刺参机体酵母菌组成及其拮抗活性的研究

采用PDA、YPD、MEA培养基从刺参Apostichopus japonicus的体表、肠道和呼吸树分离出23株酵母菌,使用玻璃珠破碎方法提取其DNA,然后用酵母菌通用引物NL-1/NL-4从DNA中成功扩增出26S rDNA片段,将PCR产物迸行测序,将各菌株序列在GenBank数据库中进行检索,从Blast比对结果中取相似性最高的序列,用Mega 4.0软件对所有序列进行聚类分析,采用邻接法构建系统发育树.结果表明:从大连柏岚子海域刺参中分离出的菌株分别属于红酵母属、梅奇酵母属和丝孢酵母属,从大连市黑石礁海域刺参中分离出的菌株分别属于红酵母属、假丝酵母属、德巴利氏酵母属、有孢汉逊酵母属和毕赤酵母属;以8株刺参病原菌作为指示菌,采用双层琼脂扩散法对分离菌株的拮抗活性进行测定,获得拮抗酵母菌17株,占总测试菌株的73.9％,从刺参机体的体表、肠道和呼吸树可以筛选出不同得率的活性菌株,其抗菌谱和活性强度各不相同,其中C11菌株的抗菌谱最广,抗菌活性最强;从肠道分离出的拮抗菌C11、C14和C21菌株的胞外产物经硫酸铵沉淀后也具有抗菌活性,C14菌株胞外产物经65％硫酸铵沉淀获得的粗提物对热和蛋白酶K敏感,表明其拮抗物质为蛋白质.     

巨峰葡萄自然发酵不同阶段酵母菌的组成及差异分析

采集巨峰葡萄发酵不同阶段的发酵液,通过酵母菌的分离、纯化、WL培养基的鉴别培养、表型性状的聚类分析以及显微细胞形态观察,对酵母菌进行初步的表型分群,挑选不同表型群的代表菌株进行DNA的提取以及26S rDNA D1/D2基因扩增和测序分析。共得到64株酵母菌,经过对获得酵母菌菌株的表型鉴定得到14个表型群,通过26S rDNA基因测序、比对,酵母菌最终鉴定为3个不同的酵母菌种群,分别为假丝酵母、路氏类酵母和酿酒酵母。其中发酵前期包含的酵母菌种群是假丝酵母(64%)和路氏类酵母(36%);发酵中期包含假丝酵母(10%)、路氏类酵母(5%)和酿酒酵母(85%);发酵后期则包含路氏类酵母(43%)和酿酒酵母(57%)。结果表明,发酵不同阶段的优势酵母菌种群是存在差异的,酿酒酵母在发酵的中后期均占优势,假丝酵母仅在发酵的前中期存在且只在前期占优势,路氏类酵母在发酵的各个时期均有发现,但发酵后期占比最高。     

宁夏葡萄自然发酵过程中酵母菌的分子生物学鉴定

【目的】探明宁夏地区葡萄自然发酵过程中酵母菌的多样性,为酵母菌资源的开发利用提供依据。【方法】应用26S rDNA D1\D2区序列,分析鉴定了分离自宁夏广夏三基地葡萄园的21株野生葡萄酒酵母菌,在此基础上又构建了21株被测菌株与相关菌种模式株的系统发育树,分析了供试菌株与已知酵母菌的亲缘关系及其分类地位。【结果】序列分析和系统发育树分析表明,21株被测菌株鉴定为6属7种,分别为拜耳接合酵母(Zygosaccha-romyces bailii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、罕见有孢汉生酵母(Hanseniaspora occidentalis)、葡萄汁有孢汉生酵母(Hanseniaspera uvarum)、美极梅齐酵母(Metschnikowia pulcherrima)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientali)和克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)。【结论】宁夏葡萄酒产区的相关酵母具有多样性。     

