红景天甙体外诱导人肝癌QGY-7703细胞凋亡研究

【目的】探讨红景天甙(Salidroside)体外诱导人肝癌QGY-7703细胞凋亡的作用及其可能的机制。【方法】以体外培养的人肝癌QGY-7703细胞作为研究对象,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测红景天甙对QGY-7703细胞生长的抑制作用,采用吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)荧光双染、琼脂糖凝胶电泳及流式细胞术,分析红景天甙对QGY-7703细胞凋亡的诱导作用;采用Western blot免疫印迹法探讨红景天甙诱导QGY-7703细胞凋亡的可能机制。【结果】MTT比色法试验结果表明,0.01,0.1,1,10和100μg/mL红景天甙对QGY-7703细胞生长均有不同程度的抑制作用,细胞生长抑制率分别为13.2%,21.9%,31.4%,46.8%和60.9%,半数抑制质量浓度(IC50)为18.56μg/mL;用10μg/mL红景天甙处理QGY-7703细胞48 h,AO/EB荧光双染后,可观察到个别QGY-7703细胞呈现亮绿色或橘红色,表明细胞发生了凋亡;琼脂糖凝胶电泳结果显示,10μg/mL红景天甙作用QGY-7703细胞24,48和72 h均可导致细胞核内DNA产生有序断裂,形成DNA梯形带;流式细胞术试验结果表明,10μg/mL红景天甙的加入量为100和200μL时,QGY-7703细胞凋亡数分别为178和331个,相应的凋亡率分别为1.8%和3.5%,阴性对照组(10μg/mL红景天甙加入量为0μL)凋亡细胞数为105个,凋亡率仅为1.1%;Western blot免疫印迹分析结果表明,红景天甙下调了Bcl-2和PCNA蛋白的表达量,而使凋亡活化基因Bax与肿瘤抑制基因p53的蛋白表达量增高。【结论】红景天甙对体外培养的QGY-7703细胞具有明显的生长抑制作用和诱导凋亡作用,其诱导凋亡作用与Bcl-2家族成员、p53、Bax和PCNA基因调控有关。     

原花青素促进三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的作用机制研究

目的 研究原花青素（Procyanidins,PC）对三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞株增殖及细胞凋亡的作用及其机制。方法 常规培养细胞,24 h后随机分为阳性对照组、对照组和PC10、20、40、80、160、320 μg/mL组。MTT法检测细胞生长抑制率;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot法检测FoxA1蛋白及抗凋亡蛋白bcl2、UCP2表达。结果 PC各剂量组均可显著抑制抑制MDA-MB-231细胞增殖（P<0.05）;PC（10-160 μg/mL）组剂量依赖性抑制MDA-MB-231细胞增殖（P<0.05）,PC（40-320 μg/mL）可以时间依赖性抑制细胞增殖（P<0.05）;PC320 μg/mL组各时间点细胞抑制率与PC160 μg/mL组差异无显著性（P>0.05）;160 μg/mL PC可以时间依赖性促进MDA-MB-231细胞凋亡（P<0.05）;160 μg/mL PC作用24 h后,FoxA1蛋白表达显著上升（P<0.05）,同时bcl2及UCP2表达降低（P<0.05）。结论 PC抑制MDA-MB-231细胞,促进MDA-MB-231细胞凋亡,升高其FoxA1表达,同时降低bcl2及UCP2表达,表明PC可能通过促进FoxA1表达发挥促进MDA-MB-231细胞凋亡的作用。     

鬼针草水提物抗伪狂犬病毒作用研究

【目的】研究鬼针草水提物（BPE）的体外抗伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PrV）作用。【方法】制备640 mg/mL（以生药计）的BPE,检测其对仓鼠肾上皮细胞(BHK-21)的毒性（半数中毒浓度（TC₅₀））及对PrV体外抗性（半数抑制浓度（EC₅₀））和治疗指数（TI）。采用CCK-8法检测BPE抗PrV的机制。采用间接免疫荧光法检测BPE对gB蛋白表达和PrV所致细胞凋亡的影响,采用实时荧光定量PCR方法检测BPE对PrV gB基因表达的影响。【结果】BPE对BHK-21细胞的TC₅₀为28.7 mg/mL,对PrV的EC₅₀为5.16 mg/mL,TI为5.56。BPE抗PrV的机制为抑制PrV增殖和灭活PrV。BPE可抑制PrV诱导的BHK 21细胞凋亡,抑制PrV gB基因和蛋白的表达。【结论】BPE具有明显的体外抗PrV活性。     

