第28期鸡胚原始生殖细胞的冷冻保存与体外培养研究

利用Ficoll密度梯度离心,提取鸡胚第28期(孵化132h)性腺中的原始生殖细胞(PGCs),用不同的冷冻保护液,对PGCs采用分离后直接冷冻保存和体外培养24h后冷冻保存2种方法,以筛选合适的冷冻保护体系。结果发现,分离提纯后直接进行冷冻保存的PGCs,存活率最高为(87.07±1.29)%;体外培养24h后进行冷冻的PGCs,存活率最高为(44.08±1.19)%。对复苏后的PGCs进行体外培养结果发现,分离提纯后直接进行冷冻的PGCs,在体外培养过程中具有形成细胞克隆的能力,且可传代和进行体外分化;而体外培养24h后进行冷冻的PGCs,复苏后在体外培养过程中不能形成细胞克隆,且在体外培养40h左右死亡。     

冷冻保护剂和平衡方法对鸡胚原始生殖细胞冷冻保存效果的影响

采用Ficoll密度梯度离心,提取第19期(孵化72h)和第28期(孵化132h)性腺中的原始生殖细胞(PGCs),应用不同的冷冻保护剂和平衡方法进行冷冻保存。PGCs解冻后用DMEM培养液进行体外培养,并采用苔盼蓝染色法鉴定复苏后PGCs的存活情况。结果表明：①从第19期或第28期性腺中获取的PGCs在同一种冷冻保护剂下,平衡方法对PGCs的存活率有显著或极显著影响,平衡方法1的冷冻保护效果优于平衡方法2。②采用相同的平衡方法,冷冻保护剂C的冻存效果与其他保护剂之间存在显著或极显著差异,冷冻保护剂E和F对PGCs的冻存效果次之,冷冻保护剂A、B和D对PGCs的冻存效果最差。复苏后PGCs进行体外培养．其存活时间与分离后PGCs直接培养相比未出现显著缩短现象。     

第28期鸡胚原始生殖细胞的分离培养

[目的]进一步优化生殖细胞（PGCs）细胞体外培养条件。[方法]从第28期（5．5d）鸡胚生殖嵴分离PGCs,将PGCs与性腺基质细胞共培养进行原代培养,比较2种培养温度和3种培养浓度对PGCs原代培养的影响,以及2种饲养层细胞对PGCs传代培养的影响,并通过倒置显微镜下形态学观察、碱性磷酸酶（AKP）和过碘酸希夫反应（PAS）染色方法鉴定PGCs。[结果]培养浓度为2．5×10^5个／ml和培养温度为37℃时PGCs增殖较多,不易分化,存活能力较强,以第2代鸡胚成纤维细胞作饲养层时传代培养效果较好,获得了PGCs增殖的未分化集落,为后期的细胞标记及移植研究提供了较多数量和较高活力的PGCs。[结论]获得了PGCs原代与传代培养较好的培芥体系,为禽类EG细胞系的建立和转基因研究奠定了基础。     

原始生殖细胞的人类胚胎干细胞克隆

取材于妊娠终止胚胎生殖腺或生殖嵴及其周围组织,用ＤＭＥＭ＋ＮＣＳ培养液体外培养,分离由人ＰＧＣｓ转化成的类ＥＳ细胞,并将其与同源胚胎成纤维细胞一起用胰蛋白酶＋ＥＤＴＡ的无钙镁ＰＢＳ液消化传代。在原代培养１２ｈ观察到胞体较大、边缘不整、贴壁分裂增殖的ＰＧＣｓ样细胞,４８ｈ后观察到２６处理密排列呈鸟巢状态的类ＥＳ细胞集落及集落团。第６ｄ传代成功,第１６ｄ传至第４代。结果表明,体外培养附值后胚胎能够建成     

鸡胚胎原始生殖细胞转染EGFP基因的研究

于鸡胚19期分离生殖嵴原始生殖细胞(PGCs),用于体外培养和传代扩增;对其第2代PGCs进行组织化学法鉴定,采用3种转染方法以增强型绿色荧光蛋白转染PGCs,并对电穿孔方法转染条件进行优化,荧光显微镜下计数细胞,分析PGCs转染效率,探讨有效的转染方法及其优化条件。结果表明:电穿孔方法可获得较高的转染效率,其最优化条件:电场强度为280 V,时间常数为60μs,质粒浓度为15μg.mL-1,转染后室温静置10 min。     