昆明葡萄酒相关酵母菌的分离与鉴定

【目的】分离鉴定云南昆明葡萄产区的葡萄酒相关酵母,为该地葡萄酿酒酵母资源的筛选及其利用奠定基础。【方法】以采自昆明官渡区三瓦村的葡萄桨果为材料,将葡萄果皮用灭菌的液体SelMed富集培养基进行培养,经稀释再培养以获得酵母单菌落,采用ITS序列分析和RFLP鉴定分离的相关菌种,并利用微卫星指纹图谱对酿酒酵母的不同菌株进行鉴定。【结果】从云南昆明葡萄产区葡萄果皮上分离获得了207个单克隆菌落。PCR扩增和RFLP分析表明,这些单菌落分属于3个属,分别为梅奇酵母属(Metschnikowia)、红酵母属(Rhodotorula)和酿酒酵母属(Saccharomyces),其中梅奇酵母属出现频率最高,并有23个酿酒酵母单菌落。微卫星分析结果表明,23个酿酒酵母菌落分属于4个菌株,其中1个为商业菌株X5。【结论】在昆明的葡萄园中至少栖息了3个属5个种的酵母,包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、金佩梅奇酵母(Metschnikowi chrysoperlae)、美极梅奇酵母(Metschnikowi pulcherrima)和核果梅奇酵母(Metschnikowi fructicola)等。分离到的葡萄酒相关酵母部分源于欧洲,可能随着葡萄植株被引进到昆明。     

内蒙古西部赤霞珠葡萄自然发酵酵母菌群的动态变化

在无菌条件下,对内蒙古西部地区赤霞珠葡萄汁进行自然发酵,分别在发酵初、中、后期分离酵母菌株,采用WL营养琼脂对其进行形态学分类,采用基于酵母5.8S rRNA-ITS区域的RFLP(restriction fragment length polymorphism)分析对分类酵母菌株进行分子生物学鉴定,统计不同发酵时期发酵液中酵母菌株的种类及数量。结果表明,分离到的327株酵母菌分属于5个属的5个酵母菌种,分别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、克鲁维毕赤氏酵母(Pichia kluyveri)、浅黄隐球酵母(Cryptococcus flavescens)及葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum);自然发酵初期,葡萄汁有孢汉逊酵母、克鲁维毕赤氏酵母的数量占据优势,分别占分离总菌株数的64.22%、17.43%;随着发酵进行,非酿酒酵母(non-Saccharomyces)菌株的数量有所减少,酿酒酵母的数量逐渐增加,至发酵后期,发酵液中仅能检测到酿酒酵母的存在。这表明内蒙古西部地区野生酵母菌种较为丰富,WL营养琼脂形态学分类法结合酵母5.8S rRNA-ITS区域的RFLP分析能够快速分类、鉴定野生酵母菌种,实时监测发酵液中酵母菌群的动态变化趋势。     

不同树龄葡萄自然发酵过程中酵母菌的研究

【目的】研究葡萄树龄与葡萄自然发酵过程中葡萄酒相关酵母菌之间的关系。【方法】利用WL营养培养基,对分离自华夏长城葡萄酒厂葡萄生产基地、不同树龄(2,3,5年)西拉葡萄自然发酵液的240株酵母菌进行了聚类分析。【结果】240株酵母菌共分为5个WL营养类型。结合酵母菌菌株5.8 S rDNA-ITS区基因序列分析,不同树龄西拉葡萄自然发酵液中的酵母菌共有5种,分别为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、陆生伊萨酵母(Is-satchenkia terricola)、克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)、浅黄隐球酵母(Cryptococcus flavescens)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)。不同树龄西拉葡萄自然发酵过程中酵母菌的种类及其比例是变化的。【结论】用树龄较高的葡萄发酵,可加速发酵的启动,缩短发酵周期,同时有利于性状优良野生酿酒酵母菌株的筛选。     

红树林海洋淤泥中放线菌的分离与鉴定

为了解广西北海红树林海洋淤泥中的放线菌资源,采用海水配制高氏培养基分离红树林海洋淤泥中的放线菌样品,从中筛选、分离、提取lO株典型放线菌菌株总DNA,用放线菌通用引物对16Sr DNA进行PCR扩增,对获得的扩增结果进行DNA序列测定和对比鉴定.结果表明,10株典型放线菌菌株为2种菌属,其中有8株为链霉菌属(80%),为常见放线菌;有2株为拟诺卡氏菌属(20%),为稀有放线菌.表明,广西北海红树林海洋淤泥蕴含着种类丰富的放线菌.     