牦牛CCL14蛋白对HepG2细胞活性和凋亡的影响

旨在研究牦牛CCL14蛋白（Bos grunniens C-C motif chemokine 14 protein, BgCCL14）对HepG2细胞的影响和作用机制。将原核表达的BgCCL14蛋白与HepG2细胞共培养，利用CCK-8试剂盒检测细胞活性，平板克隆检测细胞克隆形成能力，细胞划痕检测细胞迁移以及荧光定量PCR检测相关基因的表达量。结果表明，1 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL的BgCCL14蛋白均能显著降低HepG2细胞活性；20 μg/mL的BgCCL14蛋白对细胞增殖和迁移有极显著抑制作用；20 μg/mL的BgCCL14蛋白处理36 h极显著上调凋亡基因BAK和BAX 的mRNA水平，极显著降低 HIF1A、 PI3K和 CDK1基因的mRNA水平，显著降低mTOR基因 的mRNA水平。这表明BgCCL14蛋白可能通过促进细胞凋亡抑制肝癌细胞活性。     

纳他霉素纳米乳的制备及其体外抑菌效果研究

【目的】制备纳他霉素纳米乳(NATA-NE),测定其对白色念珠菌（Candida albicans）、青霉菌（Penicillium）和酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MFC）,以指导临床合理用药。【方法】综合纳米乳和纳他霉素的优势,将纳他霉素制成水包油型NATA-NE,以酮康唑和特比萘芬作为阳性药物对照,根据美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）制定的真菌体外药敏试验方法M27A和M-38P,测定药物对3种受试菌株的MIC,并研究了NATA-NE的杀菌效果。【结果】NATA-NE对青霉菌、白色念珠菌和酿酒酵母菌的MIC值为1,0.5,0.5 μg/mL;NATA原料药、酮康唑和特比萘芬对上述3种菌的MIC值分别为2,1,1 μg/mL;4,8,8 μg/mL和1,8,16 μg/mL,NATA-NE的MIC值均小于或等于其他3种药物。3种菌在2 μg/mL NATANE的作用下1.5 h后,均未见生长;NATA原料药则需要4 μg/mL、2 h才能达到同样效果,而酮康唑和特比萘芬分别需要16 μg/mL、4 h和32 μg/mL、4 h才能达到同样效果。【结论】临床使用NATA-NE治疗动物真菌病时,可适当降低给药剂量和用药次数,以降低成本和对动物不可预期的副作用。     

苦参碱逆转人结肠癌细胞株(HT-29)奥沙利铂耐药性的作用及机制研究

目的 研究苦参碱对结肠癌耐药细胞HT-29/奥沙利铂（Oxaliplatin,OXA）耐药性的逆转作用并探讨其可能的作用机制。方法 采用逐步增加药物浓度的方法建立奥沙利铂耐药结肠癌细胞株HT-29/OXA;CCK-8法测定苦参碱对HT-29/OXA细胞的耐药性逆转作用,流式细胞术检测细胞凋亡、周期变化;实时定量PCR检测各组细胞肺耐药蛋白（lung resistance protein LRP）和P-glycoprotein（P-gp）mRNA表达水平;Western blot检测各组细胞LRP和P-gp蛋白的表达水平。结果 苦参碱使HT-29/OXA细胞对奥沙利铂的敏感性增加,耐药性得到部分逆转。奥沙利铂（0.5 μg/mL）和苦参碱（3.0 μg/mL）单独用药对结肠癌耐药细胞株HT-29/OXA细胞周期以及细胞凋亡没有影响;联合用药对HT-29/OXA生长增殖具有明显抑制作用并且能够通过改变细胞周期引起凋亡（P<0.05）。奥沙利铂（0.5 μg/mL）和苦参碱（3.0 μg/mL）单独用药对HT-29/OXALRP和P-gp mRNA以及蛋白的表达没有影响;联合用药作用后LRP mRNA和P-gp mRNA表达水平降低（P<0.01）,同时下调了LRP和P-gp蛋白表达（P<0.01）。结论 苦参碱部分逆转HT-29/OXA细胞对奥沙利铂的耐药性,其机制可能与细胞内LRP和P-gp表达降低有关。     