鸡胚原始生殖细胞的分离和鸡鸭嵌合体的制备研究

探索了 12～ 17期鸡胚血液中的原始生殖细胞 (PGCs)迁移数量变化规律 ,将其在液氮中冷冻保存。并以Fi coll密度梯度离心、MiniMACS磁气分离、滤膜 3种方法对PGCs进行分离 ,结果发现 ,12～ 17期血液中均有PGCs存在 ,13期达到高峰 (4 7 1± 10 5 )个·μL-1,在血液中比例为 0 0 12 6 %。冷冻保存 3个月后解冻成活率达 80 %以上。3种分离方法所得的分离效果分别为 95 7%、39 2 %、6 3 0 % ;纯度为 2 7 5 %、8 4%、3 1%。将分离的原始生殖细胞以微注射法转移至 14～ 15期麻鸭胚胎中制备了鸡鸭种间嵌合体 ,获得 8只雏鸭 (8/ 110 )。以鸡W特异性DNA探针原位杂交法在早期鸭胚性腺中检测到鸡原始生殖细胞 ,嵌合率达 84 2 % (16 / 19)。表明鸡原始生殖细胞能够迁移定居到鸭胚性腺中 ,并有可能增殖分化成有功能的配子     

鸡原始生殖细胞迁移和聚集规律的研究

研究表明：鸡的原始生殖细胞（ＰＧＣｓ）起源于孵化前胚盘的明区,而后逐渐迁移至胚体的头前侧部的生殖新月区,并于孵化约２２ｈ时,大量聚集于此（３１￣３８个）,随着鸡胚内,外血管的发育,ＰＧＣｓ则进入血管中,并顺着血管于孵化约３６ｈ（１０期）时首次迁移到胚体上。孵化至４４￣５２ｈ（１１￣１３期）时聚集（约１０５个）于胚体的心脏、大血管及头部间充质中。最后,ＰＧＣｓ于孵化６２ｈ（１７期）时大量迁移至胚体后     

鸡原始生殖细胞迁移和聚集规律的研究

研究表明 :鸡的原始生殖细胞 ( PGCs)起源于孵化前胚盘的明区 ,而后逐渐迁移至胚体的头前侧部的生殖新月区 ,并于孵化约 2 2 h时 ,大量聚集于此 ( 3 1～ 3 8个 )。随着鸡胚内、外血管的发育 ,PGCs则进入血管中 ,并顺着血管于孵化约 3 6h ( 1 0期 )时首次迁移到胚体上。孵化至 4 4～ 52 h ( 1 1～ 1 3期 )时聚集 (约 1 0 5个 )于胚体的心脏、大血管及头部间充质中。最后 ,PGCs于孵化 62 h( 1 7期 )时大量迁移至胚体后端生殖嵴处 ,迁移过程一直可持续到孵育第 4天。孵化 5d时 ,迁移入生殖嵴的 PGCs与生殖嵴一起共同组成了未分化的性腺     

牛原始生殖细胞的分离与培养

从4～15周龄的牛胎儿生殖嵴中分离得到牛原始生殖细胞,以STO(一种建系的小鼠胎儿成纤维细胞)及MEF(小鼠胎儿成纤维细胞)为饲养层抑制分化培养,其中1个细胞系传至4代。研究发现,STO较MEF更有利于牛类EG细胞的分离与培养,体长小于5cm的胎儿适合牛EG细胞分离与克隆。同时观察到这些细胞在体外进行自发性分化,可形成上皮样细胞、神经样细胞和成纤维样细胞。     

受体胚龄对鸡原始生殖细胞移植后归巢的影响

【目的】探究受体胚龄对鸡原始生殖细胞(Primordial germ cell,PGC)移植后归巢的影响,确定最佳回注时间窗口,为提高转基因鸡的生产效率提供参考依据。【方法】从广西黄羽鸡胚分离获得PGC,体外培养并进行转基因操作后,移植回注到不同胚龄的受体鸡胚中,移植5 d后分离性腺拍照观察,对比受体鸡胚孵育至14HH~17HH时对PGC迁移归巢到性腺的影响。【结果】分别在14HH~17HH胚龄时移植回注PGC,移植5 d后的鸡胚死亡率为30.0%~60.9%,但不同移植胚龄间的差异不显著(P>0.05)。根据鸡胚性腺中的GFP阳性细胞数可划分为6个等级(I~VI),且随着移植胚龄的增加,PGC迁移效率呈下降趋势。14HH胚龄移植的鸡胚性腺GFP阳性细胞集中在V级(40.0%),15HH胚龄移植的集中在III级(42.1%),16HH和17HH胚龄移植的则集中在II级(45.4%和54.5%),GFP阳性细胞含量最高等级(VI级)仅出现在14HH胚龄移植的鸡胚性腺中。【结论】随着受体胚龄的增加,PGC迁移效率呈下降趋势,但鉴于实际操作的难易程度,确定PGC移植回注的最佳时间窗口为14HH鸡胚(孵育50 h)。     

山羊胚胎原始生殖细胞的分离与培养

选择受精后30～50d的关中奶山羊胎儿为材料,参照小鼠原始生殖细胞(PGCs)分离得到了山羊的PGCs,将其分别培养在STO饲养层上,或与同源山羊成纤维细胞(GEF)及山羊睾丸支持细胞(GSCs)共培养。结果表明,3种方法均能获得类EG细胞。分离得到的类EG细胞在STO饲养层上仅传4代;培养在GEF上的效果最差,传至第3代时丢失;而在GSCs上培养的效果最好,可传6代。     