广西毛葡萄产区野生葡萄酒酵母种群分布与系统进化分析

【目的】对广西毛葡萄产区野生葡萄酒相关酵母菌的种类进行鉴定及分布研究,明确毛葡萄产区主要酵母种类及分布规律,为当地酿酒酵母资源的开发利用打下基础。【方法】从葡萄果实表面和果实自然发酵汁中分离、纯化野生葡萄酒相关酵母,利用WL培养基对分离获得的酵母菌株进行分类,从每一类型中选取代表菌株进行26S r DNA基因测序鉴定并进行系统进化分析。【结果】从葡萄果实表面及自然发酵汁中共分离获得180株酵母菌株,根据菌株在WL培养基上的颜色及菌落形态差异将180株酵母菌归为5类。26S r DNA基因序列分析结果表明,20株代表菌株分属于6个属9个种,分别为:汉逊酵母属的Hanseniaspora thailandica、H.opuntiae、H.occidentalis和H.guilliermondii;毕赤酵母属的Pichia pastoris;伊萨酵母属的Issatchenkia terricola;酿酒酵母属的Saccharomyces cerevisiae;Saturnispora属的S.diversa和红酵母属(Rhodutorula,未鉴定到种)。葡萄汁自然发酵过程中由H.thailandica启动发酵,随后出现H.thailandica、H.opuntiae、H.occidentalis、H.guilliermondii和S.diversa,最后由S.cerevisiae逐渐主导并控制发酵。【结论】在广西都安县毛葡萄产区生态环境中存在6个属9个种的葡萄酒相关酵母菌,其中H.guilliermondii是毛葡萄果表优势酵母菌种;在毛葡萄自然发酵汁中存在汉逊酵母的4个不同种及S.diversa和S.cerevisiae,随着发酵环境的变化此消彼长。     

3株刺激隐核虫的ITS-1序列与部分HSP70序列分析

经形态学观察,初步判断从福建长乐、福鼎和宁德三都澳三地患"白点病"的牙鲆、青石斑鱼、大黄鱼鱼鳃和体表上分离收集的寄生虫为刺激隐核虫CryptocaryonirritansBrown。提取基因组DNA,对ITS-1序列进行PCR扩增、克隆、测序和序列分析,结果显示:3株刺激隐核虫的ITS-1序列完全一致,与广东番禺PYH4.12株(DQ270010)、日本Wakayama分离株(AB608054)、台湾嘉义Chiayi株(AF490381)等序列同源性为100%,与NCBI数据库中其他刺激隐核虫分离株的ITS-1序列的同源性为90.62%~99.22%,可以鉴定3株虫均为刺激隐核虫。进一步对刺隐核虫HSP70基因部分序列进行PCR扩增和序列分析,结果显示:3株虫间序列差异很小,说明福建省不同养殖模式、不同宿主得到的刺激隐核虫高度同源。     

华石斛胶膜菌的菌种鉴定及其发酵液中氨基酸的检测

从华石斛(Dendrobium sinense T.Tang et F.T.Wang)根部中分离得到1株真菌S1。通过显微镜观察菌丝形态,PCR扩增ITS-5.8S rDNA序列,测序并在NCBI中进行同源比较,确定其种类;采用高效液相色谱法对该菌株发酵液中的游离氨基酸进行检测。结果表明:根据形态学和分子生物学鉴定的方法,将从华石斛分离的S1菌株鉴定为胶膜菌科(Tulasnellaceae)胶膜菌属(Tulasnella sp.)真菌,该菌在PDB和DE发酵液中均检测到17种氨基酸,其中脯氨酸(Pro)、半胱氨酸(Cys)和赖氨酸(Lys)3种氨基酸含量远高于其他氨基酸的含量。     

一株蓝麻黄拮抗内生真菌的分离鉴定及代谢物的初步分析

【目的】分离获得对农作物致病菌有高效拮抗作用的植物内生菌,并对其进行系统鉴定和代谢成分分析。【方法】用研磨法从蓝麻黄中分离内生真菌,并用琼脂扩散法筛选具有抗农作物致病菌活性的内生真菌;利用菌株形态特征和ITS-5.8SrDNA序列分析进行拮抗菌鉴定,经酚硫酸法测定多糖含量。【结果】从蓝麻黄中分离得到5株内生真菌,其中XJEG-GF-79对葡萄白腐病菌的抑菌圈直径为23mm。经形态学观察和分子分类学分析鉴定,内生拮抗真菌XJEG-GF-79与Pleosporaceaesp.SN-2008同源性达到100%,该菌株代谢产物中含有生物碱和多糖,其经测定,发酵液中多糖含量为1.914mg/mL。【结论】蓝麻黄内生真菌XJEG-GF-79对葡萄白腐病菌有明显的拮抗作用,最终鉴定为链格孢霉Pleosporaceaesp.。     