阿尔泰瑞香提取物的体外抗炎及抗氧化活性

目的 探讨阿尔泰瑞香二氯甲烷提取物（Da-Dm）的体外抗炎及抗氧化活性。方法 以不同浓度（1、6、30 μg/mL）的Da-Dm作用于脂多糖（LPS,1 μg/mL）诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞,采用CCK-8法测定Da-Dm对细胞增殖的影响;Griess法检测细胞上清液中一氧化氮（NO）的释放量;ELISA法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）的分泌量。以维生素C为对照,采用FRAP法、DPPH法评价Da-Dm总抗氧化能力。结果 Da-Dm在浓度为30 μg/mL及以下时对RAW264.7细胞增殖没有影响。与LPS组比较,1~30 μg/mL的Da-Dm可明显降低LPS诱导的RAW264.7细胞分泌炎症因子NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的含量（P<0.05,P<0.01）,并呈现浓度依赖性。Da-Dm对DPPH自由基有较好的清除能力,其清除率的IC50为318.1 μg/mL,在FRAP实验中其对Fe²⁺离子具有较强的还原能力。结论 Da-Dm可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应,它的抗炎作用可能与抑制NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的释放有关。Da-Dm具有较好的抗氧化活性。     

β-伴大豆球蛋白对IPEC-J2细胞损伤的作用机制研究

【目的】研究β-伴大豆球蛋白通过核因子-κB(NF-κB)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、c-Jun N端激酶(JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路对猪肠上皮细胞（IPEC-J2）造成损伤的差异,为探索β-伴大豆球蛋白引发仔猪肠道黏膜损伤的分子机制提供理论依据。【方法】采用β-伴大豆球蛋白体外诱导IPEC-J2损伤,试验设对照组T0（猪肠上皮细胞不做处理）,试验组T1（加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白）、T2（加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白+1 μmol/L NF-κB抑制剂二硫氨基甲酸肽吡咯烷（PDTC））、T3（加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白+1 μmol/L iNOS抑制剂Nω-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME））、T4（加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白+1 μmol/L JNK抑制剂SP600125）和T5（加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白+1 μmol/L p38抑制剂SB202190）,处理24 h后观察细胞结构,测定各组细胞活性及细胞因子NO、TNF-α、IL-10、IFN-γ含量,细胞损伤相关基因NF-κB p65、iNOS、JNK、p38及其编码蛋白的表达水平。【结果】在IPEC-J2中加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白24 h后,细胞数量减少,线粒体改变,染色质边集,细胞活性显著下降（P<0.05）,NO、TNF-α、IFN-γ含量均极显著增加（P<0.01）,而IL-10含量极显著减少（P<0.01）,NF-κB p65、iNOS、JNK和p38-mRNA表达水平极显著升高（P<0.01）,NF-κB、iNOS、JNK、p38蛋白表达量极显著上升（P<0.01）;加入抑制剂后,细胞活性显著提高（P<0.05）,细胞结构趋于完整和规则,IL-10含量极显著增加（P<0.01）,而NO、TNF-α、IFN-γ含量极显著减少（P<0.01）,NF-κB p65、iNOS、JNK和p38-mRNA及其编码蛋白表达受到抑制。其中T2组细胞活性显著高于T3、T4、T5组（P<0.05）,细胞数量、形态和完整性最接近对照组细胞。【结论】β-伴大豆球蛋白主要通过NF-κB/iNOS信号通路对IPEC-J2造成损伤,PDTC对这种损伤作用的抑制效果最好。     

