstonia、Paenibacillus及Bacillus 5个菌属与父本黄C种子内生细菌群落中Roseateles、Citrobacter、Pantoea、Pseudomonas、Stenotrophomonas及Escherichia 6个菌属存在其反交后代种子中。【结论】遗传相关的杂交玉米农大108正、反交后代其亲本在内生细菌群落结构具有一定的关联性。