有齿食道口线虫ITS及5.8S DNA片段的PCR扩增、克隆及序列分析

 运用PCR方法以保守引物NC5及NC2扩增了从广东阳江地区猪体分离的食道口线虫rDNA 的内转录间隔区（ITS）及5.8S序列。将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体，用PCR技术及酶切鉴定阳性菌落，对阳性菌落质粒DNA进行测序。结果表明，扩增的片段大小为828 bp，包含部分的18S、28S及全部的ITS-1（362 bp）、5.8S(153 bp)及ITS-2（217 bp）序列。序列比较表明，该食道口线虫为有齿食道口线虫。本研究在国际上首次报道了中国猪有齿食道口线虫的ITS及5.8S序列，为食道口线虫的分子生物学的进一步研究奠定了基础。     

转化人参皂苷Re的活性菌株的鉴定

[目的]筛选长白山人参土壤中的活性微生物，转化单体人参皂苷产生稀有抗肿瘤成份。[方法]从长白山人参根际土壤中分离各类菌株，对单体人参皂苷Re进行微生物转化；结合菌落形态、产孢结构、孢子形态特征以及菌株ITSrDNA核酸序列分析，对活性菌株进行鉴定。[结果]从长白山人参根际土壤中分离各类真菌菌株68株，其中菌株SRS一10对三醇组人参皂苷Re具有较强的转化活性。[结论]阳性菌株SRS-10被鉴定为链格孢Alternaria alternata，能将人参皂苷Re转化为人参皂苷Rgl。     

黄艾美耳球虫纯种分离及ITS-1序列测定

为建立一种有效鉴定兔球虫的分子生物学方法,采用单卵囊分离技术,分离纯化黄艾美耳球虫.根据GenBank中发表的艾美耳属球虫18S rDNA和5.8S rDNA序列,设计特异性引物,建立PCR方法并针对黄艾美耳球虫第一内转录间隔区进行扩增,PCR产物直接测序.结果分离出黄艾美耳球虫,并扩增出包含黄艾美耳球虫第一内转录间隔...     

核糖体RNA基因在酵母分类鉴定中的应用

核糖体DNA在酵母分类鉴定中发挥着重要作用。本文介绍了核糖体的构成,核糖体RNA基因26S rDNAD1/D2区域、18S rDNA、ITS-5.8S rDNA和IGS rDNA片段作为分子标记的原理方法、在酵母菌种鉴定和分子系统发育中的应用,同时对rDNA各个序列片段在国内外酵母分类鉴定应用中的问题和前景进行探讨。     

福建地区葡萄自然发酵过程中酵母菌的组成及差异分析

【目的】对福建地区葡萄自然发酵酵母菌组成的差异进行分析,明确福建主要酵母菌种类,为酿制具有南方地域特色的葡萄酒提供优良菌株。【方法】采集夏黑、刺葡萄和玫瑰香葡萄自然发酵不同阶段[发酵前期（7 d）、中期（15 d）和后期（25 d）]的发酵液进行酵母菌分离,采用WL培养基进行酵母菌表型性状鉴别,挑取代表性菌株进行DNA提取及26S rDNA D1/D2鉴定,分析不同发酵阶段酵母菌的组成差异。通过测定相同发酵条件下的酒精度、总糖、还原糖和总酸含量,对酿酒酵母的酿酒性能进行初步分析。【结果】不同品种葡萄自然发酵的发酵液中共分离获得114株菌株,根据其表型鉴定为18个不同的表型类群。进一步通过酵母菌的26S r DNA D1/D2区序列测序,可将114株酵母菌菌株划分为18种,包括拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、双孢接合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等。不同品种葡萄发酵过程中酵母菌种类和组成具有一定的差异,其中刺葡萄A有10种、刺葡萄B有11种、夏黑A和玫瑰香均为7种、夏黑B有8种。陆生伊萨酵母（Issatchenkia terricola）出现在刺葡萄A、玫瑰香和夏黑B发酵前期,且所占比例最高,分别达100.00%、50.00%和40.00%;盔形毕赤酵母（Pichia galeiformis）是夏黑A和刺葡萄B发酵前期的优势菌;在不同品种葡萄自然发酵中期均含有泽普林假丝酵母（Candida zemplinina）和盔形毕赤酵母;刺葡萄A、刺葡萄B和夏黑B发酵后期的优势菌为盔形毕赤酵母,所占比例分别为40.00%、55.56%和71.43%;酿酒酵母在夏黑A、玫瑰香和夏黑B发酵中期开始出现,直到发酵后期,均占有较大比例,分别为66.67%、42.86%和14.29%。初步葡萄酿酒发酵表明,酿酒酵母VMH-M042的酿酒性能（酒精度12.5%、总糖含量76.0 g/L、还原糖含量40.5 g/L、总酸含量5.6%）优良。【结论】福建地区不同品种葡萄分离得到的酵母菌资源丰富,区域性差异明显,特异性资源较多,其中酿酒酵母VMH-M042在葡萄酒发酵中表现出较优良的酿酒性能,可为南方葡萄酒酿制提供丰富的菌种资源和理论依据。     