杜仲叶多糖的制备及其体外活性

【目的】分离制备杜仲叶多糖，研究其体外抗氧化和抗肿瘤活性，为杜仲叶多元化开发利用提供依据。【方法】以杜仲叶为原料，采用水提醇沉法制备杜仲叶粗多糖，以DEAE-52纤维柱色谱法进行分离纯化。测定多糖对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基、ABTS自由基的清除作用；采用MTT法、LDH法和流式细胞术，检测多糖对乳腺癌MCF-7细胞生长抑制和细胞周期的影响。【结果】水提醇沉法制备的杜仲叶粗多糖经DEAE-52柱分离纯化后得到EFPs-1、EFPs-2共2个组分，其多糖质量分数分别为75.8%和84.3%。EFPs 2个组分对各自由基体系的清除能力均呈现良好的剂量依赖关系，其中EFPs-2的作用比EFPs-1强。EFPs-1对DPPH自由基、超氧阴离子、羟基自由基和ABTS自由基的半数有效浓度（EC₅₀）分别为3.393，5.259，3.692和2.463 mg/mL，EFPs-2的EC₅₀值依次为2.379，2.893，2.516和2.066 mg/mL。EFPs 2个组分对MCF-7细胞均有一定的体外生长抑制作用，其半数抑制浓度（IC₅₀）分别是226.23 μg/mL（EFPs-1）和173.04 μg/mL（EFPs-2），其中EFPs-2可使MCF-7细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期。【结论】杜仲叶多糖具有良好的体外抗氧化和抑瘤活性。     

壳寡糖对黄曲霉毒素B1诱导大鼠肝细胞毒性损伤的干预作用

为了研究壳寡糖（COS）对黄曲霉毒素B1（AFB₁）诱导大鼠肝细胞（BRL 3A细胞）毒性损伤的干预作用。采用CCK-8法分别测定AFB₁对细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）和COS对细胞的无损害作用浓度；用试剂盒检测COS预处理细胞6 h后再加入AFB₁继续培养24 h的细胞存活率、活性氧（ROS）水平、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性和细胞凋亡率；通过Real-time quantitative PCR（RT-qPCR）测定Nrf2、Keap1、Ho-1、Nqo1、Bax和Bcl-2基因的mRNA相对表达量；最后通过RNA-seq研究分析差异表达基因的层次聚类和富集途径。结果：AFB₁对BRL 3A细胞的IC₅₀为15.86 μmol/L，COS浓度小于125 μmol/L时不会对细胞造成毒性损伤；COS可以缓解AFB₁引起的细胞内ROS水平和MDA含量升高，增强SOD和GST酶活性，进而提高细胞自身的抗氧化能力，降低细胞凋亡率；AFB₁可引起促凋亡基因Bax的显著表达（P<0.05），并显著降低Nrf2、Keap1、Ho-1、Nqo1的转录水平（P<0.05），而COS预处理则能显著提高Nrf2、Keap1、Ho-1、Nqo1基因的表达（P<0.05），显著降低Bax的表达水平（P<0.05）；在RNA-seq的富集途径结果中，COS还可能通过细胞色素P450对外源物质的代谢作用、药物代谢-细胞色素P450和p53信号通路途径来缓解AFB₁诱导的细胞毒性损伤（P<0.05）。结果表明：COS预处理对AFB₁诱导大鼠肝细胞的毒性损伤具有干预作用，其机制可能与Nrf2信号通路、细胞色素P450对外源物质的代谢作用、药物代谢-细胞色素P450和p53信号通路有关。     