猪胚胎干细胞的分离培养

收集26-27d的猪胚胎分离原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)，培养在STO细胞饲养层上生长，形成EG细胞。EG细胞具有干细胞所具有的显著特性，形态，多能性和种系的延续，AKP染色阳性，并能在体外分化；分别将PGCs用三种不同的培养基培养，在形成EG细胞集落的数量和EG细胞分化上有着明显的差距，说明血清的质量和浓度以及细胞因子对干细胞的生成和增殖有着重要的作用。     

人类原始生殖细胞的体外培养

为了探讨人原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的体外分离培养条件及相关影响因素,以小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)作为饲养层,室温下用1．25 g／L胰蛋白酶+0．2 g／L EDTA消化人胚胎组织5～9 min,或用1 g／L胶原酶(IV型)消化20～40 min,分离得到PGCs,然后用不同培养液培养,从培养液角度较为系统的研究原代培养人原始生殖细胞的条件。结果表明,在KSR培养液(体积分数15％ Knockout serum replacement+高糖DMEM+10 ng／mL人重组白血病抑制因子(LIF)+4 ng／mL人重组碱性成纤维细胞生长因子+10 ng／mL Forskolin)和STO(建系的小鼠胚胎成纤维细胞)条件培养液中培养的原代人原始生殖细胞,有较高的克隆形成率;培养液中添加不同质量浓度的LIF对克隆形成率影响差异不大。     

小鼠原始生殖细胞迁移过程中H2A.Z的表达

小鼠原始生殖细胞(PGCs)迁移、增殖、性别分化都受着基因组和DNA表观遗传修饰的调控,H2A.Z与转录激活有关,可能与表观遗传修饰存在联系,通过PGCs单细胞及组织石蜡切片的免疫荧光方法进行研究。结果表明,PGCs在迁移过程中,8.5 dpc时PGCs中不存在H2A.Z;迁移至生殖嵴时H2A.Z主要集中于细胞核,11.5dpc整个PGCs细胞核和细胞质都存在;13.5 dpc雌性的卵母细胞中H2A.Z主要集中于细胞质,而精原细胞中H2A.Z偏向集中于细胞核。综合基因组和DNA表观遗传修饰分析,H2A.Z的表达与其有密不可分的联系。     

小鼠原始生殖细胞迁移过程中H2A.Z的表达

小鼠原始生殖细胞(PGCs)迁移、增殖、性别分化都受着基因组和DNA表观遗传修饰的调控,H2A.Z与转录激活有关,可能与表观遗传修饰存在联系,通过PGCs单细胞及组织石蜡切片的免疫荧光方法进行研究。结果表明,PGCs在迁移过程中,8.5 dpc时PGCs中不存在H2A.Z;迁移至生殖嵴时H2A.Z主要集中于细胞核,11.5dpc整个PGCs细胞核和细胞质都存在;13.5 dpc雌性的卵母细胞中H2A.Z主要集中于细胞质,而精原细胞中H2A.Z偏向集中于细胞核。综合基因组和DNA表观遗传修饰分析,H2A.Z的表达与其有密不可分的联系。     

昆明小鼠原始生殖细胞无血清培养基的筛选

【目的】筛选体外培养昆明小鼠原始生殖细胞(PGCs)的最佳无血清培养基,为昆明小鼠胚胎生殖细胞(EGCs)建系奠定基础。【方法】以妊娠8.5~12.5 d昆明小鼠PGCs为材料,采用无血清培养基,在培养基中添加不同组分,组成A、B、C、D、E、F、G 7种培养基,对昆明小鼠PGCs进行体外培养,分离培养胚胎原始生殖细胞,以筛选出其最佳培养基。【结果】D、E、F组均能得到较多的小鼠PGCs阳性集落。MEF-CM和GR-CM组的效果与细胞因子组相比差异不显著,但降低了培养基的成本。【结论】在无血清培养基中添加0.1 mmol/L RA或使用条件培养基MEF-CM和GR-CM,均有利于小鼠PGCs增殖。经过EGCs鉴定,本试验得到的细胞是PGCs,并且在各组培养基中均能够形成EGCs集落。     

自原始生殖细胞分离克隆小鼠ES细胞研究初报

自交配后 9.5～ 13.5 d小鼠胎儿生殖嵴 /腺或其类似物及周围组织 ,采用与其同源胎儿成纤维细胞共培养的方式分离克隆到具小鼠 ES细胞诸多特征的胚胎生殖细胞 ( EG细胞 )系。即具有连续传代的能力 ( 1例来自交配后 11.5 d胎儿类 ES细胞传至 10代 ) ,部分细胞集落呈典型鸟巢状结构 ,AP染色呈阳性 ,体外分化或延迟传代、堆叠培养具有分化形成类胚体、上皮细胞、成纤维细胞或神经细胞等的能力。同样培养交配后 7.5～ 8.5 d和14.5～ 15 .5 d的小鼠胎儿 ,原代观察到类 ES细胞集落 ,继代培养未观察到类 ES细胞集落 ,16 .5～ 18.5 d小鼠胎儿原代培养未观察到 ES样细胞集落