中国马铃薯疮痂病病原菌16S rDNA的遗传多样性分析

 【目的】利用16S rDNA序列对来自中国8个省（区）的34株马铃薯疮痂病菌和15株参比菌株进行系统发育分析。【方法】采用链霉菌通用引物对34株测试菌株的基因组进行16S rDNA序列扩增，测序后在GenBank中进行BLASTn比对，选取同源性较高的菌株构建系统发育树。【结果】34个测试菌株均为链霉菌属，其中Streptomyces scabies 12株、S. galilaeus 8株、S. bobili 6株、S. turgidiscabies 1株、S. acidiscabies 1株、S. diastatochromogenes 2株、S. setonii 1株、S. enissocaesilis 3株。其中S. galilaeus、S. bobili和S. enissocaesilis等种均为新发现的疮痂病病原。对各菌株的分布分析发现，山东省的疮痂病菌有4种，内蒙古自治区和陕西省有3种，四川省、河北省和山西省均有2种，黑龙江省为1种。【结论】中国马铃薯疮痂病菌存在明显的遗传多样性，且分布较为复杂。     

中国马铃薯疮痂病菌的鉴定

 【目的】对采自中国10个省（区）的马铃薯疮痂病菌进行分子水平鉴定。【方法】采用结合生物学特性和16S rDNA序列特点的方法对获得的菌株进行分析。【结果】中国的Streptomyces scabies菌株与美国的S. scabies标准菌株ATCC 49173的16S rDNA序列同源性为100%，但中国的菌株不能以甘露醇为单一碳源，对10 IU·ml-1青霉素不敏感，能产生硫化氢。而中国的S. acidiscabies菌株与美国的S. acidiscabies标准菌株ATCC 49003的16S rDNA序列同源性为99.8%，但能以棉子糖为单一碳源，对苯酚（0.1%）和结晶紫（0.5 ?g·ml-1）敏感，不产生硫化氢。另有一种病原链霉菌与所知的链霉菌种均不能归为一类，可能为一个新种。【结论】研究结果表明造成中国马铃薯疮痂病的病原菌至少有3种，分别为S. scabies、S. acidiscabies和一个新种。     

肠艾美尔球虫单卵囊分离及ITS-1序列测定

[目的]建立一种有效的鉴定球虫种类分子生物学方法。[方法]采用单卵囊分离技术,分离肠艾美尔球虫。根据GenBank中发表的艾美尔属球虫18s和5.8srDNA序列,设计特异性引物,扩增内转录间隔区1（ITS-1）,PCR产物直接测序。[结果]成功地分离出肠艾美尔球虫,其卵囊扩增出434bp清晰条带,且最低能检测出27孢子化卵囊。[结论]该研究结果为球虫虫种及虫株的准确鉴定奠定了基础。     

银杏核糖体DNA内转录间隔序列初步分析

为研究银杏Ginkgo biloba种内核糖体DNA内转录间隔（ITS）区序列的多样性，以具有代表性的10个银杏嫩叶样本为材料，提取基因组DNA后用特异性引物进行PCR扩增，并直接测定其ITS区序列。结果表明，银杏ITS区（内含5．8S）总长度为1224～1226bp，其中ITS-1长度为821—823bp，5．8S长度为162bp，ITS-2长度为241bp。在全序列范围内，可变位点有28个，占总核苷酸的2．3％，但简约信息位点仅6个，变异量仅有0．5％。银杏的不同样本之间ITS区序列表现出高度一致。