gga-miRNA-155对MDCC-MSB1细胞增殖的影响

【目的】构建gga-miRNA-155前体基因(pre-gga-miRNA-155)真核表达载体,验证gga-miRNA-155在MDCC-MSB1细胞中的表达效果,探究其对MDCC-MSB1细胞增殖的影响。【方法】采用PCR方法从鸡肝脏基因组DNA中扩增gga-miRNA-155前体基因片段pre-gga-miRNA-155,并将其克隆入pMD-18T载体,构建克隆载体pMD-18T-pre-gga-miRNA-155。用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA真核表达载体和pMD-18T-pre-gga-miRNA-155,将pre-gga-miRNA-155酶切回收片段与pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA的酶切回收片段进行连接,构建重组真核表达载体pcDNA6.2-pre-gga-miRNA-155,对其进行PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及DNA测序鉴定。将重组载体转染到MDCC-MSB1细胞中,应用实时荧光定量PCR (Real-time PCR)检测gga-mi-RNA-155的表达水平,利用MTT法检测细胞增殖能力的变化。【结果】PCR扩增获得了长度约154bp的鸡pre-gga-mi-RNA-155基因。成功构建了pre-gga-miRNA-155的真核表达载体pcDNA6.2-pre-gga-miRNA-155,瞬时转染MD-CC-MSB1细胞后gga-miRNA-155表达水平显著增加,且MDCC-MSB1细胞的体外增殖能力增强。【结论】成功构建了pre-gga-miRNA-155的真核表达载体,其可在MDCC-MSB1细胞中过表达gga-miRNA-155,且可促进MDCC-MSB1细胞的体外增殖。     

BmNPV对家蚕BmN细胞周期及周期蛋白基因表达水平的影响

【目的】研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedroviruses,BmNPV)对家蚕卵巢细胞系(BmN)细胞周期及细胞周期蛋白基因转录水平的影响。【方法】用BmNPV感染家蚕BmN细胞,分别在病毒感染后的不同时间(12,24,36,48h),应用实时荧光定量PCR方法检测细胞周期蛋白基因CyclinA、CyclinB、CyclinE的表达情况,用流式细胞仪检测细胞周期的变化。【结果】BmNPV感染24h后,BmN细胞出现明显感染症状,变为圆形;48h后细胞核内出现多角体。随着感染时间的延长,CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均下降,分别在感染12,24,36h后,表达量降低为0。流式细胞仪检测结果显示,在BmNPV感染后24h左右,抑制于G2/M期的BmN细胞达到68%。【结论】BmNPV感染家蚕BmN细胞后,导致CyclinB、CyclinE基因表达量降低,对CyclinA基因表达量的影响较小;同时BmNPV感染可以将BmN细胞发育抑制于G2/M期。     

SIRT1基因对牛卵泡颗粒细胞增殖及细胞周期的影响

【目的】探讨沉默信息调节因子1(Silent information regulator1,SIRT1)对牛卵泡颗粒细胞增殖及细胞周期的影响。【方法】选取牛卵巢上直径2～6mm的卵泡,用注射器抽取卵泡中的颗粒细胞,进行体外培养。根据牛SIRT1基因的核苷酸序列,构建了4条干扰载体(shRNA-SIRT1-1597、shRNA-SIRT1-1471、shRNA-SIRT1-1186、shRNA-SIRT1-1306)及1条阴性对照载体(shRNA-NC),利用脂质体将质粒转入牛卵泡颗粒细胞,通过实时荧光定量PCR法筛选出干扰效果最佳的干扰载体用于后续试验。以转染shRNA-SIRT1-1471的颗粒细胞为干扰组,转染sh-RNA-NC的颗粒细胞为阴性对照组,不做处理的颗粒细胞为空白对照组,采用CCK-8法检测转染后24,36,48和60h各组颗粒细胞增殖情况,用流式细胞术检测转染后24,36和48h各组颗粒细胞的细胞周期变化情况。【结果】转染后48hshRNA-SIRT1-1471干扰的颗粒细胞SIRT1表达量显著低于其他处理组(P0.05),故选用shRNA-SIRT1-1471作为最佳干扰载体。转染后24,36,48和60h,干扰组颗粒细胞增殖效果显著高于空白对照组和阴性对照组(P0.05);转染后24～48h干扰组与空白对照组和阴性对照组相比G1期细胞比例显著降低,S期细胞比例显著升高,从而使更多细胞进入M期进行正常的有丝分裂,促进细胞增殖。【结论】SIRT1能抑制牛卵泡颗粒细胞的增殖,并阻滞细胞周期的进程。     

绵羊-绵羊和山羊-绵羊体细胞克隆胚的构建及体外发育研究

【目的】以绵羊卵母细胞为受体,构建绵羊-绵羊和山羊-绵羊体细胞克隆胚,比较其体外发育能力,探讨绵羊卵母细胞对异种体细胞核的再程序化能力。【方法】以体外成熟的绵羊卵母细胞为核受体,分别以绵羊及山羊胎儿成纤维细胞为核供体,经卵母细胞去核、注核、重构胚电融合、激活等一系列操作,构建同种绵羊-绵羊及异种山羊-绵羊体细胞的克隆胚,比较其体外发育能力。【结果】同种间克隆胚的囊胚发育率(16.0%)高于异种间克隆胚(7.4%)。异种间克隆胚在8-细胞到16-细胞及16-细胞到桑椹胚期间的发育能力显著低于同种间克隆胚。2种克隆胚在2-细胞到8-细胞期间的发育速度基本相同,但异种间克隆胚在8-细胞到囊胚期间的发育速度明显低于同种间克隆胚,两者相差12~24 h。【结论】绵羊卵母细胞对异种体细胞核具有再程序化能力,但这种再程序化能力明显低于其对同种体细胞核的再程序化能力。     

砷在铜藻中的亚细胞分布及细胞壁吸附作用研究

为揭示铜藻（Sargassum horneri）细胞壁在砷（As）生物吸附中的作用，以铜藻幼苗为研究对象，测定了不同As胁迫浓度（50、100、150、200、250 μmol·L^-1）下细胞亚组分中的As含量变化，并对细胞壁的吸附动力学、细胞壁多糖As吸附效果以及细胞壁多糖傅里叶红外光谱进行了分析研究。结果表明：在低浓度（50 μmol·L^-1） As胁迫时，50.0%的As分布于细胞壁，明显高于其他组分；而在高浓度（≥150 μmol·L^-1） As胁迫时，As优势分布由细胞壁转向细胞可溶组分，细胞壁中的As比例下降至36.4%~37.3%。随着As胁迫浓度升高，细胞壁As含量呈上升趋势，当As胁迫浓度超过100 μmol·L^-1时，细胞壁As含量上升趋于平缓。细胞壁吸附动力学实验表明酯化改性和甲基化改性可降低细胞壁As吸附的平衡容量，其降幅分别为68.5%和42.9%，同时细胞壁多糖红外光谱分析结果也表明羟基、氨基、羧基、硫酸盐基等官能团为细胞壁As吸附提供了结合位点。细胞壁多糖体外吸附实验表明随着多糖浓度的升高，多糖As吸附率呈上升趋势。研究表明铜藻细胞壁具有重要的As吸附能力，其中多糖官能团是细胞壁吸附As的关键因素，随多糖含量的升高细胞壁可吸附更多的As。     

类芦根细胞壁对铅的吸附固定机制

为探究类芦对Pb的耐性机制,采用对根细胞壁化学改性处理,测定Pb吸附动力学。结果表明,通过酯化改性去除部分羟基官能团后的根细胞壁对Pb~(2+)的吸附量相对降低了68.1%,其次为通过果胶酶改性去除部分果胶和通过甲基化改性去除部分氨基后的细胞壁,对Pb2+的吸附量相对降低48.9%与41.1%。利用傅里叶红外光谱分析,再结合FTIR图可得出,果胶提供的羟基基团、纤维素和半纤维素提供的羧基基团以及细胞壁蛋白提供的氨基官能团都是类芦固定Pb~(2+)的重要位点。研究表明,细胞壁组分中的羟基、羧基和氨基可以提供Pb结合位点,特别是羟基官能团可以使细胞壁对Pb具有较高的吸附固定能力,这也是类芦能够抵御Pb胁迫的一种重要机制。     

曼地亚红豆杉细胞悬浮培养体系的建立

【目的】建立曼地亚红豆杉的愈伤组织细胞悬浮培养体系,为紫杉醇生产提供参考。【方法】以曼地亚红豆杉幼茎诱导的愈伤组织为材料,以B5培养基为基本培养基,利用单因素试验或正交试验,研究愈伤组织接种量、蔗糖质量浓度、激素类型及配比和防褐化试剂对曼地亚红豆杉细胞生长的影响。【结果】曼地亚红豆杉细胞悬浮培养的最佳培养基和培养条件为:B5+2,4-D 0.6mg/L+NAA 0.8mg/L+KT 1.0mg/L+柠檬酸220mg/L+PVP350mg/L+水解乳蛋白450mg/L+蔗糖30g/L(pH=5.8),接种量0.1g/mL,在培养箱中110r/min、25℃暗培养。【结论】曼地亚红豆杉愈伤组织细胞在所建立的培养体系中经过多次继代后,生长状况良好,表明该细胞悬浮体系比较稳定,可以用于大规模培养红豆杉细胞。     

猪CDK9基因的克隆及其过表达对SUVEC细胞周期的影响

【目的】克隆猪细胞周期蛋白激酶9(CDK9)基因,观察该基因过表达对猪脐静脉血管内皮细胞(SU-VEC)周期的影响。【方法】采用电子克隆方法筛选得到猪CDK9基因全长序列,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析。利用RT-PCR方法从猪脾脏中扩增出包含完整开放读码框架(ORF)的CDK9 cDNA片段,将其与真核表达载体pEGFP-C1连接,构建重组真核表达载体pEGFP-CDK9。将pEGFP-CDK9以脂质体介导法转染至SUVEC细胞,采用绿色荧光标记和Western blot检测SUVEC细胞中CDK9基因的表达,用流式细胞仪检测转染CDK9基因后SUVEC细胞周期的变化。【结果】得到猪CDK9基因全长1820bp的cDNA序列,其ORF为1119bp,编码372个氨基酸;CDK9分子质量为42.76ku,等电点为9.04;CDK9基因定位于猪的1号染色体上。酶切和测序结果证明,重组真核表达载体pEGFP-CDK9构建成功。pEGFP-CDK9转染SUVEC细胞48h后,荧光显微镜和Western blot检测到目的基因序列在SUVEC细胞中成功表达;试验组各期SUVEC细胞比例与空载体组相比,差异无统计学意义(P0.05),细胞周期未发生显著变化。【结论】克隆了猪CDK9基因,并在SUVEC细胞中成功进行了表达。CDK9基因的过表达未引起细胞周期发生显著变化,其可能并不参与细胞周期的调控。     

茶树愈伤诱导及不同儿茶素含量细胞系筛选

茶树组织培养是开展茶树次生代谢及调控研究重要的研究平台。在建立茶树愈伤组织培养体系的基础上,开展了茶树含不同儿茶素含量的细胞系筛选方法的研究。结果表明,在H、S和B 3种诱导培养基中,只有B培养基适合于诱导生长迅速、组织疏松、质地均一且具有一定儿茶素合成能力的愈伤组织。从外植体方面考虑,种子诱导出的愈伤组织具有较强的植株再生能力;幼茎和叶片诱导出的愈伤组织,其生长速度快、组织疏松,但再生能力弱。在此基础上,采用目视法和二分法,结合HPLC分析,对B培养基诱导的细胞系“yunjing63Y”进行了筛选,得到含不同儿茶素含量的细胞系“yunjing63Y”和“yunjing63X”。分析结果显示,细胞系“yunjing63Y”和“yunjing63X”的儿茶素组分与鲜叶相似,且二者儿茶素含量（干重）差异较大,前者为7.77 mg·g^-1,后者为0.13 mg·g^-1。     

PPV感染PK-15细胞后对4种抗病毒细胞因子mRNA转录时相的影响

【目的】了解猪细小病毒(PPV)感染对抗病毒相关细胞因子mRNA转录时相的影响,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】对PPV感染PK-15细胞的病变进行了显微观察,运用荧光定量PCR技术,测定和分析PPV感染PK-15细胞后,细胞病毒DNA含量及巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)、转化生长因子β1(TGF-β1)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)和MURR1等细胞因子mRNA相对表达量的变化。【结果】PPV可以快速诱导PK-15细胞产生细胞病变。感染后1 h即可检测到PPV DNA,随着时间的延长,PPV DNA含量逐渐增加,并于48 h时达到峰值,相对含量为1 800左右。MIP-1α和PGK1 mRNA的相对表达量在感染后2 h显著增加,之后下降;TGF-β1 mRNA的相对表达量在72 h时显著增加;MURR1 mRNA的相对表达量在24 h时显著增加,48 h后下降。【结论】PPV感染可引起PK-15细胞抗病毒因子mRNA表达水平升高。